在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法

摘要

本发明涉及一种在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法：a)设计带突变位点的引物A和与之紧邻的反向引物B；b)多聚核苷酸激酶分别磷酸化A和B的5'末端；c)选用无5'‑3'外切核酸酶活性且扩增产物3'端不带有“A”碱基的DNA聚合酶进行PCR扩增，将所得目的片段通过琼脂糖凝胶进行回收；d)DNA连接酶环化回收产物并转入感受态细胞，筛选突变质粒。本发明的优点在于，通过对引物5'末端进行磷酸化，提高线型突变体自身环化的效率；通过选择特殊DNA聚合酶，保证了扩增片段上突变位点的稳定性。本方法可实现在大于10kb的环状DNA大分子上稳定、高效地定点突变，并且能同时适用于甲基化和非甲基化的DNA模板，在11kb左右的质粒上单点突变阳性率高达87%以上。