一种植物免提取直接实时荧光快速PCR扩增稳定剂、PCR扩增组合物和PCR扩增方法

摘要

本发明提供一种植物免提取直接实时荧光快速PCR扩增稳定剂、PCR扩增组合物和PCR扩增方法，具体公开了一种植物免提取PCR反应的稳定剂，所述稳定剂包括MgCl

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及植物叶片组织直接快速PCR扩增的方法。

背景技术

对于一些成熟的分子育种作物目前正在加速产业化应用。而这些优良的转基因品系一旦被批准商业化种植，目前已有的基于蛋白的现场快速检测技术将难以适用，迫切需要建立能够鉴定转基因品系的外源核酸快速分析技术以满足转基因产业化后对于作物田间现场检测的监管需求。

传统PCR扩增技术包括核酸提取、扩增和检测。核酸提取主要有试剂法(如CTAB法、SDS法)、核酸提取试剂盒法等。然而这些方法常常涉及核酸抽提、沉淀、洗脱等多个操作步骤，数个小时提取时间以及依赖离心机等大型仪器等，并且试剂法需要用到氯仿等有毒试剂，而试剂盒提取成本较高。因此，传统的核酸提取方法不利于大量样品的分析和检测，难以满足建立在核酸分析基础上开展的大规模现场快速检测分析的要求。PCR扩增是目前应用最为成熟的技术，然而PCR扩增需要较长的反应时间。核酸恒温扩增技术如LAMP、RPA虽然可以实现核酸快速扩增，然而该类技术的应用研究仍处于起步阶段，在实际应用中存在成本高昂、引物设计复杂或易产生假阳性问题等不足。扩增产物可以结合多种方法进行检测，如凝胶电泳、核酸试纸条、实时荧光等。凝胶电泳检测繁琐耗时。核酸试纸条可以实现快速、便捷分析，然而由于引物二聚体和气溶胶污染，容易产生假阳性结果。实时荧光分析可以实现扩增产物准确分析以及定量分析，扩增反应完成即可读出结果，有效缩短检测时间。

随着分子标记辅助选择技术在农作物分子育种中的广泛应用，在进行遗传连锁分析时，需要对大量单株叶片组织进行PCR扩增以进行分子鉴定。按照现有DNA分子标记检测流程：在实验室工作中首先要分株提取待测植物叶片DNA，确定DNA浓度进行相应PCR扩增，最后进行凝胶电泳检测，此外在田间育种材料的选择中，也需要大量提取待测植株叶片DNA以进行目标基因的标记跟踪。至少数百株植物叶片的基因组DNA的提取工作异常繁琐耗时，消耗大量人力和物力成本。

现有技术中已有一些相关技术，例如，专利CN 101575597A、CN 103289991 A、CN101812445 A提供了植物组织基因组快速提取技术，但这些技术需要裂解、中和和沉淀等核酸提取步骤或破碎装置。专利CN 111254188 A提供了动物组织直接PCR扩增技术，但该技术在PCR扩增前需要样品预处理操作。虽然目前已有少数公开专利如植物叶片直接PCR扩增(CN 112813150 A、CN 109680089 A)以及种子发芽直接PCR扩增(CN 109234372 A)，然而这类方法均采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，需要耗费大量人力和物力成本，无法进行快速鉴定，不利于批量试验。

发明内容

针对上述提到的日益增长的转基因植物快速检测需求，现有技术中存在检测方法复杂，步骤繁琐等问题。为解决上述问题，本发明提供一种植物叶片直接快速PCR扩增技术，其直接以植物叶片作为模板，无需破碎组织以及提取基因组DNA繁琐步骤，同时采用快速扩增PCR酶，结合便携式实时荧光快速PCR仪能够在20min完成PCR分析。整个分析过程显著简化PCR分析流程、缩短分析时间，有利于分子育种中单株叶片高效检测以及作物品系现场快速鉴定。

包括以下步骤：将叶片直接作为模板加入含有稳定剂的PCR反应体系中，进行PCR快速扩增和实时荧光分析。本发明的荧光PCR直接扩增技术无需破碎组织以及提取基因组DNA。

本发明直接以植物叶片作为模板，无需破碎组织以及提取基因组DNA繁琐步骤，同时采用快速扩增PCR酶，结合便携式实时荧光快速PCR仪能够在20min完成PCR分析。整个分析过程显著简化PCR分析流程、缩短分析时间，有利于分子育种中单株叶片高效检测以及作物品系现场快速鉴定。

植物组织如叶片在剪切时，会从伤口处释放微量DNA，利用叶片进行直接PCR扩增，需要考虑微量DNA能否被DNA聚合酶结合，此外还要考虑叶片释放的少量多糖和蛋白质等物质对PCR体系的影响，因此需要开发一种稳定剂缓冲液，以优化PCR体系。

对叶片直接扩增进行实时荧光PCR分析时，叶片中的叶绿素、光敏素、类胡萝卜素等成分会形成荧光干扰，因此需要筛选大量不同吸收和发射波长的荧光标记物质，确定最佳探针荧光标记物，以有效避免叶片中荧光物质的干扰。

本发明一个方面提供了一种植物免提取PCR反应的稳定剂，所述稳定剂包括MgCl

进一步地，所述稳定剂中各组分的浓度为0.6-1.0mM的MgCl

进一步地，所述稳定剂中各组分的浓度为0.8mM MgCl

本发明另一个方面提供了一种植物免提取的PCR反应组合物，所述PCR反应组合物包含快速扩增组合物25μL、正向引物2μL、反向引物2μL、探针1μL、上述植物免提取PCR反应的稳定剂20μL，PCR反应组合物为50μL；

快速扩增组合物包含0.4mM dNTPs、0.4mM dUTP、5mM Mg

进一步地，所述的探针的标记物质为5’端修饰Hex和3’端修饰BHQ1。

本发明第三个方面提供了一种植物免提取PCR的反应试剂盒，所述反应试剂盒包含上述植物免提取的PCR反应组合物。

本发明第四方面提供了上述植物免提取的PCR反应组合物或上述植物免提取PCR的反应试剂盒在进行植物PCR中的应用，所述的植物PCR以未经DNA提取的植物部分。

进一步地，所述的植物部分为植物叶片、植物种子、植物胚芽。

本发明第五方面提供了一种植物免提取的PCR反应装置，所述PCR反应装置包含上述反应试剂盒、PCR检测仪。

进一步地，PCR检测仪选自便携式快速扩增PCR仪、实时荧光定量PCR仪器。

本发明第六方面提供了一种植物免提取PCR检测方法，其包括以下步骤：

1)取未处理的植物部分，放入上述PCR反应组合物中

2)进行实时荧光PCR快速扩增。

进一步地，植物部分选自植物叶片、植物种子、植物胚芽。

PCR体系包括快速扩增组合物25μL、引物-F 2μL、引物-R 2μL、探针1μL、稳定剂缓冲液20μL，PCR体系为50μL。

其中稳定剂缓冲液含有终浓度为0.8mM MgCl

快速qPCRMix含有0.4mM dNTPs、0.4mM dUTP、5mM Mg

该技术可以搭配便携式快速PCR扩增仪，以实现现场快速PCR检测，现有技术存在多种市售快速PCR扩增仪，本发明选择上海硕盟生物科技有限公司开发的便携式实时荧光定量PCR仪，经测试该仪器与快速扩增Mix-适用性良好。

有益效果

本发明直接以植物叶片作为模板，无需破碎组织以及提取基因组DNA繁琐步骤和装置，与其它植物基因组DNA快速提取技术专利相比，无需PCR扩增前预处理。

与植物组分快速提取或直接扩增技术相关专利相比，本发明的稳定剂以及反应体系能够满足实时荧光PCR技术的要求，进而采用实时荧光PCR技术，克服传统聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物分析时繁琐耗时的缺点。

本发明采用快速扩增PCR酶，结合便携式超速实时荧光PCR仪能够在30min完成PCR扩增。整个分析过程显著简化PCR分析流程、缩短分析时间，有利于分子育种中单株叶片高效检测以及作物品系现场快速鉴定。

附图说明

图1为叶片中常见荧光干扰物质叶绿素a、叶绿素b、光敏素Pr、光敏素Pfr和β-类胡萝卜素的扫描光谱。

图2为HEX探针扩增图。

图3为JOE探针扩增图。

图4为TET探针扩增图。

图5为实施例3玉米叶片直接扩增图谱。

图6为实施例4大豆叶片直接扩增图谱。

图7为实施例5油菜籽发芽下胚轴直接扩增图谱。

图8为实施例6新鲜叶片直接扩增图谱。

图9为实施例7新鲜叶片扩增图谱。

具体实施方式

为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

实施例1：优化稳定剂缓冲液的配制

稳定剂缓冲液中MgCl

上述组分稳定剂能够消除叶片中含有的大量抑制因子，减少叶片样本对PCR扩增的干扰作用，从而能够实现叶片直接PCR扩增，本发明的稳定剂各组分之间协同作用，无需添加其他成分即可省去对叶片样本分离提取核酸的步骤，提高检测效率，有效降低交叉污染。

实施例2：荧光标记

植物叶片中常见物质如叶绿素a、叶绿素b、光敏素Pr、光敏素Pfr和β-类胡萝卜素等荧光物质会干扰PCR实时荧光检测，因此需要严格选择荧光标记物。由图1可知，叶片中常见荧光干扰物质的最大激发波长在400-500nm，最大发射波长在600-800nm。

核酸探针常用荧光标记分子有6-FAM、HEX、Cy3等，其常见标记物质的荧光特性如下表所示：

下表列出的是最常用的荧光基团及与之匹配的淬灭基团

由叶片中常见荧光干扰组分的荧光特性可知，探针标记物质的最大激发波长和最大发射波长应位于400-500nm，由上表可知，6-FAM、JOE、TET、HEX、TAMRA、Cy3和ROX可以有效降低叶绿素等成分的荧光干扰。

分别将这些荧光基团标记探针，进行叶片直接扩增PCR，经过大量测试，部分实验结果见图2-4，综合分析Hex分析性能最佳。

实施例3：大豆叶片直接扩增PCR

1、配制直接扩增PCR体系

其中正向引物-F：5'-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3'SEQ ID NO.1

反向引物-R：5'-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3'SEQ ID NO.2

探针：HEX-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1 SEQ ID NO.3

2、PCR扩增

利用打孔器在田间取1-2mm

PCR快速扩增程序：

总反应时间为33min，扩增曲线见图6。

实施例4：玉米叶片直接扩增PCR

1、配制直接扩增PCR体系

其中正向引物-F：5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'SEQ ID NO.4

反向引物-R：5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'SEQ ID NO.5

探针：HEX-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-BHQ1 SEQ ID NO.6

2、PCR扩增

利用打孔器在田间取1-2mm

PCR快速扩增程序：

总反应时间为33min，扩增曲线见图5。

实施例5种子发芽直接扩增PCR

在育种中，种子在用于销售和生产之前，对其遗传纯度的鉴定非常重要，DNA分子标记鉴定法准确、高效，已广泛应用于作物种子纯度鉴定。本技术以油菜种子发芽后的下胚轴直接作为模板

1、配制直接扩增PCR体系

其中正向引物-F：5'-GGCCAGGGTTTCCGTGAT-3'SEQ ID NO.7

反向引物-R：5'-CCGTCGTTGTAGAACCATTGG-3'SEQ ID NO.8

探针：HEX-AGTCCTTATGTGCTCCACTTTCTGGTGCA-BHQ1 SEQ ID NO.9

2、PCR扩增

油菜籽发芽后，取1-1.5mm长度的下胚轴，浸没50μL反应体系中，立刻放置在便携式快速扩增PCR仪上进行PCR反应。

PCR快速扩增程序：

总反应时间约33min

实施例6常规实时荧光定量PCR扩增

本技术开发的叶片直接扩增体系也可以使用常规实时荧光定量PCR仪器检测

1、配制直接扩增PCR体系

其中正向引物：5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'SEQ ID NO.10

反向引物：5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'SEQ ID NO.11

探针：HEX-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-BHQ1 SEQ ID NO.12

2、PCR扩增

利用打孔器在田间取1-2mm

PCR快速扩增程序：

总反应时间84min，实验结果见图8。

实施例7：是否含有稳定剂对于大豆叶片直接扩增PCR的影响

1、按照实施例3分别配置含有稳定剂和不含稳定剂的直接扩增PCR体系，其中正向引物-F：5'-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3'SEQ ID NO.13；反向引物-R：5'-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3'SEQ ID NO.14；探针：HEX-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1SEQ ID NO.15

2、利用打孔器在田间取1-2mm

结果见上表和图9，结果表明：含有稳定剂成分的PCR体系可以有效扩增，然而不含稳定剂成分的PCR体系无法扩增，因此，稳定剂对于该叶片直接PCR扩增技术是必不可少的。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院油料作物研究所 南昌大学

天筛（上海）科技有限公司

<120> 一种植物免提取直接实时荧光快速PCR扩增稳定剂、PCR扩增组合物和PCR扩

增方法

<130> CP122030185C

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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gcccatctgc aagccttttt 20

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<213> 人工序列

<400> 3

agcttcgccg cttccttcaa cttcac 26

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<212> DNA

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<400> 4

cggtggatgc taaggctgat g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aaagggccag gttcattatc ctc 23

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<213> 人工序列

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