血小板活化因子乙酰水解酶检测试剂在制备肺癌筛查试剂盒中的用途

摘要

本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及血小板活化因子乙酰水解酶血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)检测试剂在制备肺癌筛查试剂盒中的用途。本发明首次发现肺癌患者血浆外泌体中血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)水平显著高于肺部良性疾病患者和健康人群。本发明将检测血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的试剂用于制备肺癌筛查试剂盒，能够实现肺癌的有效筛查。

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)检测试剂在制备肺癌筛查试剂盒中的用途。

背景技术

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，目前发病率居世界首位，严重威胁着人类健康和生命。

肺癌是一种善于隐匿的疾病，经常在疾病发展到晚期才表现出临床症状，70～80％的肺癌患者在诊断出患有肺癌症状时已是中、晚期，癌细胞已经扩散，错过了最佳治愈时机，五年生存率低。对于早期的肺癌患者，经过及时治疗可大大提高患者的5年及以上生存率和生存质量。因此肺癌的早期诊断和进行有效的筛查至关重要。

肺癌的筛查，是指对那些没有肺癌相关症状的人群进行常规体检，在出现症状前及时发现肺癌。如果可以找到血浆里面的肺癌分子标志物，用于提示临床医生早期对患者采取相关的治疗措施或者决策具有重要的意义。

血小板活化因子(PLA)是一种内源性具有广泛生物活性的磷脂类介质，具有生理和病理双重作用。PLA是由体内的嗜酸性细胞、嗜碱性粒细胞、血小板、内皮细胞、白细胞、肺、肝和肾等多种细胞和器官，在受到特异性抗原刺激下合成并释放的。血小板活化因子(PLAF)通过与靶细胞膜上的PLA受体结合而发挥作用。可引起血小板聚集，中性粒细胞聚集和释放；产生大量活性氧、白三烯等炎性介质。与PLA生成过量有关的疾病有哮喘、败血性休克等。

血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)(Uniprot编号:Q13093)全称Platelet-activating factor acetylhydrolase，是血小板活化因子的主要降解酶，对血小板活化因子的代谢起着重要的调节作用。

目前尚未见血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)与肺癌相关的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的自身抗体类的肺癌标志物，以及该标志物的检测试剂在制备肺癌筛查试剂盒中的用途。

本发明的技术方案包括：

检测血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的试剂在制备肺癌筛查试剂盒中的用途。

如前述的用途，所述检测血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的试剂为酶联免疫吸附试验用试剂或联免疫分析试剂。

如前述的用途，所述检测血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的试剂为westernblot试剂。

如前述的用途，所述检测血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的试剂为蛋白芯片检测方法用试剂。

如前述的用途，所述检测血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的试剂是检测人血浆外泌体中血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的试剂。

一种肺癌筛查试剂盒，它包括用于检测血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的试剂。

如前述的试剂盒，所述检测血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的试剂为酶联免疫吸附试验用试剂或酶联免疫分析试剂。

如前述的试剂盒，所述检测血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的试剂为western blot试剂。

如前述的试剂盒，所述检测血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的试剂为蛋白芯片检测方法用试剂。

如前述的试剂盒，所述检测血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的试剂是检测人血浆外泌体中血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的试剂。

本发明的关键在于，确定了人体血浆外泌体中血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的含量与患肺癌的风险显著相关，因此可以通过检测人体血浆外泌体中血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的含量来判断患肺癌的风险，至于具体检测人体血浆外泌体中血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的手段，可以采用现有技术公开的各种手段，本发明实施例具体采用酶联免疫分析方法(蛋白芯片)进行检测，但不仅仅限于该手段，任何能够检测血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)含量的方法均可用于肺癌筛查。

本发明提供了一种新的肺癌筛查标记物和一种新的肺癌筛查试剂盒，能够实现肺癌的有效筛查；且能以血浆外泌体作为检测样品，对患者伤害很低。本发明具备良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：肺癌患者(LC)、肺部良性疾病(DC)、健康对照血浆外泌体中血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)水平对比。

图2：肺癌患者(LC)与肺部良性疾病(DC)ROC分析。

图3：肺癌患者(LC)与健康对照(NC)ROC分析

具体实施方式

实施例1血浆中血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)与肺癌的关系

一、临床资料

选取肺癌患者40例，肺部良性疾病(结核、错构瘤等非恶性肿瘤)40例，健康对照40例，基本信息如下：

二、检测原理

HuProt

三、方法

1、血浆外泌体蛋白的制备方法如下：

血浆样品从-80℃取出，在4℃，12000g条件下离心15分钟，上清液转移至新的离心管，0.22μM微孔滤膜过滤后，用市售外泌体纯化试剂盒参照说明书分离得到外泌体。加入终浓度为8M的Urea以及蛋白酶抑制剂超声裂解，既得外泌体蛋白，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。

2、血浆外泌体蛋白中血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的检测

本部分所用到的试剂如下：

1)复温：将芯片从-80℃冰箱取出，置于4℃冰箱复温半小时，然后置于室温复温15min；

2)封闭：复温后的芯片，固定14个blocks围栏，固定好之后，向每个block中加入封闭液，并放置侧摆摇床上，室温封闭3hr；

3)血浆外泌体蛋白样本孵育：封闭完成后，倒尽封闭液，然后迅速加入预先准备好的血浆外泌体蛋白孵育液，每张芯片可孵育14个血浆外泌体蛋白样本，每个血浆外泌体蛋白样本的上样体积为200μL，侧摆摇床20rpm，4℃过夜孵育(血浆外泌体蛋白样本先放在4℃层析柜冻融，加孵育液以1：50比例稀释，得血浆外泌体蛋白孵育液)；

4)清洗：将芯片及芯片围栏一同取出，吸去样本，然后迅速加入等体积的PBST，如此循环数次，保证在拆除芯片围栏时血清样本间无交叉污染。拆除芯片围栏后，将芯片置于加有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80rpm，清洗3次，每次10min；

5)二抗孵育：将芯片转移到加入了3mL二抗孵育液的孵育盒中，侧摆摇床40rpm，避光，室温1hr；

6)清洗：将芯片取出(注意不能触及或划破芯片的上表面)，置于加有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80rpm，清洗3次，每次10min。完成后用ddH2O清洗2次，每次10min；

7)干燥；

8)扫描：使用晶芯LuxScan 10K微阵列芯片扫描仪扫描；

9)数据提取：将对应GAL文件(记录了芯片中蛋白所在位置)打开，将芯片图像和GAL文件每个阵列整体对齐，按下自动对齐按钮，提取数据并保存。

四、结果

肺癌患者血浆中的血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的平均表达水平为1.35(蛋白相对定量比值)，肺部良性疾病血浆外泌体蛋白中血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的平均表达水平为0.89，健康对照外泌体蛋白中血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的平均表达水平为0.72。肺癌组与肺部良性疾病组(p<0.01)和健康对照(p<0.001)相比均有统计学意义(图1)。肺癌组与良性疾病的ROC分析结果特异性为97.5％，敏感性为15.0％(图2)；肺癌组与健康对照ROC分析结果特异性为97.5％，敏感性为17.5％(图3)；表明血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)可特异地区分肺癌与肺部良性疾病。

由以上结果可知，肺癌患者与非肺癌患者的血浆外泌体蛋白中血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的水平差异显著，通过检测血浆外泌体蛋白中血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的水平，能够达到肺癌筛查的目的。

实施例2本发明的检测试剂盒的组成及其使用方法

一、试剂盒组成

检测试剂盒(14人份)：

制备血浆外泌体蛋白的试剂需要自备，可以是市售血浆外泌体蛋白提取试剂盒。

二、试剂盒使用方法

同实施例1第三部分——“血浆外泌体蛋白中血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的检测”。

本发明的试剂盒可以通过检测血清中血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)的水平，可以筛查待检人群患肺癌的风险：若血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)水平高(相对于肺部良性疾病患者和健康人群而言)，则患肺癌的风险高，若血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)水平低，则患肺癌的风险低。可用于临床肺癌的辅助诊断，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

<120> 血小板活化因子乙酰水解酶检测试剂在制备肺癌筛查试剂盒中的用途

<130> GYKH1094-2020P0111922CC20JS035

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Ala Ser Leu Ala Phe Leu Gln Lys

1 5