植物提取组合物在制备治疗便秘、减肥产品上的应用

摘要

本申请公开了植物提取组合物在制备治疗便秘、减肥产品上的应用。该植物提取组合物以选自SEQ ID NO.1～12任一所示的氨基酸的麒麟菜肽为基础制得，不仅具有治疗便秘和减肥的作用，还能够排泄尿酸，溶解痛风石，润肠通便，利尿消肿，抑制糖吸收，控制血糖，改善胰岛素抵抗，益肾固精，补肾健脾，健胃消食，促进双歧杆菌生长，祛除湿气，强心安神，清热去火，降低血糖、血脂和血压，强肝利胆，分解酒精，解酒醒酒，美容淡斑，延缓衰老，滋阴养血，降低胆固醇，抗血栓形成，抗动脉粥样化，清理肠道毒素和体内营养垃圾，改善睡眠，促进肠道排泄。

说明书

技术领域

本申请涉及植物提取技术领域，尤其涉及植物提取组合物在制备治疗便秘、减肥产品上的应用。

背景技术

肥胖是指一定程度的明显超重与脂肪层过厚,是体内脂肪,尤其是甘油三酯积聚过多而导致的一种状态。由于食物摄入过多或机体代谢的改变而导致体内脂肪积聚过多造成体重过度增长并引起人体病理、生理改变或潜伏。肥胖会增加糖尿病、心血管病、高血压、高血脂、脂肪肝、多种肿瘤、代谢紊乱等疾病的危险性。采用荷叶、山楂、菊花、决明子等具有降脂减肥作用的药食同源中药材制作饮料,可以作为普通食品日常饮用。荷叶主要具有调脂减肥、抗氧化、抗衰老、抑菌的作用。山楂具有抗心肌缺血及灌注损伤,可促进消化酶分泌，调节肠胃功能。菊花具有抗菌、抗炎、降血脂、抗肿瘤、驱铅等药理作用。山楂、菊花配伍,可活血化瘀、通络降脂、改善微循环。决明子提取物具有较好的抗氧化作用,可改善脂肪肝引起的脂质过氧化损伤。山楂、决明子及其配伍可以减少脂肪在肝脏和肾脏的沉积,降低血脂水平,且配伍后效果更佳。莱菔子临床应用于治疗高血压、高血脂、湿疹、痰喘、腹胀等。沙棘可提高耐缺氧能力、降低血清胆固醇、抗衰老、抗辐射、抗病毒及增强免疫等。

便秘(constipation)是指大便次数减少，一般每周少于3次，伴排便困难、粪便干结。便秘是临床上常见的症状，多长期持续存在，症状扰人，影响生活质量，病因多样，以肠道疾病最为常见。“用含萝卜、茶叶等提取物的药物防治肠疾病和便秘[J]国外医药：植物药2005，第3期”公开了使用萝卜、茶叶、胡萝卜、无花果、洋葱、梅、杏等作为原料能够防治哺乳动物肠疾病和便秘，也可制成保健食品。

然而，现有技术中并无明显具有同时减肥和治疗便秘功效的植物提取物，针对此方面功效进行开发具有十分重要的意义。

发明内容

麒麟菜(Eucheuma)属于红藻门红藻纲(Rhodophceae)红翎菜科(So-lieriaceae)，是一种大型海洋经济藻类，在我国海南省和东南亚各国沿海广泛分布麒麟菜富含多糖类物质，76.99％为碳水化合物，富含矿物元素，钙含量达777.5mg/kg，是一种很好的钙补充剂，但维生素含量偏低。研究表明，麒麟菜多糖具有免疫调节、抗病毒和抗肿瘤等生理功能。海藻多糖的提取通常采用热水浸提法、物理破碎法、酶解法及复合法等。

本申请发明人创造性地发现，从麒麟菜中提取的糖蛋白，经过酶解和去糖基化，能够得到一类具有减肥和缓解便秘的麒麟菜肽，可以利用该麒麟菜肽制备一类植物提取组合物，不仅具有治疗便秘和减肥的作用，还能够排泄尿酸，溶解痛风石，润肠通便，利尿消肿，抑制糖吸收，控制血糖，改善胰岛素抵抗，益肾固精，补肾健脾，健胃消食，促进双歧杆菌生长，祛除湿气，强心安神，清热去火，降低血糖，降血脂，降血压，强肝利胆，分解酒精，解酒醒酒，保护肝脏，美容淡斑，延缓衰老，滋阴养血，降低胆固醇，抗血栓形成，抗动脉粥样化，清理肠道毒素和体内营养垃圾，改善睡眠，促进肠道排泄。

第一方面，本申请实施例公开了一种麒麟菜肽，选自SEQ ID NO.1～12任一所示的氨基酸的肽、肽盐及肽衍生物。

第二方面，一种麒麟菜肽混合物，包括SEQ ID NO.1和2所示的氨基酸的肽、肽盐及肽衍生物；

或者SEQ ID NO.3、4和5所示的氨基酸的肽、肽盐及肽衍生物；

或者SEQ ID NO.6、7和8所示的氨基酸的肽、肽盐及肽衍生物；

或者SEQ ID NO.9和10所示的氨基酸的肽、肽盐及肽衍生物；

或者SEQ ID NO.11和12所示的氨基酸的肽、肽盐及肽衍生物。

第三方面，本申请实施例公开了第一方面的麒麟菜肽或第二方面的麒麟菜肽混合物的制备方法，其包括：

制得麒麟菜粉末；

对所述粉末进行酸处理、过滤，收集滤液，依次得到第一固体物、第二固体物、第三固体物和第四固体物的步骤。

在本申请实施例中，所述制备方法包括将所述第二固体物用pH7.5的PBS缓冲液溶解，其中第二固体物的质量百分比为2.5wt％，同时加入第一酶制剂，第一酶制剂加入量不低于50000Unit/mL，水浴25℃反应2.5h，105℃处理10min，8000×g 4℃离心15min，取上清液进行截留分子量为10KD的超滤浓缩，取滤液，浓缩干燥，得到第三固体物；其中，第一酶制剂为溶葡球菌酶。

在本申请实施例中，所述制备方法包括将所述第三固体物用p7.5的PBS缓冲液溶解，其中第三固体物的质量百分比为1.25wt％，同时加入第二酶制剂，第二酶制剂的加入量不低于20000Unit/mL水浴35℃反应24h以上，105℃处理10min，8000×g 4℃离心15min，取上清液进行截留分子量为10KD的超滤浓缩，取滤液，浓缩干燥，得到第四固体物；其中，第二酶制剂包括不低于10000Unit/mL的纤维素酶和不低于20Unit/mL的糖苷内切酶F。

在本申请实施例中，所述第二酶制剂还包括不低于120Unit/mL的β-半乳糖苷酶、不低于12Unit/mL的β-N-乙酰氨基葡萄苷酶和不低于6000Unit/mL的果糖苷酶。

第四方面，本申请实施例公开了一种植物提取组合物，其包括第一方面所述的麒麟菜肽4.5～10.5wt％、2～8.5wt％酸樱桃汁、0.3～1.5wt％赤藓糖醇、1～5.5wt％L-阿拉伯糖、0.1～2.5wt％玉米须、0.15～1.5wt％桑叶、1～3.25wt％芡实、0.05～1.5wt％葵花盘、0.5～2.5wt％山楂、4.5～10.5wt％木瓜、1～3.5wt％白莲、0.5～5.5wt％菊苣、0.1～0.5wt％山栀、0.1～2.5wt％葛根、0.15～1.5wt％茯苓、2～6.5wt％芹菜籽、0.05～2.5wt％杜仲雄花和0.5～2.5wt％浒苔，余量为食品上可接受的辅料。

第四方面，本申请实施例公开了一种植物提取组合物，其包括第二方面所述的麒麟菜肽混合物4.5～10.5wt％、2～8.5wt％酸樱桃汁、0.3～1.5wt％赤藓糖醇、1～5.5wt％L-阿拉伯糖、0.1～2.5wt％玉米须、0.15～1.5wt％桑叶、1～3.25wt％芡实、0.05～1.5wt％葵花盘、0.5～2.5wt％山楂、4.5～10.5wt％木瓜、1～3.5wt％白莲、0.5～5.5wt％菊苣、0.1～0.5wt％山栀、0.1～2.5wt％葛根、0.15～1.5wt％茯苓、2～6.5wt％芹菜籽、0.05～2.5wt％杜仲雄花和0.5～2.5wt％浒苔，余量为食品上可接受的辅料。

在本申请实施例中，所述植物提取组合物包含第一方面所述的麒麟菜肽或第二方面所述的麒麟菜肽混合物的含量为4.5wt％。

第五方面，本申请实施例公开了第一方面所述的麒麟菜肽或第二方面所述的麒麟菜肽混合物在制备减肥或治疗便秘的植物提取组合物或药物中的应用。

与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：

本申请从麒麟菜中提取得的了一类去糖基化的肽类，通过体外实验证实了这些麒麟菜肽具有抗氧化和对二肽酰多肽酶IV抑制活性；并且通过细胞实验阐释了该麒麟菜肽对细胞无毒和抑制二肽酰多肽酶IV活性的作用机制。

进一步的，本申请还以麒麟菜肽和多达十几种组分组成的植物提取组合物，通过动物实验证实了其具有减肥和缓解便秘的作用。另外，本申请发明人在长期的临床试验中发现，该植物提取组合物不仅具有治疗便秘和减肥的作用，还能够排泄尿酸，溶解痛风石，润肠通便，利尿消肿，抑制糖吸收，控制血糖，改善胰岛素抵抗，益肾固精，补肾健脾，健胃消食，促进双歧杆菌生长，祛除湿气，强心安神，清热去火，降低血糖，降血脂，降血压，强肝利胆，分解酒精，解酒醒酒，保护肝脏，美容淡斑，延缓衰老，滋阴养血，降低胆固醇，抗血栓形成，抗动脉粥样化，清理肠道毒素和体内营养垃圾，改善睡眠，促进肠道排泄。

附图说明

图1为本申请实施例1～5提供的单糖HPLC检测结果图。

图2为本申请对比例1～5提供的单糖HPLC检测结果图。

图3为本申请动物实验提供的正常组(A)、模型组(B)、对照组(C)、试验组(供试品为实施例1提供)(D)的小鼠肝脏组织HE染色图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

本申请实施例提供的麒麟菜肽，是通过从麒麟菜中提取糖蛋白，再进行酶解和去糖基化得到的。具体过程如下详述。

一、麒麟菜肽的制备步骤

本步骤的实施例中，其包括获得干燥的麒麟菜粉末、对麒麟菜粉末进行酸处理、依次得到第一固体物、第二固体物、第三固体物和第四固体物的步骤，以及对第三固体物进行纯化得到麒麟菜肽的步骤。

1、获得干燥的麒麟菜粉末和对其进行酸处理

一个本步骤的实施例中，取洁净的干燥的麒麟菜(青岛巨晖国际物流有限公司)，研磨成粉；取粉状的麒麟菜多次经过pH＝3的盐酸溶液浸泡处理，过滤，收集合并的滤液。

2、依次得到第一固体物、第二固体物、第三固体物和第四固体物的步骤

本步骤的实施例中，其包括对上述步骤得到的滤液进行硫酸铵沉淀得到第一固体物、对第一固体物进行醇溶和离心得到第二固体物、对第二固体物进行第一酶解得到第三固体物、对第三固体物进行第二酶解得到第四固体物的步骤。

在实施例1的得到第一固体物步骤中，包括将滤液用碳酸氢钠调节pH值为4.5，同时加入按照料液比为1:6(g/mL)加入硫酸铵，搅拌过夜后，静置，去除上清，下层过滤后，收集第一固体物。

在对比例1的得到第一固体物步骤中，包括向滤液中加入按照料液比为1:6(g/mL)加入硫酸铵，搅拌过夜后，静置，去除上清，下层过滤后，收集第一固体物。

在实施例1的得到第二固体物步骤中，包括将实施例1得到的第一固体物用35％的乙醇溶液溶解液后，经过15000×g 4℃离心15min，得到第二固体物。

在对比例2的得到第二固体物步骤中，包括将实施例1得到的第一固体物用30％的乙醇溶液溶解液后，经过15000×g 4℃离心15min，得到第二固体物。

在对比例3的得到第二固体物步骤中，包括将实施例1得到的第一固体物用40％的乙醇溶液溶解液后，经过15000×g 4℃离心15min，得到第二固体物。

在实施例1的得到第三固体物步骤中，包括将实施例1得到的第二固体物用pH7.5的PBS缓冲液溶解，其中第二固体物的质量百分比为2.5wt％，同时加入第一酶制剂，第一酶制剂加入量不低于50000Unit/mL，水浴25℃反应2.5h，105℃处理10min，8000×g 4℃离心15min，取上清液采用超滤杯(DNC300国产杯式超滤器，超滤膜SARTORIUS14639-63-D PES，截留分子量10KD)对酶解液超滤浓缩，取滤液，浓缩干燥，得到第三固体物。其中，第一酶制剂为溶葡球菌酶(L9043，≥3000unit/mg，Sigma-Aldrich)。

在实施例2的得到第三固体物步骤中，其采用与实施例1相同的处理步骤对实施例1得到的第二固体物进行处理，不同之处在于其中使用了不同的第一酶制剂，第一酶制剂包括不低于30000Unit/mL的内-β-N-乙酰葡萄糖胺酶(A6805，≥80units/mg，Sigma-Aldrich)和不低于30000Unit/mL的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。

在实施例3的得到第三固体物步骤中，其采用与实施例1相同的处理步骤对实施例1得到的第二固体物进行处理，不同之处在于其中使用了不同的第一酶制剂，第一酶制剂包括不低于30000Unit/mL的内-β-N-乙酰葡萄糖胺酶(A6805，≥80units/mg，Sigma-Aldrich)和不低于15000Unit/mL的甘氨酰甘氨酸内肽酶。

在对比例4的得到第三固体物步骤中，其采用与实施例1相同的处理步骤对实施例1得到的第二固体物进行处理，不同之处在于其中使用了不同的第一酶制剂，第一酶制剂包括不低于50000Unit/mL的胃蛋白酶(10108057001，2500units/mg，Roche)和不低于15000Unit/mL的胰蛋白酶(T2600000，Sigma-Aldrich)。

在实施例4的得到第四固体物步骤中，包括将实施例1得到的第三固体物用p7.5的PBS缓冲液溶解，其中第三固体物的质量百分比为1.25wt％，同时加入第二酶制剂，第二酶制剂的加入量不低于20000Unit/mL水浴35℃反应24h以上，105℃处理10min，8000×g 4℃离心15min，取上清液采用超滤杯(DNC300国产杯式超滤器，超滤膜SARTORIUS 14639-63-DPES，截留分子量10KD)对酶解液超滤浓缩，取滤液，浓缩干燥，得到第四固体物。其中，第二酶制剂包括不低于10000Unit/mL的纤维素酶(C0615，≥5000units/g，Sigma-Aldrich)和不低于20Unit/mL糖苷内切酶F(E2264，≥30units/g，Sigma-Aldrich)。

在实施例5的得到第四固体物步骤中，包括将实施例1相同的处理步骤对实施例1得到的第三固体物进行处理，不同之处在于其中使用了不同的第二酶制剂，第二酶制剂包括不低于10000Unit/mL的纤维素酶、不低于20Unit/mL糖苷内切酶F、不低于120Unit/mLβ-半乳糖苷酶(G6920，≥140units/mg，Sigma-Aldrich)、不低于12Unit/mLβ-N-乙酰氨基葡萄苷酶(≥15units/mg protein，货号HZM9197，上海沪峥生物科技有限公司)和不低于6000Unit/mL果糖苷酶(≥200U/mg，CAS:9001-57-4，南京都莱生物技术有限公司)。

在对比例5的得到第四固体物步骤中，其采用与实施例1相同的处理步骤对实施例1得到的第三固体物进行处理，不同之处在于其中使用了不同的第二酶制剂，第二酶制剂包括不低于20Unit/mL糖苷内切酶F和不低于6000Unit/mL果糖苷酶。

3、对第三固体物进行纯化

在本步骤中，包括第四固体物进行凝胶色谱纯化和/或反相色谱纯化的步骤。

在一个凝胶色谱纯化步骤的实施例中，包括采用Sephadex G-50作为填料的高效凝胶色谱柱纯化第四固体物PolySe-GFC-P4000柱(7.8mm×300mm)，先用pH7.8的20mMTris-HCL缓冲液平衡凝胶柱，然后将第四固体物用该平衡缓冲液溶解成2.5g/mL，上样2mL，以0.15％的NaCL盐溶液水为流动相，流速0.5mL/min，检测器为紫外光吸收色谱，收集A260nm检测吸收值洗脱峰对应的洗脱液，每管1.5mL，采用20 100、14 400、7 823、5 856、3313Da的肽作为标准品进行Tricine-甘油SDS-PAGE检测，并采用凝胶成像系统对电泳图进行分析，以得出每一条带对应的组分在第四固体物中的含量(质量百分比)，具体可参照“黄缨等；SDS-PAGE检测猪圆环病毒疫苗抗原含量的比较试验[J].当代畜牧，2019年12月25公开”的方法进行。

在一个阴离子色谱纯化步骤的实施例中，包括收集上述凝胶色谱纯化得到的洗脱液，冷冻干燥后，用20mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液(A)溶解，0.22μm膜过滤，上样阴离子色谱柱(Hitrap Q)，上样后继续用20mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液洗至基线平稳，再用包含1.0MNaCL的20mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液(B)线性梯度洗脱，洗脱程序为0～7min，100％A；7～12min，0％～25％B；12～42min，65％B；42～47min，65％～100％B；47～49min，100％B。流速1mL/min，3min/管，收集洗脱峰，冷冻干燥，即为麒麟菜肽。

二、麒麟菜肽的鉴定

1、麒麟菜糖肽的氨基酸序列鉴定

将上述实施例1～5和对比例1～5制得的麒麟菜肽使用液相色谱-质谱联用法测定，采用高效液相色谱系统分析鉴定。利用C18柱(100μm×1℃m)，通过Thermo LTQ XL线性离子阱质谱分析仪进行分析，流动相A:水(0.1％三氟乙酸)；流动相B:乙睛(0.1％三氟乙酸)，上样量2μL，洗脱流速240μL/min。洗脱条件:0～10min，98％A；10～45min，98％～75％A；45～60min，75％～l0％A；60～69min，10％A；69～70min，10％～95％A；70～75min，95％～98％A；75～100min，98％A。具体的实验设置参数：碎片离子质量误差；±0.5Da；肽段母离子容差：±20ppm；蛋白酶:trypsin；最大未被酶切位点:1；固定修饰:半胱氨酸的碘乙酞胺化(+57Da)；可变修饰:甲硫氨酸氧化(+15.9Da)，Asn上G1cNAc标签(+203Da)、脱酞胺基(+0.98Da)；选择b、y系列离子搜索。

质谱结果用SEQUEST软件进行分析，SEQUEST软件中输出的两个主要的分值分别为Xcorr与DeltCn，用Xcorr(+1，+2，+3)分别大于1.9,2.5,3.75,De1tCn大于0.1的过滤条件去掉不正确的鉴定结果。对所得到的MS/MS图谱进行Mascot数据库检索，并结合NCBI数据库进行辅助分析。

2、麒麟菜肽的糖残基检测

(1)水解

取实施例1～5和对比例1～5分别得到的麒麟菜肽5mL，混入2M三氟乙酸充分搅拌后，封闭于120℃水解2h，水解完毕，冷却，溶液于40℃减压浓缩至干，加3mL甲醇蒸干，重复操作4～5次，以除尽三氟乙酸。

(2)柱前衍生及HPLC检测

分别取2mL的混合单糖标准液(各单糖质量浓度均为0.5g/L，葡萄糖(glu)、果糖(fru)、甘露糖(man)、半乳糖(gala)、鼠李糖(rha)、木糖(xyl)、阿拉伯糖(arab)、核糖(rib)和来苏糖(lyx)，Sigma)与2mL 0.6M NaOH溶液，置于10mL具塞试管中混合均匀；再取1mL的混合液于25mL具塞圆底烧瓶中，加1mL 0.5M的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮PMP甲醇溶液，混匀；在70℃烘箱中反应100min；取出放置10min冷却至室温；加1mL 0.3mol/L的HCl中和；加水至20mL，再加等体积的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，重复萃取3次。将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。水解后的样品用2mL水溶解，衍生化步骤同混合单糖标准液。

将经过衍生化的混合单糖标准液和样品液分别进行HPLC检测，HPLC条件为：Water2695-2996液相色谱系统(Waters，美国)；Sunfire C18色谱柱(Waters，美国)；柱温25℃；流动相为NaOH-KH2PO4缓冲液(pH6.7)(A相)和乙睛(B相)；洗脱程序：0～30min、15％B；30～60min,15～32％B；60～65min,32～20％B；上样量10μL；流速1mL/min；检测波长245nm。

三、结果

对实施例1～5和对比例1～5分别制得的第四固体物进行凝胶色谱纯化，收集A260nm检测吸收值洗脱峰对应的洗脱液进行SDS-PACE分析结果如图所示。可知，实施例1～5的分子量均在5000Da以下，条带清晰；而对比例1～3中得到的5000Da以下的肽含量较低(图中条带模糊)，对比例4和对比例5出现了大量的5000Da以上的条带。

进一步通过上述的阴离子色谱纯化，并对纯化的单组分质谱解析和含量检测，结果如表1所示，以分别得到第四固体物中的麒麟菜肽的氨基酸序列、其NCBI数据库中的参考序列以及其在第四固体物中的质量百分比。

表1

并对实施例1～5和对比例1～5分别的第四固体物进行水解，水解后采用1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化高效液相色谱法测定水解物中的单糖组成分析，结果如图1～2所示，实施例1～5提供的第四固体物中均未见有糖类成分检测，而对比例4和5均有不同含量的糖分检出。

一、体外抗氧化能力测定

1、DPPH自由基清除率的测定

用95v/v％乙醇溶液配制0.2mM DPPH溶液，取2mL置于试管中，加入2mL不同质量分数的实施例1～5和对比例1～5分别提供的麒麟菜肽的水溶液作为样品，旋涡混匀，室温下反应30min，在517nm波长处测其吸光度。计算DPPH自由基清除率：DPPH清除率％＝(1-(A1-A2)/A0×100％；式中A1为待测样品的吸光度，A2为95％乙醇溶液代替DPPH溶液的吸光度，A0为95％乙醇溶液代替样品的吸光度；并以此公式计算实施例1～5和对比例1～5分别提供的麒麟菜肽在DPPH清除率达到50％的浓度，即IC50值。

2、·OH清除率的测定

取不同浓度实施例1～5和对比例1～5分别提供的麒麟菜肽的水溶液样品2mL，加入2mL 6mM的FeSO

二、体外二肽酰多肽酶IV抑制活性

检测分为3组，每组重复3次，分别为测试组(麒麟肽+酶+底物+缓冲液)、阳性组(抑二肽素A+酶+底物+缓冲液)、阴性组(酶+底物+缓冲液)。首先将2500U/μL二肽酰多肽酶IV(DPPIV,D4943-1VL，Sigma-Aldrich)和0.2mM底物甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺(Gly-Pro-PNA，CAS103213-34-9，货号XY-SH-SJ-1446，上海烜雅)及麒麟肽的不同浓度水溶液分别在37℃下水浴30min，然后按照酶、缓冲液、底物的顺序依次加入96孔板中，加入量如下表2所示，每孔总体积为100μL。其中，阳性组的对照标准品为抑二肽素A(CAS:90614-48-5，北京百灵威科技有限公司)，浓度为100μM。

表2二肽酰多肽酶IV催化反应体系(μL)

计算二肽酰多肽酶IV抑制率％＝(A1-A0)/(A2-A0)×100％，式中，A1为测试组的吸光度，A2为阳性组吸光度，A0为阴性组吸光度；并以此公式计算实施例1～5和对比例1～5分别提供的麒麟菜肽在二肽酰多肽酶IV抑制率％达到50％的浓度，即IC50值。

三、结果

表3

由表3示出了实施例1～5和对比例1～5分别提供的麒麟菜肽的DPPH清除率的IC50、·OH清除率IC50和DPPIV酶抑制率的IC50，所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用SPSS13.0软件处理数据，并对每列数据进行多重比较和显著性差异标记；并且其中，“—”表示未检出。结果如表3所示，实施例1～5提供的麒麟菜肽对DPPH和·OH清除效果、以及对DPPIV酶的抑制效果均显著优于对比例1～3，而对比例4、5提供的麒麟菜肽并未检出对DPPH和·OH清除效果、以及对DPPIV酶的抑制效果。

一、材料与方法

1、细胞毒性试验

培养得到第10～25代Caco-2细胞(普诺赛)，细胞浓度为10

2、单层Caco-2细胞的DPP-IV酶抑制活性测定

将Caco-2细胞以5×10

BCA法测定蛋白质浓度:配制0.5mg/mL的蛋白标准液，稀释成浓度为0.1、0.5、2、5和10mg/mL的标准品，随后加入到96孔板中，每孔20μL。每个样品取4μL加入到96孔板中，再加入PBS补足到20μL。各孔加入200μLBCA工作液，37℃放置30min。用酶标仪测定吸光度(检测波长为562nm，并绘制标准曲线。

3、Caco-2细胞中RNA提取和DPP-IV酶基因表达分析

(1)siRNA干扰对照组

使用Lipofectamine2000和不含血清的DMEM培养基配置形成si-RNA-lipofectamine2000混合物，其中含DPP-IV siRNA(Thermo Fisher公司)的含量为4pmol。取出接种了Caco-2细胞的6孔板，用PBS清洗两次，再用不含血清的优化DMEM培养基清洗一次。吸弃清洗液，每孔加入不含血清DMEM培养基，再加0.5mL si-RNA-lipofectamine2000混合液，摇匀，37℃、5％CO

(2)基因表达分析

分别采用TRIZOl试剂盒(Thermo Fisher公司)提取干扰对照组和抑制实验组中Caco-2细胞RNA 1μL，加入1μL的Random primer和4μL无RNA酶水，65℃水浴5min之后，用冰水冷却2min后继续向反应管中加入1μL的RT Mix以及2×Reaction Buffer 10μL，确保总反应体系为20μL进行反转录反应，反应程序为25℃孵育10min后42℃再孵育30min，最终在85℃的条件下使酶失活。将所得的反转录产物cDNA进行PCR扩增，以β-actin为内参，扩增引物(上海生工生物技术有限公司合成)包括正向:ttgtggatagcaagcgagttg，反向cacagctattccgcacttgaa。反应体系包括:5μL

4、数据分析

所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用SPSS13.0软件处理数据，并对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。

二、结果

表4

分别用10mg/mL实施例1～5和对比例1～5分别提供的麒麟菜肽处理单层Caco-2细胞后，使用MTT试验确定单层Caco-2细胞的活力，结果如表4所示，实施例1～5和对比例1～3提供的麒麟菜肽的单层Caco-2细胞活力较高，而对比例4、5提供的麒麟菜肽单层Caco-2细胞活力较弱。由此提示，本申请实施例提供的麒麟菜肽无明显的细胞毒性。

表4还示出了10mg/mL实施例1～5和对比例1～5分别提供的麒麟菜肽处理单层Caco-2细胞中DPP-IV酶活性。由表4可知，实施例1～5分别提供的麒麟菜肽处理单层Caco-2细胞中DPP-IV酶活均相对于对照组显著降低，并且显著低于对比例1～5，由此说明本申请实施例提供的麒麟菜肽对单层Caco-2细胞中DPP-IV酶活具有更强的抑制作用。

表4还示出了经过干扰处理和经过实施例1～5和对比例1～3提供的麒麟菜肽处理的单层Caco-2细胞中DPP-IV酶转录水平。结果可知，干扰处理组的细胞中DPP-IV酶转录水平相对于对照组显著降低，而是实施例1～5和对比例1～3提供的麒麟菜肽对细胞中DPP-IV酶转录水平无限制抑制作用。由此说明，本申请实施例提供的麒麟菜肽对细胞DPP-IV酶转录无作用，其可能作用于对转录后的酶的功能发挥阶段。

基于上述实施例提供的麒麟菜肽，发现了其具有明显的抗氧化活性以及对DPPIV酶的抑制效果，提示其具有在降糖、减肥和治疗便秘方面中的应用。

为此，本申请实施例还提供了一种便秘、减肥组合物，包括上述实施例1～5提供的麒麟菜肽、酸樱桃汁、赤藓糖醇、L-阿拉伯糖、玉米须、桑叶、芡实、葵花盘、山楂、木瓜、白莲、菊苣、山栀、葛根、茯苓、芹菜籽、杜仲雄花和浒苔。

在本申请实施例中，酸樱桃汁的制备步骤一般包括：将干燥去核的的樱桃和白糖蒸煮至糖浆状态，过滤混合物，分离出所有的果汁，继续煮炖果汁成枫糖浆，凉至室温，并转移到密闭的容器中，放置冰箱中冷藏。

在本申请实施例中，赤藓糖醇、L-阿拉伯糖、玉米须、桑叶、芡实、葵花盘、山楂、木瓜、白莲、菊苣、山栀、葛根、茯苓、芹菜籽、杜仲雄花和浒苔均为市售可得，且均为固体原料，或者粉末状原料。

进一步第，本申请实施例提供了一种植物提取组合物，其包括上述实施例1～5提供的麒麟菜肽4.5～10.5wt％、2～8.5wt％酸樱桃汁、0.3～1.5wt％赤藓糖醇、1～5.5wt％L-阿拉伯糖、0.1～2.5wt％玉米须、0.15～1.5wt％桑叶、1～3.25wt％芡实、0.05～1.5wt％葵花盘、0.5～2.5wt％山楂、4.5～10.5wt％木瓜、1～3.5wt％白莲、0.5～5.5wt％菊苣、0.1～0.5wt％山栀、0.1～2.5wt％葛根、0.15～1.5wt％茯苓、2～6.5wt％芹菜籽、0.05～2.5wt％杜仲雄花和0.5～2.5wt％浒苔，余量为食品上可接受的辅料。

在本申请实施例中，“食品上可接受的辅料”包括甜味剂、调味剂、赋形剂和水。

在本申请实施例中，所述甜味剂选自莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、杜尔可甙A、杜尔可甙B、甜茶苷、甜叶菊、甜菊苷、罗汉果苷IV、罗汉果苷V、罗汉果甜味剂及它们的组合；

在本申请实施例中，所述调味剂选自α-紫罗兰酮、烯丙基-α-紫罗兰酮、环紫罗兰酮、脱氢二氢紫罗兰酮、二氢-α-紫罗兰酮、二氢-β-紫罗兰酮、二氢甲基-α-紫罗兰酮、二甲基紫罗兰酮、(E)-6,10-二甲基十一碳-5,9-二烯-2-酮、γ-紫罗兰酮、γ-甲基紫罗兰酮、紫罗兰酮、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、反式-β-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮环氧化物、γ-紫罗兰酮、α-鸢尾酮、异丁基紫罗兰酮、α-异甲基紫罗兰酮、β-异甲基紫罗兰酮、甲基紫罗兰酮、甲基-α-紫罗兰酮、α-甲基紫罗兰酮、甲基-β-紫罗兰酮、甲基-δ-紫罗兰酮、甲基-α-紫罗兰酮去水甘油酸酯、β-甲基紫罗兰酮二乙基缩酮、甲基异假性紫罗兰酮、假性甲基紫罗兰酮、3,4,5,6-四氢假性紫罗兰酮、假性紫罗兰酮覆盆子精、覆盆子籽提取物、茉莉净油、波罗尼花净油以及它们的混合物。

在本申请实施例中，所述赋形剂是指以成型、增量、稀释为目的，向片剂、散剂(粉药)、颗粒剂等固体制剂加入的添加剂，例如卡拉胶、糊精、乳糖和结晶纤维素等。

由此，本申请实施例还提供了上述植物提取组合物的制备方法，包括配方量的上述各组分加入适量蒸馏水，充分匀浆后，98℃保温10分钟，冷却至65℃，用碳酸氢钠调pH约7.0，保温搅拌约3h，然后冷却至室温后，喷雾干燥，得到该植物提取组合物。

一、材料与方法

1、实验动物及供试品

昆明小鼠，SPF级，9周龄，雄性，北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物于实验前适应性饲养1周。

为此，本申请实施例还提供了一种基于上述配方制得的植物提取组合物，其中均包含4.5wt％麒麟菜肽由实施例1～5和对比例1～5分别提供，其他组分的比例为8.5wt％酸樱桃汁、1.25wt％赤藓糖醇、3.5wt％L-阿拉伯糖、2.2wt％玉米须、0.6wt％桑叶、1.75wt％芡实、0.12wt％葵花盘、1.65wt％山楂、7.8wt％木瓜、2.6wt％白莲、3.6wt％菊苣、0.4wt％山栀、0.8wt％葛根、0.85wt％茯苓、4.5wt％芹菜籽、1.6wt％杜仲雄花、1.72wt％浒苔、1.35wt％甜叶菊、1.75wt％α-异甲基紫罗兰酮、1.42wt％β-异甲基紫罗兰酮、1.5wt％甲基紫罗兰酮、1.35wt％甲基-α-紫罗兰酮、18.5wt％糊精、24.5wt％卡拉胶和余量水。以作为本此动物实验的供试品。

2、便秘模型及分组实验

(1)造模

将每2天准确称取小鼠体重1次，以实时作为给药剂量的依据。将正常的KM小鼠正常饮食同时灌服复方地芬诺酷混悬液，剂量为10mg/kg体重，为每天1次，持续灌胃20天，根据小鼠粪便含水率和墨汁推进试验的结果，观察碳粉液灌胃后第一粒黑便排出所需要的时间(墨汁推进试验)以及粪便含水率可以定性判断小鼠肠蠕动功能、水分吸收功能及大便难易程度。

(2)分组实验

将连续灌服20天后的KM小鼠随机模型对照组，实验组和阳性对照组，另设未灌服小鼠作为正常组。实验组于每日9点灌服复方地芬诺酯混悬液的同时，于早上9点半灌服50mg/kg体重的供试品。阳性对照组以相同给予时间和给予剂量给予乳果糖。共给药28天。

(3)样本采集及处理

于给药28天采集小鼠粪便样本。

于给药28天取材，麻醉小鼠后，手术取腹主动脉，用肝素真空采血管采血10mL，4℃、3000rpm离心10min，-80℃保存，以作为小鼠血液样本。

于给药28天取材，麻醉小鼠后，手术取小鼠盲肠，剪取盲肠，冲洗，并并剔除肠管壁周围的脂肪组织。其中靠近盲肠的结肠组织2cm放于装有10％甲醛溶液的病理瓶中保存。其余4cm结肠组织的放入冻存管后放入液氮保存，随后转移到-80℃冰箱冷藏。

(4)提取RNA

将冻于液氮罐中的上述的结肠组织样本取出，剪取组织10mg左右，加入含200μLTridol的EP管内，用研磨器充分研磨后加入800μL Tridol，于冰上充分裂解30min。每个EP管加入200μL三氯甲烷，剧烈振荡l秒，混匀。12000g\4℃，离心15min。倒掉上清液，将液体吸取干净，加入7daro DEPC酒精1000μL后，7500g\4℃离心5min。离心后，倒掉上清液，保留白色沉淀物，真空抽干RNA沉淀，加入DEPC水10μL溶解RNA。血液样本参照此方法提取RNA。

(5)mRNA逆转录成cDNA

提取RNA后，取5μL用于逆转录；准备RNA/引物mix，10μL反应体系：5μL模板RNA和1μLRandom primer；程序:70℃、2min水浴至少2min；准备逆转录mix,10μL反应体系:2μL 5×Mmlv buffer；0.5μL dNTP mixture(10mm)；0.25μLRNase inhibitor(40u/μL)；0.25μL M-mlv(200u/μL)；1μL DEPC水；加入以上的反应液中，摇匀，程序:30℃,10min\42℃,60min\70℃，15min；4℃\水浴。

RT-PCR：准备定量PCR mix，20μL反应体系(PCR引物参考PCR引物列表):10μL SYBRGREEN(2×)；0.8μL PCR Forward Primers(10μM)；0.8μLPCR Reverse Primers(10μM)；0.4μLROX Reference Dye II(50×)；2μ模板(cDNA)；6μL RNase-free water。混匀，置于7500荧光定量PCR仪中，程序:50℃,2min→95℃,10min→95℃,15s,60℃,1min(40cycles)→95℃，15s→60℃,1min→95℃，30→60℃,15s。以β-actin作为内参基因，随后用标准化的2-△△CT计算目标基因的相对表达量。

所用引物序列为β-actin-F:cctcactgtccaccttcca,β-actin-R:gggtgtaaaacgcagctca；

zo-1-F:ctttgaccagtacccacga,zo-1-R:tcagaggaggaacaactgc；

Occludin-F:ctactcctccaacggcaa,Occludin-R:agtcatccacggacaagg；

Aqp3-F:ggaccctcatccttgtga,Aqp3-R:gtgacagcgaactccaaa；

Aqp8-F:tgagatcaaggggaagga,Aqp3-R:ccgatagacacccaatgaa.

(6)粪便菌群16SrDNA测序分析

采用hexadecyltrimethylammonium bromid(CTAB)对小鼠粪便样本的基因组DNA进行提取。使用Solexa测序技术进行测序，得到的下机数据(CRaw PE)拼接、质控及去嵌合体，使用琼脂糖凝胶电泳(胶浓度:2％，电压:80V，电泳时间:40min)测得DNA的纯度和浓度。根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物和高保真DNA聚合酶对选定的V3-V4可变区进行PCR扩增。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段进行切胶回收，胶回收采用凝胶回收试剂盒。参照电泳初步定量结果，对PCR扩增回收产物用蓝色荧光定量系统进行检测定量，按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。使用MEB Kext.UltraDKA Library Prep Kit建库试剂盒进行文库构建。构建好的文库通过AgilentBioanalyzer 2100和Qubit进行质检，文库质检合格后进行上机测序。

根据扩增的16S区域特点及测序平台，利用双末端测序(Paired-End,PE)方法，构建小片段文库后进行双末端测序。Reads拼接过滤后，对分类单元(Operational TaxonomicUnits,OTU)聚类，使用Venn图表分析各组物种特有的OTU和重叠的OTU。在多样性分析方面，使用。一多样性来评价单个样本内菌群构成的多样性，具体使用Shannon指数来评价。

(7)短链脂肪酸检测

取100μL的水(20％磷酸水)和500μL的4-甲基戊酸(IS)，加入2mL玻璃离心管中。将粪便样本悬液均质，在14000×g离心20分钟。取上清液1μL，采用Agilent 7890-5977GC-MS系统进行气相色谱一质谱分析。为定量检测短链脂肪酸，构建了0.1～100ug/ml浓度范围的校准曲线。IS用于校正样品之间的注射变异和仪器响应的微小变化。样品采用AgilentFFAP毛细管气相色谱柱(30m×0.25mm ID×0.25μm)分离。初始温度为100℃，以5℃/min的温度升高到160℃，再以5℃/min的温度升高到150℃，以80℃/min的温度升高到240℃，保持6min。载气为氦气(1.0mL/min)。在SIM模型下，进样口温度为260℃，离子源温度为230℃。

3、肥胖模型及减肥实验

(1)肥胖模型建立

实验分为正常组、模型组、对照组和实验组。除正常组和对照组外，给予其余各组小鼠高脂饲料(63.8％基础饲料++15％猪油++10％蔗糖+0.2％胆酸钠+10％蛋黄++1％胆固醇)饲喂，共饲喂7周，建立肥胖模型小鼠，每周称重1次，肥胖小鼠的体重要超过喂食正常饲料的小鼠20％以上，则示为建模成功。

正常组给予同给药组同体积的生理盐水水灌胃：对照组将肥胖小鼠给予2g/kg奥利司他分散于2mL生理盐水灌胃。模型组:肥胖小鼠给予同给药组同体积的生理盐水灌胃。实验组:肥胖小鼠给予2g/kg供试品溶解于2mL生理盐水灌胃。连续灌胃8周，期间以高脂饲料进行饲喂，8周后，称量体重，腹主动脉取血分离血清，常规处死后立即取肝脏、心脏、肾脏及体脂(肾周及附牟周围白色脂肪组织)称重并行后续实验。

(2)观察指标及测定

采用试剂盒(Abcam中国)检测小鼠血清中总胆固醇(TCH)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量，并根据体质量和体长计算Lee's指数。

脏器系数可以直观体现小鼠脂肪组织的质量，按脂肪贮藏部位，可将脂肪组织分为腹内脂肪、皮下脂肪和肌间隙脂肪组织等，脂肪组织在机体中主要承担能量储存的功能，为机体维持生存的必要组织，但当脂肪过量堆积就会造成机体亚健康。

总胆固醇(TCH)包括游离胆固醇和胆固醇酷，指血液中脂蛋白所含胆固醇的总量，总胆固醇主要在肝脏中进行合成并完成后续贮存，其在血清中的所占的量可以用来衡量脂代谢程度。

4、数据分析

所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用SPSS13.0软件处理数据，并对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。

二、结果

表5

表5示出了KM小鼠便秘实验各组的粪便样本中含水率以及碳粉液灌胃后第一粒黑便排出所需要的时间。由表5可知，模型组小鼠的含水率显著低于正常组，而第一粒黑便排出所需要的时间显著高于正常组，说明造模成功。而实验组中实施例1～5提供的供试品给予后小鼠粪便中含水率显著高于模型组，第一粒黑便排出所需要的时间显著低于正常组，说明书本申请实施例1～5以麒麟菜肽和多达十几种组分组成的植物提取组合物给予便秘小鼠后，其粪便有所改善，提示其具有缓解便秘的作用。

表5还示出了KM小鼠便秘实验各组的结肠组织中zo-1、Occludin、Aqp3和Aqp8基因的转录水平。由表5可知，模型组小鼠结肠组织中zo-1、Occludin、Aqp3和Aqp8基因的转录水平均显著高于正常组，而实验组中实施例1～5提供的供试品给予后小鼠结肠样本中zo-1、Occludin、Aqp3和Aqp8基因的转录水平均显著降低至与正常组相当。由此提示本申请实施例1～5以麒麟菜肽和多达十几种组分组成的植物提取组合物给予便秘小鼠后，能够下调紧密连接蛋白ZO-1和occludin两种蛋白，增加进入肠腔的水液电解质，同时下调水通道蛋白AQP3和AQP8表达，以减少肠上皮细胞从肠内容物吸收水分有关，从而达到达到增加肠溶物水分，缓解便秘的作用。

表6

表6示出了KM小鼠便秘实验各组的粪便样本中shannon指数、F/B比值和短链脂肪酸含量(mg/g)。由表6可知，模型组小鼠粪便样本中shannon指数、F/比值和短链脂肪酸含量均显著低于正常组，而实验组中实施例1～5提供的供试品给予后小鼠结肠样本中shannon指数、F/B比值和短链脂肪酸含量均显著升高至与正常组相当，甚至高于正常组。由此提示本申请实施例1～5以麒麟菜肽和多达十几种组分组成的植物提取组合物给予便秘小鼠后，能够调节小鼠肠道菌群的多样性，提供有益菌群的分布，同时提高了肠溶物的短链脂肪酸含量，提示了其在改善小鼠便秘中的作用机制。

表7示出了KM小鼠减肥实验各组血液样本中血脂水平。由表7可知，模型组小鼠粪便样本中血脂水平TCH、TG和LDL-C均显著高于正常组，而HDL-C显著低于正常；而实验组中实施例1～5提供的供试品给予后小鼠血液样本中TCH、TG和LDL-C显著降低，而HDL-C显著升高。由此提示本申请实施例1～5以麒麟菜肽和多达十几种组分组成的植物提取组合物给予肥胖小鼠后，能够调节小鼠血脂脂肪堆积，控制小鼠LDL-C和HDL-C的含量和比例，具有明显的减肥效果，并提高小鼠的健康状态。

另外，对各组小鼠的肝脏组织制作切片进行HE染色，结果发现本申请实施例1～5以麒麟菜肽和多达十几种组分组成的植物提取组合物给予肥胖小鼠后可有效预防脂肪肝、改善肝脏功能。

表7

综上所述，本申请从麒麟菜中提取得的了一类去糖基化的肽类，通过体外实验证实了这些麒麟菜肽具有抗氧化和对二肽酰多肽酶IV抑制活性；并且通过细胞实验阐释了该麒麟菜肽对细胞无毒和抑制二肽酰多肽酶IV活性的作用机制。

进一步的，本申请还以麒麟菜肽和多达十几种组分组成的植物提取组合物，通过动物实验证实了其具有减肥和缓解便秘的作用。另外，本申请发明人在长期的临床试验中发现，该植物提取组合物不仅具有治疗便秘和减肥的作用，还能够排泄尿酸，溶解痛风石，润肠通便，利尿消肿，抑制糖吸收，控制血糖，改善胰岛素抵抗，益肾固精，补肾健脾，健胃消食，促进双歧杆菌生长，祛除湿气，强心安神，清热去火，降低血糖，降血脂，降血压，强肝利胆，分解酒精，解酒醒酒，保护肝脏，美容淡斑，延缓衰老，滋阴养血，降低胆固醇，抗血栓形成，抗动脉粥样化，清理肠道毒素和体内营养垃圾，改善睡眠，促进肠道排泄。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 清枫链食苏打饮品（吉林）有限公司

<120> 植物提取组合物在制备治疗便秘、减肥产品上的应用

<141> 2022-04-29

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Ser Leu Gln Lys Phe Thr Phe Lys Ile Leu Trp Leu Glu Asn Asn

1 5 10 15

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Pro His Tyr Tyr Phe Ala Ile Ala Ser Lys Lys Phe Leu Val Asn

1 5 10 15

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Ser Ile Ile Ser His Ser Phe Asn Leu Val Phe Thr Ser Ile Ala

1 5 10 15

Asn

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Met Asp Lys Tyr Tyr Cys Leu Ile Gln Val Lys Thr Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 5

Met Cys Ile Cys Ile Asn Cys Gln His Val Arg Asn Cys

1 5 10

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 6

Met Leu Ile Phe Ile Thr Thr Pro Lys Pro Lys Phe Lys Asn Ile

1 5 10 15

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 7

Met Lys Asn Val Asn Lys Leu Thr Leu Glu Gln Glu Phe Lys Met Ala

1 5 10 15

Ile

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 8

Met Ile Leu Phe Phe Met Asn Ile Leu Leu Ser Asn Lys Trp Ile

1 5 10 15

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 9

Met Gln Asp Leu Asn Asn Ile Leu Glu Asn Asp Asp Tyr Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Leu

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 10

Met Lys Val Arg Pro Ser Val Lys Lys Ile Cys Glu Lys Cys

1 5 10

<210> 11

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 11

Met Leu Ile Phe Ile Thr Thr Pro Lys Pro Lys Phe Lys Asn Ile Lys

1 5 10 15

Tyr Lys Ile Thr Cys

20

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 12

Met Ser Gln Tyr Pro Ile Cys Ile Ser Ala Thr Ser Ser Gln Ile Leu

1 5 10 15

<210> 13

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 13

Gly Thr Met Gln Tyr Lys Gly Glu Gly Pro Ile Gly Phe Arg Gly Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly Ala Asn Asn Tyr Ala

20

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 14

Gly Val Asp His Ile His Ala Gly Thr Val Val

1 5 10

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 15

Gly Thr Val Val Gly Lys Leu Glu Gly Asp Pro Leu Met Ile

1 5 10

<210> 16

<211> 29

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 16

Gly Arg Val Val Tyr Glu Gly Leu Lys Gly Gly Leu Asp Phe Leu Lys

1 5 10 15

Asp Asp Glu Asn Ile Asn Ser Gln Pro Phe Met Arg Trp

20 25

<210> 17

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 17

Leu Glu Gly Asp Pro Leu Met Ile Arg Gly Phe Tyr Asn Thr Leu Leu

1 5 10 15

Leu Pro Tyr

<210> 18

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 18

Asn Ile Asn Ser Gln Pro Phe Met Arg Trp Lys Glu Arg Phe Leu Tyr

1 5 10 15

Ala Met Glu Gly Val Asn Arg Ser Ile Ala Ala Thr Gly Glu

20 25 30