一种可用于灰霉病防治的抑菌RNAhex及其灰霉病菌抑制剂

摘要

本发明提供一种可用于植物灰霉病防治的抑菌RNAhex分子及灰霉病菌抑制剂，其具有SEQ ID NO.1所示的RNA序列。本发明还提供一种灰霉病菌抑制剂，所述抑制剂中至少包含抑菌RNAhex分子。通过实验证明，添加本发明抑菌RNAhex分子的溶液能显著抑制灰霉病菌的孢子萌发、菌丝生长及其对植物的感染毒力，可用于植物灰霉病的防治。

说明书

技术领域

本发明涉及作物灰霉病的保护和治疗，具体涉及一种可用于灰霉病防治的抑菌RNAhex及其灰霉病菌抑制剂。

背景技术

引起植物灰霉病的病原菌是灰葡萄孢（

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种可用于灰霉病防治的抑菌RNA分子，命名为RNAhex，其具有SEQ ID NO.1所示的RNA序列:

SEQ ID NO.1：

GGCUAGAGAUAAUCAACAAUCACCGGUAGAUGCCUUUUGCCUUGAGCAUCAAUUUCUACCCUACUCUCCGGAGUAGGGUAGAAAUUGAUGCUCAAGGCUUUUGGAUUCGAGUUUGUUUGCUCAACAACAACAAUCACCGGUAGAUGCCUUUUGCCUGUCUUAUUCUCAUCGUCGUGUCCCUCCGGGGACACGACGAUGAGAAUAAGACAGGCUUUUGCCAUCCGGCAUACUUGUUCAUCUACAACAAUCACCGGUAGAUGCCUUUUGCCUAUUUGACGAUAUCGCACCAUCAACGCAAGUUGAUGGUGCGAUAUCGUCAAAUAGGCUUUUGGCGCCGCAUCUCGAUGGUCAGAAUCAACAAUCACCGGUAGAUGCCUUUUGCCAACAGAAGCAACAACAUCCAAGCUCUUCGGAGCUUGGAUGUUGUUGCUUCUGUUGGCUUUUGGCCCAAGGAGAAGGUGCUGAUUGACAACAAUCACCGGUAGAUGCCUUUUGCCUCGAACAUUCUUAAGAUCCUUCGACGCAAGUCGAAGGAUCUUAAGAAUGUUCGAGGCUUUUGGUGACGGUGCAUGCUAAUCCGCUUCAAAACAGGUGAUUGAAGCGGAUUAGCAUGCACCGUCACCUUUUGGCAUCUACCGGUGAUUGUUGUCAAUCAGCACCUUCUCCUUGGGCCUUUUGGCAUCUACCGGUGAUUGUUGAUUCUGACCAUCGAGAUGCGGCGCCUUUUGGCAUCUACCGGUGAUUGUUGUAGAUGAACAAGUAUGCCGGAUGGCUUUUGGCAUCUACCGGUGAUUGUUGUUGUUGAGCAAACAAACUCGAAUCCUUUUGGCAUCUACCGGUGAUUGUUGAUUAUCUCUAGCAUCUACCGGUGACUUUUGGCAUCUACCGGAACACCUGACCGGUAGAUGCCUUUUGCCUUGAACAUCAGAACGAGGGCGACCCUCCGGGGUCGCCCUCGUUCUGAUGUUCAAGGCUUUUGUCACCGGUAGAUG。

本发明的另一个目的在于提供一种作物灰霉病菌抑制剂，所述抑制剂中至少包含RNAhex分子。

本发明所述RNA分子可抑制的病菌至少包括灰霉病菌，及其同属病菌。

在某些实施例中，所述抑制剂为包含所述RNAhex的喷雾剂，通过喷雾来实现对灰霉病菌的有效预防和治疗。

本发明的有益效果主要体现在：

1．添加RNAhex的溶液能显著抑制灰霉病菌的孢子萌发、菌丝生长及其对植物的感染毒力，可用于灰霉病的防治。

2．灰霉病菌抑制剂是基于SIGS技术防治作物病害，其主要优势在于RNA作为抑菌因子，具有环境友好、专一性强、抑菌效果良好等特性，是未来农药发展的主要方向之一。

附图说明

图1：RNAhex对灰霉病菌孢子萌发的影响；

图2：RNAhex对灰霉病菌菌丝生长的抑制效果；

图3：RNAhex在番茄、烟草和拟南芥叶片上对灰霉病菌感染的防治效果。

具体实施方式

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种可用于灰霉病菌防治的抑菌RNAhex及其灰霉病菌抑制剂的制备，包括以下步骤：

1．编码RNAhex的DNA模板的合成：根据本发明提供的RNAhex的序列，推导出其编码的DNA模板序列，在模板序列上游插入T7启动子序列，将这条编码RNAhex的模板DNA序列送生物公司进行化学合成获得。

2. RNAhex的体外转录合成：利用T7 RNA 体外转录试剂盒，按照操作说明获得RNAhex，将其稀释成100 ng/μL，用于灰霉病菌的防治实验。

对比例1：基于灰霉病菌的DCL基因序列设计上下游引物（F1/R1），然后分别在引物两端加入T7启动子序列，得到T7_F1/T7_R1。最后以灰霉病菌cDNA为模板，分别以T7_F1/R1和F1/T7_R1为引物扩增目的片段，得到的片段分别用于体外转录模板，得到的两条RNA混合后退火，即可得到靶向DCL的dsRNA。

对比例2：将一种不能靶向灰霉病菌的RNA作为阴性对照（NC-RNA）。

验证试验：

1、RNAhex对灰霉病菌孢子萌发的抑制作用

选取长势良好的灰霉病菌，收集分生孢子，用PD培养基配成浓度为10

由图1可知，与对比例相比，使用本发明的实施例，对灰霉病菌孢子的萌发抑制效率极高，所有孢子几乎没有萌发；而对比例的dsRNA对灰霉病菌孢子具有一定的抑制萌发作用，但效果远远低于本发明的抑菌RNAhex分子；NC-RNA 分子对灰霉病菌孢子的萌发没有任何抑制效果，几乎所有的孢子全部萌发。

、RNAhex对灰霉病菌菌丝生长的抑制效果

采用生长速率法，测定RNAhex对供试病原真菌的抑菌活性。将RNAhex溶液过滤除菌后，在超净工作台中溶于已冷却至50℃的PDA培养基中，配置RNAhex的终浓度为100 ng/μL的PDA培养基，倒入直径9 cm的培养皿中冷却凝固，以加入等量的dsRNA和NC-RNA的PDA培养基作为对照。

取在PDA培养基上预先培养24 h的病原菌孢子菌落，移植到培养皿的中心，放置于28℃室内倒置培养6 d，结果如图2所示。

由图2可知，与对比例相比，使用本发明的实施例RNAhex对灰霉病菌菌丝的生长抑制效率远远高于dsRNA。

、RNAhex在不同植物叶片上对灰霉病菌的防治效果

选取生长整齐一致的番茄、烟草和拟南芥三种植物，向每颗植物喷洒100 ng/μL的RNAhex溶液后培养3 d，以浓度相同的dsRNA和NC-RNA溶液作为对照。剪取大小一致的番茄、烟草和拟南芥三种植物叶片，在叶柄包裹带水棉团。在长势良好的灰霉病菌平板边缘打取菌饼，接种在叶片的背面。每片叶接1块菌饼。接种后继续在26℃、85%相对湿度的条件下培养3 d，结果如图3所示。

由图3可知，与对比例相比，使用本发明的实施例RNAhex在三种植物叶片上对灰霉病菌的防治效果远远好于对比例。

综上，表明本发明提供的抑菌RNAhex分子具有诱导触发RNAi效率更高，对灰霉病菌的感染毒力具有极为显著的抑制效果。

上述实例只是为说明本发明的应用效果，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，或利用本发明在其它植物上实施对灰霉病的防治，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江理工大学

<120> 一种可用于灰霉病防治的抑菌RNAhex及其灰霉病菌抑制剂

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 990

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

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