精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法及ELISA检测试剂盒

摘要

本发明提供一种精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法，其步骤包括：选取目标293宿主细胞，进行培养表达，获取293宿主细胞蛋白；用293宿主细胞蛋白免疫动物，获得抗293宿主细胞蛋白多克隆抗体；利用准确的覆盖率检测方法对纯化后的抗293宿主细胞蛋白多克隆抗体进检测；选择其中覆盖率最高的多克隆抗体，采用ELISA法检测样本中残留的293宿主细胞蛋白。还公开了相应的ELISA检测试剂盒。本发明利用含有高覆盖率的293HCP抗体的ELISA试剂盒来定量检测生物医药制品中残留的293HCP蛋白，检测结果可信度高，效率高，能够同时对多个样本进行检测，检测灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明专利涉及一种精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法及ELISA检测试剂盒。

背景技术

293细胞是人肾上皮细胞系，有多种衍生株，比如HEK293，293T/17等，来源都是人胚胎肾细胞，也常被称作“工具细胞”，实验中常使用它来进行，慢病毒包装生产及滴度测定，细胞转染，条件培养基制作，蛋白表达验证等试验。其在生物制品产业化应用价值优点如下：1)293细胞比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株，多用于瞬时转染表达重组蛋白；2)生长快，生长密度高，转染效率和外源蛋白表达量较高，遗传背景清楚，生理代谢稳定；3)贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养三种方式均可用于293细胞的大规模培养；4)具有很高的质粒转染效率和对保持外源基因的高稳定性；5)对外界微环境较为敏感，可用于药物发现及细胞毒性测试。

293中重组表达生产某些蛋白质，这些蛋白质产品中有许多是用于人类和动物的治疗剂，因此，必须高度提纯。这些产品的制造和纯化过程中，存在来自293宿主细胞蛋白(HCP)杂质的可能性。这些杂质会降低治疗药物的疗效，并导致不良的毒性或免疫反应，因此需要将HCP杂质降至最低水平。

HCP又称宿主细胞蛋白，是生物制品的关键质量属性，影响着生物制品的质量、安全性与有效性。夹心法ELISA检测试剂盒是检测HCP残留的金标准。然而，这种方法高度依赖于试剂盒中HCP抗体对于总宿主细胞蛋白的覆盖率。若ELISA检测中使用的抗体覆盖率不足，可能在最终产品中漏检某些残留的HCP，进而可能在用药患者中引起免疫反应和其他药物安全性问题。美国药典UPS 1132对HCP抗体覆盖率检测提出了新的要求，建议使用2D-SDS-PAGE/Western或DIGE方案对ELISA检测试剂盒中HCP抗体进行覆盖率验证。

本试剂盒采用微量滴度板免疫酶联免疫测定(ELISA)方法。该方法使用的抗体是经过DIGE法检测过的高覆盖率抗体，平台特异性的HCP抗体覆盖率越高，对HCP的定量越准确，因此，本发明是针对293宿主细胞蛋白(HCP)残留进行更加精确的快速评估。

发明内容

本发明的目的是提供一种精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法。

一种精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法，其特征在于其步骤包括：

(1)选取目标293宿主细胞，进行培养表达，获取293宿主细胞蛋白；

(2)用293宿主细胞蛋白免疫动物，获得抗293宿主细胞蛋白多克隆抗体；

(3)利用准确的覆盖率检测方法对纯化后的抗293宿主细胞蛋白多克隆抗体进检测；

(4)选择其中覆盖率最高的多克隆抗体，采用ELISA法检测样本中残留的293宿主细胞蛋白。

优选的，步骤(1)中所述的目标293宿主细胞为ATCC-CRL-1573、ATCC-ACS-4500、ATCC-CRL-3216。

优选的，步骤(2)中的动物选择家兔。

优选的，步骤(2)中免疫次数为5次，分别为在第0、14、28、42、56天进行，其中最后一次免疫为冲击免疫。

优选的，步骤(3)中的检测方法为蛋白质荧光差异双向电泳法。

本发明还公开了一种精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于含有上述筛选出的抗293宿主细胞蛋白多克隆抗体。

优选的，所述试剂盒包括：

包被有上述筛选出的抗293宿主细胞蛋白多克隆抗体的ELISA微孔板；

步骤(1)获得的293宿主细胞蛋白；

生物素标记的上述筛选出的抗293宿主细胞蛋白多克隆抗体；

标记物HRP偶联的链霉素(抗生物素的蛋白)；

ELISA洗液浓缩液；

ELISA稀释液；

ELISA显色底物TMB；

终止液。

本发明利用含有高覆盖率的293HCP抗体的ELISA试剂盒来定量检测生物医药制品中残留的293HCP蛋白，检测结果可信度高，效率高，能够同时对多个样本进行检测，检测灵敏度高。

附图说明

图1. 293全蛋白2D DIGE技术凝胶图。

图2.用Cy3标记的293宿主细胞全蛋白DIGE凝胶图。

图3. Cy5检测抗293HCP抗体DIGE凝胶图。

图4.本发明检测试剂盒的293全蛋白标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例及对比例对本发明作进一步详细、完整地说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。

以下实施例的实验中所用到的动物、仪器设备、试剂及其配制等均来自市售。

293细胞株：ATCC-CRL-1573、ATCC-ACS-4500、ATCC-CRL-3216

细胞培养基：高糖的DMEM培养基，Yeasen公司

高压均质机：ATS AH-1500

高速冷冻离心机：Thermo Heraeus Mutifuge X1R

弗氏完全佐剂：Sigma公司

弗氏不完全佐剂：Sigma公司

亲和层析Protein G介质：SEPLIFE公司

IEF等电聚焦电泳仪；Cytiva Ettan

多功能激光成像仪：Cytiva Amersham Typhoon

本发明中所使用的其它生物试剂和化学试剂，如无特别说明，均为分析纯或分析纯以上级别。

实施例1兔抗293宿主细胞全蛋白抗体的制备

1.293宿主细胞全蛋白的制备

细胞培养收获：取上述3种细胞株各1支，将细胞接种到细胞培养瓶中，加入含10％小牛血清的培养基，适宜的培养液后置37±1℃培养。待复苏细胞生长成致密单层后用胰酶消化293细胞进行传代扩增，置35±1℃培养25天收获。用胰酶进行消化，以3500rpm、4℃离心30分钟，收集细胞沉淀。作为裂解蛋白制备样品源备用。

细胞破碎：将上述培养获得细胞株的细胞体混合，加入4℃预冷的0.01M PBS缓冲溶液(PH：7.4)500mL，于磁力搅拌器上搅拌至完全混匀。采用高压均质机(ATS AH-1500)高压破碎以上细胞体混悬液，调节均质阀，控制破细胞压力为500bar。重复以上高压破碎过程3-4遍。高速冷冻离心机(Thermo Heraeus Mutifuge X1R)离心澄清破细胞液，设定条件10000rpm，20min，8℃，离心分离，收集离心后的上清液。用0.01M PBS缓冲溶液将上清液稀释至蛋白浓度1mg/mL，用0.22um滤膜过滤除细胞，分装后-80℃保存；制得293宿主细胞全蛋白。

2.动物免疫程序

取4只兔进行动物免疫，分别进行5次免疫，采用抗原与佐剂等体积混合，乳化采用注射器混合法：将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止，即为乳化充分。乳化充分后，免疫动物。初免采用弗氏完全佐剂，随后的免疫都采用弗氏不完全佐剂。免疫当中进行梯度免疫实验，剂量为A组平行2只(1mg/兔子)，B组平行2只(2mg/兔子)采用背部皮下多点注射。

具体免疫程序为：初免(0天，弗氏完全佐剂)，抗原为293宿主细胞全蛋白；二免至五免(14/28/42天，弗氏不完全佐剂)，抗原为293宿主细胞全蛋白；三免之后，每只兔子都需要进行效价检测，实时监控血清效价；

表1免疫兔终血清效价

五免(56天，对倍体积生理盐水冲击免疫)，抗原为293宿主细胞全蛋白。59天处死、采血，血清纯化，具体步骤为将血清加0.01M PBS缓冲溶液(PH：7.4)稀释十倍，过亲和层析柱Protein G，用0.1M pH2.8的甘氨酸缓冲液洗脱获得。后分别得到不同免疫量的兔子抗293宿主蛋白多克隆抗体。

表2纯化后获得抗体蛋白含量

实施例2抗293宿主细胞蛋白抗体效价测定

采用ELISA法检测抗体效价，具体为：

包被：采用包被液(0.01M PBS缓冲液，pH7.4)将293宿主细胞全蛋白稀释至5ug/mL，100ul/孔，37℃包被2h。除去包被液，用PBS溶液洗涤3次。

封闭：每孔加入0.3mL封闭液(5％脱脂奶粉+PBS)于37℃保温2小时；再除去封闭液，PBS溶液洗涤三次。

加样：将上述纯化获得的兔抗293宿主蛋白抗体分别稀释至1mg/mL，再依次梯度10倍稀释，稀释缓冲液为0.1M PBS。每孔加入100uL，于37℃保温1小时，除去抗体溶液，PBS溶液洗涤3次。

比色及结果计算：然后向每孔加入用稀释缓冲液以1：5000稀释的酶标二抗(HRP标记的羊抗兔)100ul，37℃保温0.5小时后除去酶标液，PBS溶液洗涤3次。然后向每孔中加入100ul TMB显色液，室温避光作用15分钟后加2M H2SO4 0.05mL终止液终止反应，并用酶标比色仪测定OD450值，并计算抗体效价，抗体效价值如表3所示。

表3动物抗体效价值

实施例3抗293宿主细胞全蛋白抗体覆盖率的检测

3.1第一向等电聚焦

1)从-20℃冰箱取出2条13cm胶条，放置IPG泡胀盘，室温平衡20min。

2)将293HCP样品处理，先转移至5KDa超滤管,12000rpm离心30min/次，离心三次，每次离心结束后用水化液补足，使用超微量分光光度计，280nm初步定量。

3)计算样本蛋白的上样体积，移至1.5ml离心管，利用1M NaOH,冰上调节蛋白溶液PH为8.5左右，13cm胶条用4ul 0.1nM染料标记，涡旋离心，冰上避光孵育30min,然后用1ul,10mmol/L赖氨酸，涡旋瞬离，冰上15min,终止标记，然后按照13cm胶条的优化上样量用水化液补至250ul，用枪将混合好的溶液小心加入胶条槽中。

4)用镊子夹住IPG胶条碱性端将胶条的保护膜撕下，胶面朝下，先将IPG胶条酸性端朝胶条槽的尖端(正极)方向放入胶条槽中慢慢下压胶条，避免产生气泡，最后放下IPG胶条碱性端，使水化液浸湿整个胶条，放置过夜(胶条标记+为酸性端，标记—为碱性端)。

5)将等电聚焦电泳仪(IPGphor3)先调整水平，将陶瓷的聚焦槽放在等电聚焦电泳仪上，将胶条转移到聚焦槽中胶面朝上，并确定胶条位于胶条槽中央，胶条酸性端放在等电聚焦电泳仪正极，胶条碱性端放在等电聚焦电泳仪负极，将湿的电极滤纸片(用100ulddH2O润湿)放在胶条的两端(大致滤纸片的三分之一放在胶面上)。

6)将电极夹放在胶条的两端，使电极夹的电极丝压在两个电极滤纸片的外缘约1/3处，旋转凸轮至Manifold胶条外缘下的位置，将电极安装入位，每根胶条上面覆盖足够的矿物油。

7)设置聚焦仪器13cm胶条的程序，设置如下表4：

表4聚焦程序(2gels)

8)聚焦开始后配置SDS-PAGE大胶，待跑第二向SDS-PAGE电泳。

3.2第二向SDS-PAGE电泳

1)根据cytiva垂直电泳系统玻璃板安装说明进行安装玻璃板。

2)制备分离胶(12.5％)，将分离胶混匀后立即灌注于玻板间隙中，上层小心覆盖一层ddH

3)聚焦结束将胶条用双蒸水清洗三次，用镊子夹着胶条立着控一下水，将胶条放在胶条槽中加入已加DTT的5ml/1根胶条平衡液，在摇床上摇15min，弃掉加DTT的平衡液，再加入已加入碘代乙酰胺的5ml/1根胶条平衡液，在摇床上摇16min,弃掉平衡液。(5ml平衡液母液加DTT 0.05g，5ml平衡液母液加碘代乙酰胺0.125g)

4)将平衡好的胶条从含碘代乙酰胺平衡液中取出，在滤纸上滴净平衡液，用1X电泳缓冲液冲洗一下。

5)用镊子夹住胶条两端，垂直放于三明治板中间，凝胶之上，此时支撑面应与玻璃板紧密结合。

6)将三明治玻璃板竖直放置在架子上，用注射器针头，将胶条沿着玻璃板向下推，直至与胶面紧密接触(针头用力位置在胶条的支撑面，不能接触到胶面，以免划伤胶面)，剪一小块滤纸片置于胶条+极旁边并加10μl Marker。

7)用1ml移液器将配制好的低熔点琼脂糖沿一端加入三明治胶中，低熔点琼脂糖溶液将沿着胶面向另一端移动，排除胶条与SDS-PAGE凝胶胶面之间的气泡。

8)在低熔点琼脂糖未凝固时，用针头将胶条向下推，直至与SDS-PAGE胶面紧密接触并排除气泡。

9)带低熔点琼脂糖凝固后，然后将胶板固定于电泳装置上，上下槽各加入电泳缓冲液。设置程序：10w-30min(10w每胶条)，20w-5h(20w每胶条)，开始电泳直至溴酚蓝达到胶底部，关闭电源。

10)电泳完成后拨出凝胶，两块凝胶通过双模式多光谱激光成像系统(CytivaAmersham Typhoon)检查二维电泳跑胶情况(图1)；

3.3Western Blot实验，分析293宿主细胞全蛋白抗体的覆盖率

3.3.1western blot实验步骤如下：

1)电泳完成后小心拔出凝胶，放入已经配置好的转移液中。分别裁剪与凝胶大小一致的滤纸和PVDF膜，并放置于转移液中,PVDF膜使用前需要通过甲醇激活5s。

2)打开湿转转印仪盖，按照滤纸-膜-凝胶-滤纸的顺序，从下到上放置，消除气泡放上盖子，100V恒压转印3h。

3)取出膜在PBST中洗涤1次，在5％的脱脂奶粉(用PBST配制)中封闭1h后，使用1％脱脂奶粉(用PBST配置)稀释1：1000的兔抗293HCP抗体并敷上，4度孵育过夜。兔抗293HCP抗体来源为A组-2，B组-1，效价较高的实验兔血清。

4)次日从4℃冰箱取出膜，摇床上温育1h后倒掉一抗，在PBST中洗涤3次，每次5min。

5)使用PBST以1:4000稀释荧光二抗，并在室温避光孵育1h。

6)取出膜在PBST中避光洗涤3次，每次5min。

7)使用双模式多光谱激光成像系统(Cytiva Amersham Typhoon)在仪器上扫描PVDF膜，并拍照保存图2-3。

8)结果通过Melanie 9分析评估抗体的覆盖率，选择出覆盖率最高的兔抗293宿主细胞抗体。表7为两组抗体覆盖率数据，根据覆盖率结果选择A组-2抗体进行后续实验。

表7两组抗体覆盖率检测结果

实施例4抗293宿主细胞抗体标记生物素

1.取2mg抗293宿主细胞抗体，已经溶解在pH 7.4的0.01M PBS缓冲液中。(Tris或其他含胺缓冲液中的蛋白质必须转换成合适的缓冲液)

2.生物素试剂溶液配制:将2.0mg NHS-Biotin试剂溶解在590μl二甲基亚砜(DMSO)的溶剂中。

3.在蛋白溶液中加入适量的10mm生物素试剂溶液。

4.在室温下孵育30分钟。

5.蛋白质标记已经完成，之后通过透析纯化所标记的蛋白质以获得最佳的性能和稳定性，可以通过ELISA对标记的蛋白质进行初步测试确定了蛋白质的适当功能和标记；

5.ELISA对标记的蛋白质进行初步测试步骤如下

6.包被：用包被液(0.05MNaHCO

7.封闭：每孔加入0.3mL封闭液(5％BSA+PBS)于37℃保温2小时。除去包被液，PBS溶液洗涤3次。

8.加样：将上述获得的293宿主细胞全蛋白样品稀释至50ng/mL，稀释缓冲液为含2％BSA的PBS，一列各孔加入100ul稀释样品，另一列单加稀释缓冲液的孔作为阴性对照。于37℃保温1小时，除去抗体溶液，PBS溶液洗涤两次。

9.生物素标记抗293宿主细胞抗体加样：将生物素标记抗体稀释至8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、1ug/ml,100ul/孔，37℃保温0.5小时后除去生物素标记抗体，PBST溶液洗涤3次。

10.标记物HRP偶联链霉素(抗生物素的蛋白)加样：每孔加入用稀释缓冲液以1：5000稀释的HRP偶联的抗生物素的蛋白100ul，37℃保温0.5小时后除去酶标液，PBS溶液洗涤3次。

11.比色及结果计算：每孔中加入100ul TMB显色液，室温避光作用15分钟后加2MH

表8 293HCP ELISA试剂盒包被浓度及检测抗体浓度摸索结果

实施例5双抗体夹心法测定293宿主蛋白含量范围

根据上步所确定的包被抗体和检测抗体的工作浓度，本实验在保持包被抗体浓度和检测抗体浓度不变的前提下，设置不同浓度的标准品梯度，并通过双抗夹心ELISA法检测反应值，以确定最佳的标准品浓度梯度，实验结果如表9所示。本次实验每一个标准品浓度设置3个复孔，表中OD为平均值,具体实验步骤如下：

包被：用包被液(0.05MNaHCO

封闭：每孔加入0.3mL封闭液(5％BSA+PBS)于37℃保温2小时。除去包被液，PBS溶液洗涤3次。

标准品加样：将上述获得的293宿主细胞全蛋白样品稀释至100ng/mL、50ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.5ng/mL、0.75ng/mL、0.375ng/mL，稀释缓冲液为含2％BSA的PBS，各孔加入100ul稀释样品，单加稀释缓冲液的孔作为阴性对照。于37℃保温1小时，除去抗体溶液，PBS溶液洗涤两次。

生物素标记抗293宿主细胞抗体加样：每孔加入实施例4中的最适浓度的生物素标记抗体100ul,37℃保温0.5小时后除去生物素标记抗体，PBST溶液洗涤3次。

标记物HRP偶联链霉素(抗生物素的蛋白)加样：每孔加入用稀释缓冲液以1：5000稀释的HRP偶联的抗生物素的蛋白100ul，37℃保温0.5小时后除去酶标液，PBS溶液洗涤3次。

比色及结果计算：每孔中加入100ul TMB显色液，室温避光作用15分钟后加2MH2SO4 0.05mL终止液终止反应，并用酶标比色仪测定OD450值。表9为整理的检测数值，应用该方法检测293宿主蛋白的检测范围在100-0.78ng/mL。

表9

实施例6 293HCP ELISA试剂盒标准曲线的相关性

根据前两步确定的包被抗体和检测抗体的工作浓度，以及他们所能检测的标准品浓度范围，在保持包被抗体浓度和检测抗体浓度不变的前提下，设置七个不同浓度的标准品梯度。每个浓度作一个平行样，以尽可能减少实验操作误差的干扰。采用实施例6所述试剂盒，按照实施例5所述的方法在同一块板条上ELISA检测检测反应值，并以此绘制标准曲线。标准品浓度及对应的反应值如表10所示。

表10 293HCP标准曲线数据

由表数据，分析发现，数据具有明显的梯度，复孔之间差异很小，可以满足ELISA的实验需求。利用用线性拟合法绘制标准曲线，如图4所示。由图4可知，标准曲线R2为0.9969，可信度较高。

以下对ELISA检测试剂盒的功能性分析作进一步的说明：

实施例7 293HCP ELISA试剂盒回收率分析

以293HCP作为样本，利用0.01mol/L PBS稀释HCP，使其终浓度为25ng/ml。本次实验共重复三次，每次实验设置三个复孔。

采用实施例6所述试剂盒，按照实施例5所述的方法在同一块板条上ELISA检测，根据本试剂盒所获得的标准曲线和样本的OD计算样本浓度，并与起始浓度25ng/ml比较，计算回收率。回收率计算方法如下：

回收率＝样本计算浓度/样本实际浓度x 100％。

ELISA检测后，根据本试剂盒所获得的标准曲线和样本的OD计算样本浓度和回收率结果如表11所示。本次实验共重复三次，表中OD为三次实验的平均值。

表1 293HCP ELISA试剂盒回收率分析结果

回收实验结果表明，回收率在90％-105％之间，平均值为99.23％，回收率较高。说明本试剂盒具有很好的准确度。

实施例8 293HCP ELISA试剂盒特异性分析

以纯化后的Vero、毕赤酵母(Yeast)和CHO的宿主细胞蛋白HCP作为检测样本，采用实施例6所述试剂盒，按照实施例5所述的方法在同一块板条上检测，以评估本试剂盒的特异性。本实验共重复三次。

分别取550ng/mL的CHO HCP、480ng/mL的vero HCP、450ng/mL的毕赤酵母(Yeast)HCP各200μL，每孔100μl,加到包被并封闭好的试剂盒孔内。每个样本做一个复孔，进行夹心法ELISA实验，检测各待测样本与试剂盒的交叉反应程度，结果如表12所示(表中所有OD均为三次实验的平均值)。

表12 293HCP ELISA试剂盒特异性分析

实验结果表明CHO细胞、Vero细胞、毕赤酵母宿主细胞蛋白对ELISA反应的干扰程度非常小，与试剂盒之间基本无交叉反应。说明本试剂盒有很好的特异性，能特异性的与293宿主细胞蛋白反应，且不受上述细胞HCP的干扰。

实施例9. 293HCP ELISA试剂盒精密度分析

采用实施例6所述试剂盒，按照实施例5所述的方法在同一块板条上检测25ng/ml标准品10孔的OD450，重复试验三次，计算批内变异系数(CV％),平均为6.35％。