一种鹿茸干细胞条件培养基在制备抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭药物中的应用

摘要

本发明公开了一种鹿茸干细胞条件培养基在制备抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭药物中的应用，属于三阴性乳腺癌细胞技术领域；通过对鹿茸干细胞条件培养基进行增殖、迁移和侵袭试验，发现其能够显著抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，从而抑制三阴性乳腺癌的转移，对三阴性乳腺癌的治疗提供了应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及三阴性乳腺癌细胞技术领域，特别是一种鹿茸干细胞条件培养基在制备抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭药物中的应用。

背景技术

根据美国2020年《CA-A CANCER JOURNAL FOR CLINICIANS》公布的数据显示，在2019年，乳腺癌已经是女性发病肿瘤的第一位，占30％，同样，根据中国癌症学会的调查报告，乳腺癌也已经成为当今中国女性发病率最高的恶性肿瘤。

根据乳腺癌细胞表面表达的受体不同将其分为雌激素受体阳性乳腺癌、孕激素受体阳性乳腺癌、HER-2阳性乳腺癌和三阴性乳腺癌四种。

因为乳腺癌的四种亚型已经被人们所发现，且由于其表面受体很容易被检测，所以医学上采用针对各个不同亚型靶向治疗的策略治疗乳腺癌。例如在治疗HER-2阳性的乳腺癌方面，已经开发出针对HER-2的靶向治疗药物，且已经取得了不错的疗效和良好的预后。发明中出现的MDA-MB-231乳腺癌细胞系就属于三阴性乳腺癌，由于其表面缺少雌激素受体、孕激素受体、HER-2这三种受体，故称为三阴性乳腺癌。而三阴性乳腺癌是乳腺癌亚型中浸润性最强，转移率最高的一种，因其表面缺乏受体表达，导致三阴性乳腺癌的靶向治疗和化疗的效率很低。现阶段对于三阴性乳腺癌的治疗策略还仍沿用传统的手术治疗和放疗，并没有有效的药物治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鹿茸干细胞条件培养基在制备抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭药物中的应用；该鹿茸干细胞条件培养基能够显著抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，从而抑制三阴性乳腺癌的转移。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种鹿茸干细胞条件培养基在制备抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭药物中的应用。

作为本申请的一些可实施方式，所述鹿茸干细胞条件培养基的培养系统为中空纤维培养系统。

作为本申请的一些可实施方式，所述鹿茸干细胞条件培养基中的有效成分为鹿茸干细胞外泌体。

本发明的有益效果是：

1.本发明首次使用鹿茸干细胞的条件培养液处理三阴性乳腺癌细胞，通过增殖实验、细胞划痕迁移实验和细胞侵袭实验发现，鹿茸干细胞的条件培养液能抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，从而抑制三阴性乳腺癌的转移，对三阴性乳腺癌的治疗提供了应用前景。

2.本发明使用中空纤维培养系统来培养鹿茸干细胞，细胞在FiberCell系统中培养时，循环培养基中的外泌体不会进入细胞生长的空间，并且该系统也易适用于无血清环境，或使用血清替代物(CDM-HD，FiberCell)培养，从而得到高纯度与高浓度的外泌体，从而增大有效物质的浓度，提高鹿茸干细胞条件培养基对三阴性乳腺癌细胞的抑制作用。

附图说明：

图1-1：鹿茸干细胞条件培养基影响MDA-MB-231细胞的增殖；增殖率用平均值SD来表示，n＝3；图中，*代表p<0.05，p-值由t-test获得；

图1-2：鹿茸干细胞条件培养基影响B16F10细胞的增殖；增殖率用平均值±SD来表示，n＝3；图中，*代表p<0.05，p-值由t-test获得；

图2-1：鹿茸干细胞条件培养基影响MDA-MB-231细胞的划痕迁移；

其中，A：MDA-MB-231/完全培养基(0h)；B：MDA-MB-231/鹿茸干细胞条件培养基(0h)；C：MDA-MB-231/完全培养基(24h)；D：MDA-MB-231/鹿茸干细胞条件培养基(24h)；比列尺：1mm；

图2-2：鹿茸干细胞条件培养基影响MDA-MB-231细胞的侵袭；

其中，A：未处理的MDA-MB-231细胞的代表性侵袭结果；B：鹿茸干细胞条件培养基处理的MDA-MB-231细胞的代表性侵袭结果。比列尺：0.2mm。C：细胞侵袭实验的数量统计结果；侵袭细胞数量在每次实验中按照随机选取五个高倍镜视野进行计数，并用平均值SD来表示，n＝3；图中*代表p<0.05，p-值由t-test获得；

图3-1：鹿茸干细胞条件培养基处理MDA-MB-231细胞前后差异表达基因的GO功能注释富集统计柱状图；

图3-2：鹿茸干细胞条件培养基处理MDA-MB-231细胞前后差异表达基因的KEGG功能注释富集统计柱状图；

图4-1：鹿茸干细胞条件培养基影响MDA-MB-231细胞中CDH1的表达量；

图4-2：鹿茸干细胞条件培养基影响MDA-MB-231细胞中SNAIL1的表达量；

其中，SNAIL1的相对表达水平用delta-delta CT法来计算，并用平均值±SD来表示，n＝3。

图中，***代表p<0.001，p-值由t-test获得；

图4-3：鹿茸干细胞条件培养基影响MDA-MB-231细胞中ZEB1的表达量；

其中，ZEB1的相对表达水平用delta-delta CT法来计算，并用平均值±SD来表示，n＝3；

图中，**代表p<0.01，p-值由t-test获得；

图4-4：鹿茸干细胞条件培养基影响MDA-MB-231细胞中TGFB1的表达量；

其中，TGFB1的相对表达水平用delta-delta CT法来计算，并用平均值±SD来表示，n＝3；

图中，**代表p<0.01，p-值由t-test获得；

图5：鹿茸干细胞条件培养基中的外泌体的电镜照片(图中红色箭头为外泌体)。

具体实施方式

下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

现有技术中，三阴性乳腺癌并没有有效的药物进行治疗，只能通过放疗和化疗的方式来治疗。

基于此，本发明提供了一种鹿茸干细胞条件培养基在制备抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭药物中的应用。

因鹿茸干细胞的调控作用，鹿茸能够快速生长而不癌变，因此本发明使用鹿茸干细胞的分泌物来降低三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的恶性化程度，从而达到治疗的目的，对三阴性乳腺癌的治疗提供了应用前景。

为了提高所述鹿茸干细胞条件培养基在制备抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭药物中的应用效果，作为本申请的一些可实施方式，对所述鹿茸干细胞培养基的有效成分进行了限定，即所述鹿茸干细胞条件培养基中的有效成分为鹿茸干细胞外泌体。本发明对鹿茸干细胞条件培养基是通过何种成分影响MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭的问题进行了实验，通过电子显微镜观察鹿茸干细胞条件培养基，发现其中含有大量外泌体，以此证明外泌体在抑制乳腺癌方面发挥了有效作用。

为了提高所述鹿茸干细胞条件培养基在制备抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭药物中的应用效果，作为本申请的一些可实施方式，对所述鹿茸干细胞条件培养基的培养系统作出了进一步限定，即述鹿茸干细胞条件培养基的培养系统为中空纤维培养系统。

中空纤维细胞培养系统是干细胞与293细胞等生产外泌体的理想反应器，由于鹿茸干细胞中的外泌体不能透过纤维，因此可收获高浓度的外泌体，且细胞碎片显著降低；同时外泌体还能长时间持续收获，保持活性不变；而使用培养瓶生产外泌体时，需加入血清，因而存在外源外泌体与蛋白杂质，最终产物需要纯化，操作不便且外泌体浓度低，对乳腺癌的抑制效果差；而细胞在FiberCell系统中培养时，循环培养基中的外泌体不会进入细胞生长的空间，并且该系统也易适用于无血清环境，或使用血清替代物(CDM-HD，FiberCell)培养，从而得到高纯度与高浓度的外泌体，有利于提高其对乳腺癌的抑制效果。

下面结合具体实施方式对本申请所述中草药组合物的制备进行更近一步地详细说明。

实施例1

将鹿茸干细胞通过中空纤维细胞培养系统进行培养，即得所述鹿茸干细胞条件培养基(即鹿茸干细胞的培养上清液)。

其后用电镜观察了鹿茸干细胞条件培养基中起作用的物质以及进行细胞CCK8增殖实验、细胞侵袭实验以及细胞划痕实验。

上述用电镜观察鹿茸干细胞条件培养基时，发现了外泌体，如图5所示。

上述三种实验的具体步骤及结果如下：

1.细胞CCK8增殖实验

本发明使用MDA-MB-231乳腺癌细胞作为实验对象，同时以骨髓间充质干细胞(BMSC)作为对照，进行了细胞CCK8增殖实验，实验结果如图1-1所示，具体实验步骤如下：

1)接种细胞：在96孔板内接种合适浓度的100μL的细胞悬液，放入培养箱培养24h。

2)换液：弃去原培养基，更换为新培养基或条件培养基，孵育24h。

3)加入CCK8：向每个孔中加入10μL CCK8溶液，孵育1-4h。

4)测定：测定每孔在波长为450nm的OD值。

实验结果表明，鹿茸干细胞条件培养基有效地抑制了MDA-MB-231细胞的增殖，而对骨髓间充质干细胞的增殖没有任何作用，说明鹿茸干细胞条件培养基对于不同类型细胞的增殖的影响具有一定的选择性。

本发明使用另一种癌细胞(B16F10黑色素瘤细胞)作为额外的对照实验对象进行了细胞CCK8增殖实验，如图1-2所示，实验结果表明，鹿茸干细胞条件培养基有效地抑制了B16F10细胞的增殖。

2.细胞划痕迁移

通过使用鹿茸干细胞条件培养基处理MDA-MB-231乳腺癌细胞，进行了细胞划痕迁移实验，实验结果如图图2-1所示，该图仅代表性地展示其中一次的实验结果，具体实验步骤如下：

1)灭菌：将所需的直尺、枪头等所需的器械灭菌，超净工作台紫外线消毒30min。

2)画线：6孔板背面画线5-6条。

3)接种细胞：每孔加入5x10

4)划痕：用1mL枪头垂直于孔板划线，从而制造细胞划痕。尽量保证各个划痕宽度一致。

5)处理：吸掉旧培养基，用无菌PBS冲洗细胞3次，去除被划下的细胞后，再加入低血清培养基，根据需要设加实验组和对照组。

6)培养：放入37℃ 5％二氧化碳培养箱中培养。按0和24h取样拍照。

根据三次生物学重复性细胞划痕迁移实验结果，发现鹿茸干细胞条件培养基抑制了MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移速率。

3.细胞侵袭实验

通过使用鹿茸干细胞条件培养基处理MDA-MB-231乳腺癌细胞，进行了细胞侵袭实验，实验结果如图图2-2所示，具体实验步骤如下：

1)铺基质胶：在4℃条件下将Matrigel胶用无血清的DMEM稀释，稀释比例为1:8，取100μL均匀涂抹于上室的膜表面，在37℃培养箱中放置1h，使其成为凝胶。

2)接种细胞：在24孔板下室加入600μL条件培养基，然后将带有Matrigel胶的上室用镊子放入下室内，取100μL细胞密度为1x10

3)细胞固定：取出小室，吸走培养基，用棉签轻轻擦拭基质胶和上室内的细胞，取新的24孔板加入多聚甲醛600μL，将小室放入其中固定30min。

4)细胞染色及计数：弃固定液，用0.1％结晶紫染色5-10min，PBS洗三遍，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将多余的结晶紫擦掉。适当晾干后，在高倍镜下随机选取五个视野观察细胞并计数。

根据三次独立的细胞侵袭实验结果，发现鹿茸干细胞条件培养基有效地减弱了MDA-MB-231乳腺癌细胞的侵袭能力。

通过以上实验得出鹿茸干细胞条件培养基能够抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖和迁移和侵袭，这对三阴性乳腺癌的治疗提供了应用前景。

此外，为探究细胞干细胞培养基对乳腺癌的抑制机制，本发明还测定了鹿茸干细胞条件培养基处理前后MDA-MB-231细胞的转录组的变化以及一些基因验证。

本发明采用RNAseq技术对鹿茸干细胞条件培养基处理MDA-MB-231乳腺癌细胞前后的转录组进行了测序分析。在测序结果的基础上，本发明主要针对细胞迁移和侵袭进行初步的、差异表达基因的GO(Gene Ontology)功能注释富集分析和KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)功能注释富集分析，并进一步围绕上皮-间充质转化(EMT)这一特殊的、与乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力的得失/增减密切相关的细胞过程进行初步的差异表达基因的分析与验证。

(1)GO功能注释富集分析

本发明用Blast2GO在NCBI NR数据库中进行Gene Ontology(GO)功能注释富集分析。所谓的GO功能注释，是生物学功能注释的一套标准词汇表术语(GO term)，将基因的功能分为三部分：基因执行的分子功能(Molecular Function)，基因所处的细胞组分(Cellular Component)，基因参与的生物学过程(Biological Process)。本发明通过测序得到的差异表达基因的GO功能注释富集分析结果如图所示(图3-1)。

图中的纵坐标为padj值，其通过t-test检验获得。横坐标为不同的GO功能注释

术语。MF：Molecular Function；CC：Cellular Component；BP：BiologicalProcess。

在GO功能注释富集统计柱状图中，本发明注意到了如下能够明显地展示出与迁移和侵袭密切相关的、差异表达基因的一些GO术语，其中包括“positive regulation ofcell migration”、“extracellular matrix”、“extracellular matrix organization”、“extracellular matrix component”、“mesenchyme development”、“cell-celljunction”、“wound healing”、“plasma membrane protein complex”、“actin binding”等。这个结果说明，在鹿茸干细胞条件培养基处理后，MDA-MB-231细胞内显著地出现了与细胞迁移和侵袭相关基因的差异表达，这也正好印证了前面的关于鹿茸干细胞条件培养基抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭的实验结果(图2-1，图2-2)。特别指出的是，上述这几条术语都或多或少地、潜在地与EMT相关。

另外，本发明还注意到了“growth factors binding”这种与细胞增殖密切相关的功能注释。这说明在鹿茸干细胞条件培养基处理后，MDA-MB-231细胞的与增殖相关的基因可能出现了差异表达。这似乎可以印证前述关于鹿茸干细胞条件培养基抑制MDA-MB-231细胞增殖的实验结果(图1-1)。

(2)4.2 KEGG功能注释富集分析

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系统分析基因功能的一个基因组信息数据库，它有助于研究者把基因及其表达信息作为一个整体网络进行研究。

KEGG-pathway是其中最常用的一种分析，包括图解的细胞生化过程如代谢、膜转运、信号传递、细胞周期等，还包括同系保守的子通路等信息；KEGG的另一个分析是LIGAND，包含关于化学物质、酶分子、酶反应等信息。KEGG可以免费获取。KEGG是进行生物体内代谢分析、代谢网络研究的强有力工具。

根据KEGG-pathway的分析结果(图3-2)，本发明注意到了如下几种pathways：“Cell adhension molecules(CAMs)”、“Pathways in cancer”、“Transcriptionalmisregulation in cancer”。这个结果说明，在鹿茸干细胞条件培养基处理后，MDA-MB-231细胞内显著地出现了与上述术语相关的差异表达基因，这也可能印证了前面的关于鹿茸干细胞条件培养基抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭的实验结果(图2-1，图2-2)。另外，这几条术语可能间接与EMT也有些关系。

本发明也发现了数条与代谢和细胞周期相关的pathways，它们可能与细胞增殖相关，诸如，“Glycerolipid metabolism”、“Glycosphingolipid biosynthesis-lacto andneolacto series”、“Ras signaling pathway”等。这说明在鹿茸干细胞条件培养基处理后，MDA-MB-231细胞的与增殖相关的基因可能出现了差异表达。这似乎也可以印证前述关于鹿茸干细胞条件培养基抑制MDA-MB-231细胞增殖的实验结果(图1-1)。

(3)几种EMT相关的差异表达基因的分析

本发明继续围绕EMT这一癌症转移相关的关键细胞过程，从鹿茸干细胞条件培养基处理MDA-MB-231细胞前后的转录组中，初步找寻差异表达基因，并对其差异表达水平进行定量验证，这是因为EMT与乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力的得失/增减密切相关。本发明从差异表达基因中筛选出了数个与EMT相关的关键基因(表1)。这些差异表达基因包含EMT的两类关键调节因子，一类是转录因子，如：ZEB1、SNAIL1等；另一类是细胞因子及其信号途径受体，如：TGFB1、TGFBR1等。同时，CDH1作为EMT的标志，也显著地发生了如预期那样的上调。

另外，MDA-MB-231乳腺癌细胞系和另一乳腺癌细胞系-MCF7是一对经典的研究EMT以及肿瘤细胞迁移和转移的研究对象。科学表明，向MCF7细胞系中加入TGFB可以诱导其发生EMT转化，从而加强其迁移和转移的能力。所以，本发明又对高转移的MDA-MB-231乳腺癌细胞与低转移的MCF7乳腺癌细胞进行了转录组的测序分析，并总结出一些EMT相关的差异表达的基因(表2)。而后，本发明又将鹿茸干细胞条件培养基处理过的MDA-MB-231细胞的、EMT相关差异表达基因与之对比。通过比对分析，本发明发现，鹿茸干细胞条件培养基影响MDA-MB-231的EMT相关基因的差异表达趋势与MCF7与MDA-MB-231对比的差异表达趋势部分相同。这个发现提示，鹿茸干细胞条件培养基处理可以使MDA-MB-231细胞EMT过程可能得到逆转有了其分子基础，这也就有助于部分地解释鹿茸干细胞条件培养基处理能够抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭的原因(图2-1，图2-2)。

表1鹿茸干细胞条件培养基影响MDA-MB-231细胞中几种EMT相关基因的差异表达(表中的padj值通过t-test检验获得)

表2低转移的MCF7乳腺癌细胞与高转移的MDA-MB-231乳腺癌的EMT相关基因的差异表达情况(表中的padj值通过t-test检验获得)

(4)鹿茸干细胞条件培养基处理MDA-MB-231细胞前后的几种EMT相关差异表达基因的RT-qPCR验证

从转录组的结果分析来看，在鹿茸干细胞条件培养基处理过的MDA-MB-231细胞中，一些与EMT相关的基因在表达量(即RNAseq中得到的counts)上确实发生了差异表达。为此，本发明最后设计了相关基因的引物并使用RT-qPCR技术来验证转录组测序分析中相关结果的真实性。CDH1表达的下调一般是作为发生EMT的最显著的标志。本发明首先对其进行了RT-qPCR验证，结果表明，在鹿茸干细胞条件培养基处理后的MDA-MB-231中，确实出现了CDH1表达上调的现象(图4-1)。这一结果提示，处理后的MDA-MB-231细胞的EMT程度可能发生了减弱，这也许就是其细胞迁移和侵袭能力下降的一个原因。

本发明接着选取了EMT过程中具有代表性的转录因子或细胞因子，即SNAIL1、ZEB1、TGFB1这三个差异表达基因，进行了RT-qPCR验证。结果表明，这三个基因在鹿茸干细胞条件培养基的影响下均发生了不同程度的下调(图4-2，图4-3，图4-4)。这一结果进一步提示，处理后的MDA-MB-231细胞的EMT程度可能发生了减弱，这也许又是其细胞迁移和侵袭能力下降的一个原因。

综上，本发明通过以上实验证明鹿茸干细胞条件培养基能够抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，对三阴性乳腺癌的治疗提供了应用前景。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。