一种微流控芯片及其制备方法与结合两步微球竞争法在C-反应蛋白检测中的应用

摘要

本发明公开了一种微流控芯片及其制备方法与结合两步微球竞争法在C‑反应蛋白检测中的应用，该微流控芯片，包括位于顶部的PDMS芯片、中部的PDMS薄膜和底部的基板，所述PDMS芯片内设置有不同形状的微通道或微通道阵列、溶液出口和溶液进口，所述溶液进口位于微通道或微通道阵列起始端，所述溶液出口位于微通道或微通道阵列的末端，该微流控芯片可裸眼量化微球数量，直接读出微球数量。本发明所述的微流控芯片结合两步微球竞争法在C‑反应蛋白检测中的应用，可检测浓度范围为10pg/mL～100μg/mL的生物标记物的高精度量化；本发明所述检测方法操作简单便捷、成本低廉、检测精度高，具有很高的实用性和通用性。

说明书

技术领域

本发明属于血液检测技术领域，具体涉及一种微流控芯片及其制备方法与结合两步微球竞争法在C-反应蛋白检测中的应用。

背景技术

C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是由肝脏合成的一种急性时相反应蛋白，相对分子质量约为120000，是由5个相同的单体以非共价键构成的。CRP 作为全身性炎症反应早期检测的灵敏指标，已在临床许多疾病的诊断、治疗和预后中广泛应用。根据血清、血浆或全血中CRP的浓度水平，可以有效的判断有无感染、疾病的危险程度及疾病是否处于活动期。

目前关于CRP的传统检测方法包括：(1)单向免疫扩散法：单向免疫扩散法重复性好，不需要特殊仪器检测，但易出现假阴性，需稀释重检；(2)免疫比浊法：灵敏度为5.0mg/L，需要自动生化分析仪和自动化免疫测定仪等大型的仪器，耗时长且操作复杂，所需的样品量较大；(3)胶乳凝集法：灵敏度为1.0 mg/L，是一种半定量的检测方法，现在已很少使用；(4)化学发光法：该方法特异性强、线性范围宽，但其检测时间长、需要特定的环境和操作人员；(5) 放射免疫测定法：放射免疫测定灵敏度很高，为3μg/L，但存在有同位素污染等问题。此外还有基于免疫层析法的免疫层析试纸条。免疫层析试纸虽然携带方便，其灵敏度却不高，部分试纸也只能实现定性检测或半定量检测 (CN206235627U、CN201096787等)。

微流控芯片因其结构尺寸小、通量高、样品及试剂消耗小、分析速度快、成本低等优势在近些年迅速普及。微流控芯片的研究是目前分析仪器发展的前沿，用不同材料来加工微流控芯片的技术也在不断发展。传统的微流控芯片是以PDMS(Polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)或硅片为材料，在其上光刻各种微细的结构或是使用光刻和蚀刻的技术制造模板(CN1699984A、 CN203663854U等)。但是该技术需要的设备为昂贵的光刻机或激光雕刻，而且还需要使用光刻胶、显影剂等化学试剂，操作工艺繁琐复杂，光刻的过程会产生辐射，并且化学试剂对实验员的身体也有一定的危害，对实验室有一定的要求。

可视化作为一种简单、直接、快速的方法，已在许多平台上得到了发展。例如比色法是酶联免疫吸附测定(ELISA)中使用最广泛的方法之一，其利用简单直观的颜色变化来得到结果。但当前的可视化平台大多为定性结果，若要实现定量则需要其他的仪器和设备来检测(CN101017176A等)，在资源匮乏的地区很难实现。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种微流控芯片，该微流控芯片可裸眼量化微球数量，直接读出微球数量。

本发明的第二目的在于提供上述微流控芯片的制备方法，该微流控微球堆积芯片的加工方法经济性好、适应性强。

本发明的第三目的在于提供上述微流控芯片结合两步微球竞争法在C-反应蛋白检测中的应用。

本发明的首要目的通过下述技术方案实现：

一种微流控芯片，包括位于顶部的PDMS芯片、中部的PDMS薄膜和底部的基板，所述PDMS芯片内设置有不同形状的微通道或微通道阵列、溶液出口和溶液进口，所述溶液进口位于微通道或微通道阵列起始端，所述溶液出口位于微通道或微通道阵列的末端。

优选地，所述PDMS薄膜厚度小于微球直径，所述PDMS薄膜上设置有一个圆孔；所述微通道或微通道阵列与PDMS薄膜形成封闭通道，通道末端覆盖在圆孔之上形成开口；所述溶液出口位于PDMS薄膜的圆孔部分。

微流控芯片在工作过程中，通过从溶液进口注入溶液后，溶液只能经微通道或微通道阵列从开口处流向圆孔处的出口，在此过程中，而微球直径大于 PDMS薄膜厚度，无法被排出，因此从通道末端开始堆积，形成可视化堆积线；所述基板采用的材料为玻璃或硅片等。

本发明的第二目的通过下述技术方案实现：

一种微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：

(1)PMMA(Polymethyl methacrylate，聚甲基丙烯酸甲酯)阴模的制备：通过传统机加工方式(如数控加工中心)制备得到微通道或微通道阵列(其高度尺寸根据被堆积微球尺寸决定如12μm微球，可采用20μm以上宽度；其宽度尺寸至少应保证在100μm以上，以满足人眼可视化的要求)的PMMA阴模；

(2)PDMS阳模的制备：将PDMS浇注到步骤(1)得到的PMMA阴模上，抽真空使PDMS填满孔隙、不留气泡；进行烘干处理，使浇注到PMMA阴模中的PDMS固化成型，将PDMS从PMMA阴模中脱出得到有凸起的微通道或微通道阵列的PDMS阳模；

(3)将步骤(2)中得到的PDMS阳模用等离子清洗机处理后，通过使用 1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷进行化学气相沉积对其进行硅烷化，以便于后续PDMS之间的分离；

(4)微球堆积芯片的制备：将PDMS浇注到步骤(3)中硅烷化PDMS阳模上，抽真空使PDMS填满孔隙、不留气泡；进行烘干处理，使浇注到硅烷化 PDMS阳模上的PDMS固化成型，将PDMS脱出得到有微通道或微通道阵列的PDMS芯片；

(5)PDMS薄膜的制备：取一光滑的圆盘置于高速匀胶机中央，在圆盘中心滴加少量PDMS，根据被堆积微球尺寸设定离心参数(如对于12μm微球，可采用5800-6000RPM的转速，匀胶30分钟)，匀胶后PDMS均匀涂覆在圆盘表面，烘干后得到PDMS薄膜；

(6)在步骤(4)中所得到的有微通道或微通道阵列的PDMS芯片上进行打孔，设置溶液出入口；

(7)在步骤(5)中所得到的PDMS薄膜上进行打孔，得到带有圆孔的PDMS 薄膜；

(8)将步骤(6)设置有进出口和微通道或微通道阵列的PDMS芯片与步骤7)中得到的带有圆孔的PDMS薄膜用等离子清洗机处理后键合；

(9)将步骤(8)中与PDMS薄膜粘合后的PDMS芯片与基板玻片用等离子清洗机处理后键合，得到可裸眼量化微球数量的微流控微球堆积芯片。

其中，步骤(1)中的微通道或微通道阵列可以是任意形状、任意数量。

其中，步骤(2)、步骤(4)和步骤(5)的烘干温度均为70℃；步骤(2) 烘干时间为8h，步骤(4)为8h，步骤(5)为10h。

其中，步骤(3)、步骤(8)、步骤(9)中等离子清洗机处理的时间分别为 5～10min、1min、1min。

其中，步骤(5)的离心转速根据实际需求进行设定。

本发明的第三目的通过下述技术方案实现：

一种微流控芯片结合两步微球竞争法在C-反应蛋白检测中的应用。

优选地，所述的微流控芯片结合两步微球竞争法在C-反应蛋白检测中的应用，所述两步免疫微球竞争策略，具体包括以下步骤：

1)首先制备修饰有抗体的微球以及修饰有抗原的磁粒；

2)然后吸取包含有抗原的待检测样本与10％～90％体积的修饰有抗体的微球溶液混合培育反应；

3)再次往步骤2)中加入剩余的修饰有抗体的微球溶液并反应后，加入与微球溶液等体积的修饰有抗原磁粒并孵育；

4)最后磁分离步骤3)所获得的溶液去除结合有磁粒的免疫微球以及游离的纳米磁粒。

优选地，所述步骤2)中培育反应时间为45～60分钟；所述步骤3)中反应时间为45～60分钟，孵育时间为1.5～2小时。

优选地，所述微流控芯片在C-反应蛋白检测中的应用，具体为检测步骤如下：

步骤A.微球修饰抗体以及磁粒修饰抗原：将带羧基的微球与MES缓冲液混合均匀，与EDC和NHS活化反应后用PBS缓冲液清洗，重悬，加入抗体进行反应，再次用PBS缓冲液清洗后加入封闭液于4℃封闭过夜，之后重悬分散在 PBS缓冲液中；

步骤B.磁粒修饰抗原：将带羧基的Fe

步骤C.按上述两步免疫竞争策略孵育抗体修饰的微球、抗原修饰的磁粒以及待检测溶液；

步骤D.结合有游离抗原的微球复合物的捕获和堆积：步骤A完成后，吸取检测样本与微球-抗体混合孵育后将混匀样本注入微流控芯片溶液入口，溶液流经微通道后从出口处排出，微球则从通道末端开始堆积，形成可视条；

步骤E.数据读取：步骤B完成后，裸眼读取微球堆积长度，计算出所结合的抗原浓度，得到检测结果。

上述步骤中的具体参数可根据实际需求进行设定。

本发明相对于现有技术的优点如下：

(1)加工方法非光刻法，经济性好、制备简单、生产门槛低，成本低廉、检测精度高，具有很高的实用性和通用性；

(2)通过薄膜拦截微球并允许溶液流出，不仅实现了微球在芯片内堆积，还避免了芯片的封堵，具有很高的实用性；

(3)通过控制薄膜厚度可以方便的实现不同体积大小微球数量的量化，适用性广；

(4)在检测时无需其他复杂的设备，并能实现对待检样品中CRP浓度的裸眼定量，可肉眼直接观察结果；

(5)本发明通过采用两步免疫竞争策略，可在芯片内同时设置多个通道注入溶液实现多个生物标志物的检测，集成度高。

附图说明

图1为实施例1微流控微球堆积芯片示意图，其中，PDMS芯片-1、溶液进口-2、微通道-3、溶液出口-4、圆孔-5、PDMS薄膜-6、基板-7、可视条-8；

图2为实施例1微流控微球堆积芯片出口处横截面示意图；

图3为不同体积比下的两步免疫竞争策略对比；

图4为该芯片用于CRP检测的标定曲线。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：微流控芯片

图1所示为本实施例的微流控芯片，包括位于顶部的PDMS芯片1、中部的PDMS薄膜6和底部的基板7，所述PDMS芯片1内设置有不同形状的微通道3或微通道阵列、溶液出口4和溶液进口2，所述溶液进口2位于微通道3或微通道阵列起始端，所述溶液出口4位于微通道3或微通道阵列的末端；所述 PDMS薄膜厚度小于微球直径，所述PDMS薄膜上设置有一个圆孔；所述微通道3或微通道阵列与PDMS薄膜形成封闭通道，通道末端覆盖在圆孔之上形成开口；所述溶液出口4位于PDMS薄膜的圆孔部分。

微流控芯片在工作过程中，通过从溶液进口2注入溶液后，溶液只能经微通道3或微通道阵列从开口处流向圆孔处的出口，在此过程中，而微球直径大于PDMS薄膜厚度，无法被排出，因此从通道末端开始堆积，形成可视化堆积线；所述基板采用的材料为玻璃或硅片等。

实施例2：微流控芯片加工方法

本实施例提供了一种微流控芯片的加工方法。图1所示为本实施例的微流控芯片。所述微流控芯片如实施例1所示，包括PDMS芯片1、PDMS薄膜6 和基板玻片7；PDMS芯片1内设置有溶液进口2、微通道3和溶液出口4；PDMS 薄膜6内设置有圆孔5；微球堆积后形成可视条8。

本实施例中微流控芯片的制备步骤如下：

(1)通过传统机加工方法加工得到PMMA阴模，模板厚度为0.5cm，模板内设置有一条横截面边长为100μm、长度为2cm的微通道3；

(2)将PDMS(预聚物：交联剂为10:1；Sylgard-184；道康宁)浇注在PMMA 阴模上，放入真空泵内抽真空15～30min至无气泡后放入70℃烘箱烘干8h；烘干后剥离得到有凸起的微通道的PDMS阳模，模板厚度为0.5cm；将PDMS阳模用等离子清洗机处理5～10min后，在模板旁边滴加少量1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷(Sigma-Aldrich)于化学通风橱中过夜，使其均匀沉积在模板表面；

(3)将PDMS浇注在硅烷化后的PDMS阳模上，放入真空泵内抽真空15～30 min至无气泡后放入70℃烘箱烘干8h；烘干后剥离得到有微通道的PDMS芯片 1，芯片厚度为0.5cm，长度为2.5cm，宽度为0.8cm；在PDMS芯片的通道起始端打孔作为溶液进口2，在通道末端旁打孔作为溶液出口4，进口2与出口4 直径均为0.5mm；

(4)取一光滑的圆盘置于高速匀胶机中央，在圆盘中心滴加少量PDMS，设置转速为5800rpm，时间为10min；匀胶后PDMS均匀涂覆在圆盘表面，放入烘箱70℃烘干10h，烘干后得到PDMS薄膜6，其厚度小于5μm；在PDMS 薄膜上设置圆孔5，圆孔5直径为3.5mm；

(5)将设置好进出口的PDMS芯片1与PDMS薄膜6放入等离子清洗机中处理1min，其中PDMS芯片1的通道面为与PDMS薄膜6的粘合面。粘合后微通道3与PDMS薄膜6形成封闭通道，通道末端覆盖在圆孔5之上形成开口；之后将与薄膜6粘合的PDMS芯片1从圆盘上分离，与基板玻片7用等离子清洗机处理1min后粘合，其中与PDMS薄膜6粘合后PDMS芯片1的薄膜面为与基板玻片7的粘合面；得到可裸眼量化微球数量的微流控微球堆积芯片。

实施例3：

本发明进一步提供了一种可提高检测精度和检测限的两步免疫微球竞争策略，具体包括以下步骤：

1)首先制备修饰抗体的微球以及修饰抗原的磁粒；

2)然后吸取包含有抗原(游离状态)的待检测样本(如200μL)与20％体积(如2μL)的修饰有抗体的微球溶液混合培育反应(如45～60分钟)(第一步)；

3)再次往步骤2)中加入剩余80％体积(如8μL)的修饰有抗体的微球溶液并反应(如45～60分钟)后(第二步)，加入与微球溶液等体积的磁粒(如 10μL)并孵育(如1.5～2小时)；

4)最后磁分离步骤3)所获得的溶液去除结合有磁粒的免疫微球以及游离的纳米磁粒。

其中，步骤2)和步骤3)中加入修饰有抗体的微球的体积也可以分别是30％与70％或10％与90％或40％与60％。具体最优参数可根据实际需求进行优化。

实施例4：微流控芯片对CRP的检测

本实施例提供了一种基于实施例1所述的微流控芯片对CRP的检测，具体包括以下步骤：

步骤A.微球修饰抗体(PMPs@Anti-CRP)：将400μL带羧基的聚苯乙烯微球(直径为12μm；250mg/mL；赛尔群)与600μL的MES缓冲液 (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acidbuffer；0.5M；PH＝6.5；Macklin)混合均匀，与50mmol EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide；Aladdin) 和NHS(N-hydroxysuccinimide；Aladdin)活化反应30min后用PBS缓冲液 (phosphate-buffered saline；1X；PH＝7.4；Cytiva))清洗三次，离心(5000rpm， 1min)；重悬，加入20μL CRP抗体(Cloud-Clone Corp)避光反应4h，再次用PBS缓冲液清洗三次，离心去除上清液后加入1％的BSA溶液(bovine albumin；jetway)于4℃封闭过夜，之后重悬分散在200μL的PBS缓冲液中；

步骤B.磁粒的合成以及磁粒修饰抗原(MMPs@CRP)：将无水醋酸钠(1.2 g)、柠檬酸三钠(0.2g)和FeCl

步骤C.两步免疫竞争孵育：步骤A、B完成后，首先吸取检测样本200μL 与2μLPMPs@Anti-CRP反应1h后(第一步)，然后再次加入8μL PMPs@Anti-CRP反应1h(第二步)。反应完成之后，加入10μL MMPs@CRP 孵育2h。磁分离去除MMPs，取210μL上清液离心(5000rpm，1min)，弃去150μL上清液，剩余60μL溶液混合均匀；

步骤D.结合有抗原的微球-抗体复合物的捕获：步骤C完成后，将混匀样本注入微流控芯片溶液入口，溶液流经微通道后从出口处排出，微球则从通道末端开始堆积，形成可视条；

步骤E.数据读取：步骤B完成后，肉眼读取微球堆积长度，从而计算出所结合的抗原浓度，得到检测结果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。