李子萃取物用于制备提升身体机能组合物的用途

摘要

本发明公开一种李子萃取物用于制备提升身体机能组合物的用途，其中李子萃取物提取自开花后2～3个月内未熟成的青色的李子。

说明书

技术领域

本发明涉及一种萃取物，特别是关于提取自开花后2～3个月内未熟成的青色的李子的李子萃取物用于制备提升身体机能组合物的用途。

背景技术

李子是蔷薇科(Rosaceae)植物李属(Prunus)的果实，通常在七月到八月之间采收果实，可以鲜食也常被制成罐头。李子自古被列为「五果」之首，也被本草纲目誉为能养颜美容的水果。

成熟的李子口感酸甜、果肉软而果汁多，十分受到消费者的欢迎。李树对气候的适应力强，对土壤的要求也不严格，生长也迅速，也是农民喜爱的经济农产物。

发明内容

但是，未成熟的李子味道酸涩、果肉过硬，并无法食用。基此，本发明提供一种李子萃取物的用途，其是用于制备提升身体机能的组合物，且李子萃取物提取自开花后2～3个月内未熟成的青色的李子。将未熟成的青色李子果实进一步进行利用，提升其整体产业价值，解决产业生产过剩或疏果过程中疏落的未熟成的青色李子果实。

在一些实施例中，提升身体机能是指提升减脂相关基因表现量，其中上述减脂相关基因是指LIPE基因。

在一些实施例中，提升身体机能为抑制细胞内脂肪油滴堆积。

在一些实施例中，提升身体机能为提升新陈代谢效率。

在一些实施例中，提升新陈代谢效率是提升丙酮酸生成效率。

在一些实施例中，提升身体机能为减少体重及/或减少腰围。

在一些实施例中，提升身体机能为改善肠胃道机能。在一些实施例中，改善肠胃道机能为改善腹胀、恶心、反胃等症状其中之一。在一些实施例中，改善肠胃道机能为提升肠道蠕动、改善便秘、粪质软化等症状其中之一。

在一些实施例中，组合物为一食品组合物，且组合物内至少包含上述李子萃取物2克/日。意即，李子萃取物的有效用量为2克/日。

综上所述，根据任一实施例的李子萃取物，其可以提升身体机能。根据任一实施例的李子萃取物，其可以提升减脂相关基因表现量，借由提升LIPE基因表现量达到提升身体机能的用途。根据任一实施例的李子萃取物，其可以抑制细胞内脂肪油滴堆积，借由抑制细胞内脂肪油滴堆积达到提升身体机能的用途。根据任一实施例的李子萃取物，其可以提升新陈代谢效率，借由提升丙酮酸生成效率达到提升身体机能的用途。根据任一实施例的李子萃取物，其借由减少体重及/或减少腰围达到提升身体机能的用途。根据任一实施例的李子萃取物，其借由改善肠胃道机能达到提升身体机能的用途。并且，根据任一实施例的李子萃取物，在每日服用李子萃取物2克的情况下即能有效达到提升身体机能的用途。

以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。

附图说明

图1是本发明实施例的李子萃取物与熟成李提取物的总黄酮含量比较图。

图2是本发明实施例的李子萃取物与熟成李提取物的丹宁含量比较图。

图3是本发明实施例的李子萃取物与其他品种青果提取物的总黄酮含量比较图。

图4是本发明实施例的李子萃取物与其他品种青果提取物的丹宁含量比较图。

图5是本发明实施例的李子萃取物的LIPE基因表现量测试结果图。

图6是本发明实施例的李子萃取物与熟成李提取物对于脂肪细胞内脂肪油滴堆积测试油滴分布状态图。

图7是本发明实施例的李子萃取物与熟成李提取物对于脂肪细胞内脂肪油滴堆积测试结果比较图。

图8是本发明实施例的李子萃取物与熟成李提取物对于丙酮酸生成速率测试结果比较图。

图9是人体实验体重变化结果图。

图10是人体实验腰围变化结果图。

图11是人体实验问卷调查整体肠胃道不适改善结果图。

图12是人体实验问卷调查上腹部饱胀感改善结果图。

图13是人体实验问卷调查恶心感改善结果图。

图14是人体实验问卷调查反胃改善结果图。

图15是人体实验问卷调查肠道蠕动次数结果图。

图16是人体实验问卷调查排便省力结果图。

图17是人体实验问卷调查粪质变软结果图。

具体实施方式

本发明提供一种李子萃取物的用途，其是用于制备提升身体机能的组合物，且李子萃取物提取自开花后2～3个月内未熟成的青色的李子。

在一些实施例中，李子萃取物是李子原料以溶剂经由萃取步骤而制得。

在一些实施例中，李子原料是指李树(学名：Prunus sect.Prunus)自开花后2～3个月内未熟成的青色果实。在一些实施例中，李子原料是中国李(学名：Prunus salicina)所制得。在一些实施例中，李子原料是指整颗果实，果实包括果皮、果肉及果核。在一些实施例中，李子原料是指李子新鲜果实、干燥果实、冷冻果实或以其他物理方式加工以利处理的果实。在一些实施例中，李子原料可以是完整果实、剁碎果实、切丁果实、碾磨果实、研磨果实或以其他方式经加工以处理原物料的大小及实体完整性的果实。举例而言，将李子的青色果实设备以粗碎孔径30mm进行粉碎后取得李子原料。

在一例实施例中，溶剂可以是纯水。在一些实施例中，溶剂与李子原料的重量比例为5～20：1～5。在一些实施例中，溶剂与李子原料的重量比例为5：1。

在一些实施例中，萃取步骤是指溶剂和李子原料混合之后加热到设定温度后并维持温度一段固定时间。在一些实施例中，设定温度可以是85±5℃。在一些实施例中，固定时间可以是60分钟～90分钟。在另一些实施例中，萃取步骤是指溶剂和李子原料混合之后加热到设定温度后并维持温度一段固定时间。若溶剂过少或固定时间过短，则萃取效率将会明显下降；若萃取时间过长，则萃取物中的有效成分可能会产生降解。

在一些实施例中，萃取步骤之后还包括过滤步骤，过滤步骤是指将萃取步骤之后的李子原料及溶剂通过筛网以将溶剂内的固体滤除形成过滤液体。举例而言，筛网可以是400网目(mesh)的筛网。在一些实施例中，过滤步骤是指将萃取步骤之后的李子原料及溶剂先进行离心并取得上清液之后，再将上清液通过筛网以将溶剂内的固体滤除形成过滤液体。

在一些实施例中，萃取步骤和过滤步骤之间还包括降温步骤，降温步骤是指将加热后的李子原料及溶剂静置以自然降温至室温(25℃-30℃)。

在一些实施例中，李子萃取物是李子原料以溶剂经由萃取步骤之后进行过滤步骤，最后再进行减压浓缩而制得。

在一些实施例中，浓缩步骤是以减压浓缩机在45℃-70℃下进行。在一些实施例中，浓缩步骤是以减压浓缩机在60℃±5℃下进行。举例而言可以采用厂牌/型号：BUCHI-Rotavapor R-100。在一些实施例中，浓缩步骤在将液体浓缩至白利糖度值(Degrees Brix)5.0±0.5时停止。在一些实施例中，减压浓缩的压力设定值为150巴(Bar)。于此，通过减压浓缩能去液体内酒精成分，并且减少存放体积。

在一些实施例中，提升身体机能是指提升减脂相关基因表现量，其中上述减脂相关基因是指激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase，LIPE，gene ID3991)基因(后续简称LIPE基因)。LIPE基因会转录生成荷尔蒙敏感性脂解酶(Hormone-SensitiveLipase，简称HSL)。而HSL则将双酸甘油脂水解成单酸甘油脂，其于脂肪分解上扮演举足轻重的角色。

在一些实施例中，提升身体机能为抑制细胞内脂肪油滴堆积。

在一些实施例中，提升身体机能为提升新陈代谢效率。在一些实施例中，提升新陈代谢效率是提升丙酮酸(Pyruvate)生成效率。

在一些实施例中，提升身体机能为减少体重及/或减少腰围。

在一些实施例中，提升身体机能为改善肠胃道机能。在一些实施例中，改善肠胃道机能为改善腹胀、恶心、反胃等症状其中之一。在一些实施例中，改善肠胃道机能为提升肠道蠕动、改善便秘、粪质软化等症状其中之一。

在一些实施例中，组合物为一食品组合物，且组合物内至少包含上述李子萃取物2克/日。意即，李子萃取物的有效用量为2克/日。

在一些实施例中，前述的任一组合物可为医药品。换言之，此医药品包含有效含量的李子萃取物。

在一些实施例中，前述的医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于经肠地道、非经肠地道(parenterally)、口服的、或局部地(topically)投药剂型。

在一些实施例中，经肠道或口服的投药剂型可为，但不限于，锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)或类似之物。在一些实施例中，非经肠地道或局部地投药剂型可为，但不限于，注射品(injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(externalpreparation)或类似之物。在一些实施例中，注射品的投药方式可为皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)或病灶内注射(intralesional injection)。

在一些实施例中，前述的医药品可包含被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。在一些实施例中，医药上可接受的载剂可为下列载剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。关于选用的载剂的种类与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。在一些实施例中，作为医药上可接受的载剂的溶剂可为水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、或含有醇的水性溶液(aqueous solutioncontaining alcohol)。

在一些实施例中，前述的任一组合物可为食用产品(即食品组合物)。换言之，食用产品包含特定含量的李子萃取物。在一些实施例中，食用产品可为一般食品、保健食品、膳食补充品或食品添加物(food additive)。

在一些实施例中，前述的食用产品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于口服的剂型。在一些实施例中，一般食品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)或调味料。

在一些实施例中，能借由现有方法于原料制备时添加任一实施例的李子萃取物(即作为食品添加物)，或是于食品的制作过程中添加任一实施例的李子萃取物(即作为食品添加物)，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食用产品。

例1：样本的制备

李子萃取物样本一：将未熟成的青色李子果实(学名：Prunus salicina)粉碎后成为李子原料。于此，青色李子果实采用冷冻的整颗果实，意即含有果皮、果肉及果核。于此，采用osterizer品牌的10speed blender粉碎机进行粉碎，并且设定孔径为30mm。接着，以水为溶剂，将粉碎后的李子原料与溶剂以1:5的重量比例混合后在85℃下萃取1小时后，降温到室温(25℃)。然后，将降温后的李子原料及溶剂进行离心取得上清液后，将上清液通过400网目的筛网以形成过滤液。于此，采用厂牌/型号：Thermo Scientific Heraeus Fresco17进行离心。接着，于60℃下对过滤液进行减压浓缩至白利糖度达到5.0±0.5Brix而制得李子萃取物样本。于此，采用厂牌/型号：BUCHI-Rotavapor R-100进行减压浓缩。

李子萃取物样本二：采用95.79％的水，4％的李子萃取物样本一，0.2％的柠檬酸及0.01％的蔗糖素混合制成。

对照样本A：以粉碎机将干燥熟成的红色李子果实(学名：Prunus salicina)以粗碎孔径30mm进行粉碎后成为李子原料。于此，采用osterizer品牌的10speed blender进行粉碎。接着，以水为溶剂，将粉碎后的李子原料与溶剂以1:5的重量比例混合后在85℃下萃取1小时后，降温到室温(25℃)。然后，将降温后的李子原料及溶剂进行离心取得上清液后，将上清液通过400网目的筛网以形成过滤液。于此，采用厂牌/型号：Thermo ScientificHeraeus Fresco 17进行离心。接着，于60℃下对酵解液进行减压浓缩至白利糖度达到5.0±0.5Brix而制得对照样本A。于此，采用厂牌/型号：BUCHI-Rotavapor R-100进行减压浓缩。

对照样本B：以粉碎机将另一品种的未熟成的青色李子果实(水李，也称澳洲李、东方李，学名：Prunus salicina)粉碎后以10目数的筛网过筛之后成为李子原料。于此，采用osterizer品牌的10speed blender进行粉碎。接着，以水为溶剂，将粉碎后的李子原料与溶剂以1:5的重量比例混合后在85℃下萃取1小时后，降温到室温(25℃)。然后，将降温后的李子原料及溶剂进行离心取得上清液后，将上清液通过400网目的筛网以形成过滤液。于此，采用厂牌/型号：Thermo Scientific Heraeus Fresco 17进行离心。接着，于60℃下对酵解液进行减压浓缩至白利糖度达到5.0±0.5Brix而制得对照样本B。于此，采用厂牌/型号：BUCHI-Rotavapor R-100进行减压浓缩。

例2：李子萃取物与熟成李提取物含量比较

2.1.总黄酮含量测试

分别以前述例1所得的对照样本A为对照组样本及李子萃取物样本一为实验组样本。将各样本以水稀释20倍至1200μL。接着，分别加入200μL的5％亚硝酸钠并混合后静置6分钟后，再加入200μL的10％硝酸铝并混合后静置6分钟，接着加入2ml的4％氧氧化钠并混合，最后再加入1.4ml的水并混合以得到待测反应溶液。将待测反应溶液至96孔板中，并以分光亮度计测量待测反应溶液在500nm下的吸光值。

并且，以芸香苷(rutin)作为标准品以制作标准曲线。于此，配置0μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、1000μg/mL及1200μg/mL的芸香苷的标准溶液。将各标准溶液分别加入200μL的5％亚硝酸钠并混合后静置6分钟后，再加入200μL的10％硝酸铝并混合后静置6分钟，接着加入2ml的4％氧氧化钠并混合，最后再加入1.4ml的水并混合以得到待测标准品溶液。将200μL的待测标准品溶液移至96孔板中，并以分光亮度计测量待测反应溶液在500nm下的吸光值分别为0μg/mL的吸光值为0.035、400μg/mL的吸光值为0.13、600μg/mL的吸光值为0.183、1000μg/mL的吸光值为0.273及1200μg/mL的吸光值为0.335，并以上述结果依线性回归计算以获得标准曲线。

接着，利用标准曲线将待测反应溶液的吸光值换算成总黄酮含量。于此，可得到对照样本A(对照组)的总黄酮含量为2219μg/mL及李子萃取物样本一(实验组)的总黄酮含量2317μg/mL，如图1所示。

实验结果如图1所示，本发明实施例的李子萃取物的总黄酮含量较所制得的对照组样本A的总黄酮含量更高。基此，未熟成青色李子的成分和熟成的红色李子二者并不相同。

2.2.丹宁含量测试

分别以前述例1所得的对照样本A为对照组样本及李子萃取物样本一为实验组样本。将各样本取1mL于25mL定量瓶，并以超纯水定量。接着，将各样品取10μL分别加入750μL超纯水后混合均匀。再加入50μL的福林酚试剂(Folin&ciocalten’s phenol reagent)并混合后静置8分钟后，再加入100μL的饱合碳酸钠溶液并混合后于室温下反应2小时以得到待样品溶液。将200μL的待测样品溶液移至96孔板中，并以分光亮度计测量待测样品溶液在765nm下的吸光值。

并且，以单宁酸(Tannic acid)作为标准品以制作标准曲线。于此，配置0ppm、100ppm、200ppm、600ppm及800ppm的单宁酸的标准溶液。将各标准溶液取10μL分别加入750μL超纯水后混合均匀。再加入50μL的福林酚试剂(Folin&ciocalten’s phenol reagent)并混合后静置8分钟后，再加入100μL的饱合碳酸钠溶液并混合后于室温下反应2小时以得到待测标准品溶液。将200μL的待测标准品溶液移至96孔板中，并以分光亮度计测量待测反应溶液在765nm下的吸光值，并依据量测结果依线性回归计算以获得标准曲线。

接着，利用标准曲线将待测反应溶液的吸光值换算成单宁酸含量。于此，可得到对照样本A(对照组)的丹宁含量为2039μg/ml及李子萃取物样本一(实验组)的丹宁含量3559μg/ml。

实验结果如图2所示，本发明实施例的李子萃取物的丹宁含量较所制得的对照组样本A的丹宁含量更高。基此，未熟成青色李子的成分和熟成的红色李子二者并不相同。

例3：李子萃取物与其他品种青果提取物含量比较

3.1.总黄酮含量测试

分别以前述例1所得的对照样本B为对照组样本及李子萃取物样本一为实验组样本。测试流程参考上述2.1，采用相同的实验步骤与实验设备。

最后，利用标准曲线将待测反应溶液的吸光值换算成总黄酮含量。于此，可得到对照样本B的总黄酮含量为1007μg/ml及李子萃取物样本一的总黄酮含量2307μg/ml。

实验结果如图3所示，本发明实施例的李子萃取物的总黄酮含量较所制得的对照样本B的总黄酮含量更高。基此，未熟成青色李子的成分和其他品种的未成熟青色李子二者并不相同。

3.2.丹宁含量测试

分别以前述例1所得的对照样本B为对照组样本及李子萃取物样本一为实验组样本。测试流程参考上述2.2，采用相同的实验步骤与实验设备。

最后，利用标准曲线将待测反应溶液的吸光值换算成单宁酸含量。于此，可得到对照样本B的总黄酮含量为1756μg/mL及李子萃取物样本一的总黄酮含量3599μg/mL。

实验结果如图4所示，本发明实施例的李子萃取物的丹宁含量较所制得的对照样本B的丹宁含量更高。基此，未熟成青色李子的成分和其他品种的未成熟青色李子二者并不相同。

例4：减肥相关基因表现量测试

4.1材料、仪器及溶液配置

实验细胞：采用小鼠骨髓基质细胞(后续简称OP9细胞)，OP9细胞购自美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection，

培养基：含有20％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(GIBCO公司，编号10438-026，美国)、1％抗生素-抗霉菌素(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco公司，编号15240-062)的α-最低限度必需培养基(α-Minimum essential medium，简称α-MEM)(Gibco公司，编号12000-022)。

试剂：RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Lot No.FC24015-G)、KAPA

反转录酶：采用

检测仪器：ABI StepOnePlusTM实时PCR系统(Real-Time PCR system，购自ThermoFisher Scientific公司，美国)。

4.2.测试流程

首先，取1.5x10

其中，空白组不添加任何测试样本，并以前述例1所得的对照样本A为对照组样本及李子萃取物样本一为实验组样本。于此，对照组及实验组的培养基内的测试样本浓度为0.025mg/mL。

将控制组及实验组在37℃下培养24小时后，以细胞裂解液分别打破细胞膜以形成细胞溶液。

接着，使用RNA萃取试剂套组分别收集二组细胞溶液内的RNA。接着，每组取1000奈克(ng)所萃取出的RNA为模板，借由反转录酶以表一中的引子黏合进行反转录作用产生相应的cDNA。后续利用实时PCR系统，以及qPCR试剂组将二组反转录后产物分别以表一的组合引子进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reversetranscription polymerase chain reaction)以观察各组细胞的基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应1秒，60℃反应20秒，总共40个循环，并使用2-ΔCt方法进行基因定量。于此，借由cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量各基因的mRNA表现量，进而推断各基因编码的蛋白质的表现量。

表一(F为顺向引子(Forward primer)，而R为反向引子(Reverse primer)

如图5所示，图5中显示是以相对基因表现系以相对倍率呈现，其中使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，并在Excel软件中以单尾学生t检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显着差异。

其中，图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上相对于空白组的差异越显着。

其中，图式中「#」代表p值小于0.05，「##」代表p值小于0.01，以及「###」代表p值小于0.001。当「#」越多时，代表统计上相对于对照组的差异越显着。

4.3.测试结果

请参阅图5。将空白组的LIPE基因的表现量视为1(即100％)时，对照组相对于空白组的LIPE基因的表现量为11.1(即111％)，实验组相对于空白组的LIPE基因的表现量为17.1(即171％)，代表实验组的LIPE基因的表现量为空白组的17倍以上。

并且，在统计学t检验的计算下，实验组和对照组相对于空白组都具有显着差异，而且实验组相对于对照组也具有显着差异。

意即，不论是李子萃取物或是熟成的红色李子的萃取物皆有促进LIPE基因表现量的显着效果，而且李子萃取物的功效显着大于熟成的红色李子的萃取物的功效。

例5：细胞脂质油滴堆积测试

脂肪细胞内以油滴(Lipid droplet)的形式贮存脂肪。基此，本次试验分析染色后的油滴，以观察细胞内油滴的数量，借以确认脂肪堆积的状态。后续，再将染剂溶出并分析以作为量化的数值指标。

5.1.材料或溶液配置：

实验细胞：采用小鼠骨髓基质细胞(后续简称OP9细胞)，OP9细胞购自美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection，

培养基：为MEMAM(Minimum Essential Medium Alpha Medium，购自Gibco，产品编号Cat.12000-022)细胞培养液加入20％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，购自Gibco，产品编号Cat.10437-028)及0.1％的青霉素/链霉素(Penicillin-streptomycin，购自Gibco，产品编号Cat.15240-062)。

5.2.测试流程

首先，取24孔培养盘将每孔接种8×10

实验组一：将本案例1的方式制备而成的李子萃取物样本一依照浓度为0.25mg/mL添加至分化完成后的细胞中，然后在37℃下培养7天。在7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基及样本。

实验组二：将本案例1的方式制备而成的李子萃取物样本一依照浓度为0.125mg/mL添加至分化完成后的细胞中，然后在37℃下培养7天。在7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基及样本。

对照组一：将本案例1的方式制备而成的对照样本A依照浓度为0.25mg/mL添加至分化完成后的细胞中，然后在37℃下培养7天。在7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基及样本。

对照组二：将本案例1的方式制备而成的对照样本A依照浓度为0.125mg/mL添加至分化完成后的细胞中，然后在37℃下培养7天。在7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基及样本。

空白组：不作任何处理，即不额外添加其他化合物至含分化后的脂肪细胞的分化培养基中，在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。

接下来，依据下列步骤进行油红O的染色。于7天细胞处理后，将培养基移除，以1mL的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline,PBS)清洗脂肪细胞两次，再加入1mL的10％甲醛并于室温下反应30分钟以固定脂肪细胞。接着移除甲醛后以1mL的PBS轻轻地清洗脂肪细胞两次，接着于每孔细胞内加入1mL的60％异丙醇，反应1分钟后，移除异丙醇并加入1mL的油红O作用溶液与脂肪细胞反应，于室温下反应1小时，接着移除与脂肪细胞作用的油红O作用溶液并迅速地以1mL的60％异丙醇进将脂肪细胞行脱色5秒钟，其中，将空白组、对照组二及实验组二使用显微镜观察并拍摄细胞，如图6所示。

后续，将染色后的各组再依下列步骤进行油红O的定量。加入100％异丙醇于染色的细胞中，并置于振荡器上反应10分钟以溶解油滴，接着取100μL至96孔培养盘中，以测量ELISA读取仪(BioTek)读取各组的OD510nm读值。其中，利用Excel软件进行student t-test以决定两个样本群体之间是否在统计上具有显着差异，如图7所示(图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显着)。

5.3.测试结果

请参阅图6。对照组二经由熟成的红色李子的萃取物的处理之后可见油滴数量明显少于空白组。而实验组二经由本案李子萃取物的处理之后可见油滴数量显着更少于空白组及对照组。换言之，成熟的脂肪细胞经由李子萃取物的作用可以非常有效降低脂肪细胞内所堆积的油脂。

请参阅图7。以空白组的脂质油滴堆积量为1的情况下，则实验组一的相对脂质油滴堆积量为0.78，也就是相对于空白组，在李子萃取物浓度为0.25mg/mL的情况下，可以减少22％的脂肪堆积。实验组二的相对脂质油滴堆积量只有0.76，也就是相对于空白组，在李子萃取物浓度为0.125mg/mL的情况下，可以减少24％的脂肪堆积。对照组一的相对脂质油滴堆积量为0.63，也就是相对于空白组，在成熟李子萃取物浓度为0.25mg/mL的情况下，可以减少37％的脂肪堆积。对照组二的相对脂质油滴堆积量为0.82，也就是相对于空白组，在成熟李子萃取物浓度为0.125mg/mL的情况下，可以减少18％的脂肪堆积。由此可知，李子萃取物能有效地抑制脂肪累积，具有减少受体的脂肪形成的功能，进而达成减肥的功能。

例6：丙酮酸生成速率测试

于此，通过代谢最终产物丙酮酸(Pyruvate)量以判断小鼠肌母细胞C2C12以李子萃取物处理后的基础代谢率变化。

6.1.材料与仪器

实验用细胞：小鼠肌母细胞C2C12，取自生物资源保存及研究中心BCRC；Cat.60083。

培养基：将Dulbecco改良培养基(Dulbecco’s ModifiedEagle’sMedium，DMEM，购自Gibco，12100-046)添加额外成分使其含有10vol％FBS(fetal bovine Serum，购自Gibco，10437-028)及1％抗生素(购自Gibco，Cat.15240-062)。

实验用溶液：磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液，购自Gibco，产品编号10437-028)、马血清(购自Gibco，产品编号Cat.16050-122)、10X DPBS(购自Gibco，产品编号Cat.14200-075)、台盼蓝死细胞染色剂(购自Lonza，产品编号Cat.17-942E)、胰蛋白酶(Trypsin-EDTA：10XTrypsin-EDTA，购自SIGMA，产品编号Cat.59427C，以1X PBS溶液稀释10倍)、Bradfordprotein assay reagent(购自Bio-Rad，产品编号Cat.500-0006)、PyruvateColorimetric/Fluorometric Assay Kit(购自BioVision，产品编号Cat.K609)。

6.2.测试流程

首先，将小鼠肌母细胞C2C12以每孔1×10

将分化完成的细胞分为三组：空白组、对照组与实验组。

实验组：将本案例1的方式制备而成的李子萃取物样本一依照浓度为0.03125mg/mL添加至分化完成后的细胞中，然后在37℃下培养48小时。

对照组：将本案例1的方式制备而成的对照样本A依照浓度为0.03125mg/mL添加至分化完成后的细胞中，然后在37℃下培养48小时。

空白组：不作任何处理，即不额外添加其他化合物至含分化后的脂肪细胞的分化培养基中，在37℃下培养小时。

接下来，各组以1mL的1X PBS溶液润洗2次，再以100μL/well Pyruvate AssayBuffer裂解细胞，再以10,000g于4℃离心10分钟，并收集上清液。

同时制作比色法所需的标准曲线：将丙酮酸标准品浓度稀释至1nmol/μL，以每孔50μL体积制备浓度0、2、4、6、8、10nmol/孔的标准曲线。

再将各组待测样本加入50μL反应混合物(来自Pyruvate Colorimetric/Fluorometric Assay Kit)置于室温反应30分钟。反应后进行Pyruvate含量的测定(测定570nm的吸光值)。

6.3.实验结果

参阅图8可知，实验组的C2C12细胞的丙酮酸生成有显着提升，其提升约10％，显示本发明的李子萃取物可有效提升细胞的基础代谢率，而基础代谢率增加意味着肌肉细胞生成率提升，且脂肪细胞堆积降低，以致细胞提升糖解作用的效率。

糖解作用(glycolysis)是将葡萄糖转化成丙酮酸(CH3COCOO-+H+)的代谢途径，在这个过程中所释放的自由能被用于形成高能量化合物ATP和NADH，细胞中的丙酮酸生成量提升意味着糖解作用的效率上升，使细胞更有效率的产生能量，同时造成基础代谢率上升，故李子萃取物可有效提升糖解作用的效率，其有益于预防及改善代谢不佳的相关症状。

例7：人体测试

7.1.样品：采用例1所制备的李子萃取物样本二。

7.2.受试者：8位受试者。其中，各受试者为具有便秘困扰或体脂大于30％者。意即，本次测试挑选新陈代谢率较差的受试者。

7.3.测试项目：体重变化、腰围变化及肠胃道状态问卷调查。

7.4.测试方式：

令8位受试者每日摄取2克的李子萃取物二，并摄入2周。于饮用前(即第0周，又称对照组)及饮用2周后(即第2周，又称为实验组)分别进行量测和问卷调查。

其中，以体重机量测受试都的体重(kg)。

其中，利用皮尺分别量测受试者的腰围(cm)。

其中，分别于第0周及第2周由受试者填写肠胃道状态问卷，问卷中对于肠胃道相关的各种状况进行调查，其调查及计分方式如下表二。调查各受试者依据服用李子萃取物前以及服用李子萃取物后的2周间的实际情况，分别判断是否有下列症状发生。其中，1分是指完全不同意，2分是指不同意，3分是指部分不同意，4分是指尚可，5分是指部分同意，6分是指同意，7分是指完全同意。

表二

下面图式中使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，并在Excel软件中以单尾学生t检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显着差异。图式中「*」是指其p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01。当「*」越多时，代表统计上相对于空白组的差异越显着。

7.5.测试结果：

请参阅图9。经过2周的每日摄入2克李子萃取物后，8位受试者的平均体重从64.3kg(第0周)在维持日常饮食与运动量的情况下降至63.9kg(第2周)。使用本发明的李子萃取物仅2周，其前后的平均体重差异达0.4kg。意即，每日摄入2克李子萃取物可以有效降低体重，提升新陈代谢。

请参阅图10。经过2周的每日摄入2克李子萃取物后，8位受试者的平均腰围从78.9cm(第0周)在维持日常饮食与运动量的情况下降至78.6cm(第2周)。可知，使用本发明的李子萃取物仅2周，其前后的平均腰围差异达0.3cm。意即，每日摄入2克李子萃取物可以有效降低腰围，减少腹部脂肪堆积，提升新陈代谢。

参考图11。其中，对于第1题所述整体肠胃道不适的情况，受试者对于表二中全部题目所评分数的总和的平均(意即除以7)由25.4分降到13.5分，意即受试者自评已回到并无不适的情况。每日摄入2克李子萃取物可以有效降改善整体肠胃不适的情况，并且改善率达到46.9％。

参考图12。其中，对于第2题所述上腹部饱胀感情况，受试者所评分数的总和由35分降到15分。

参考图13。其中，对于第3题所述恶心感的情况，受试者所评分数的总和由34分降到20分。

参考图14。其中，对于第4题所述反胃的情况，受试者所评分数的总和由25分降到10分。

参考图15。其中，对于第5题所述肠道蠕动变快的情况，受试者所评分数的总和由37.5分提升到62.5分。

参考图16。其中，对于第6题所述排便省力的情况，受试者所评分数的总和由25分提升到75分。

参考图17。其中，对于第7题所述粪质变软的情况，受试者所评分数的总和由12.5分提升到87.5分。

由上述可知，各题目的平均分数都有改善，意即各受试者平均而言，对于上述症状都有明显的改善。整体新陈代谢低落、肠胃不适的感受度下降，受试者均能明显感受到其身体机能的提升。

由此可知，长期使用李子萃取物可降低体重、减少腰围、避免上腹部饱胀感、减少恶心感或反胃、增加肠道蠕动次数、使排便更省力、粪质变软，减少整体肠胃道不适等，即李子萃取物具明显的提升身体消化机能的功效。

综上所述，根据任一实施例的李子萃取物，其可以提升身体机能。根据任一实施例的李子萃取物，其可以提升减脂相关基因表现量，借由提升LIPE基因表现量达到提升身体机能的用途。根据任一实施例的李子萃取物，其可以抑制细胞内脂肪油滴堆积，借由抑制细胞内脂肪油滴堆积达到提升身体机能的用途。根据任一实施例的李子萃取物，其可以提升新陈代谢效率，借由提升丙酮酸生成效率达到提升身体机能的用途。根据任一实施例的李子萃取物，其借由减少体重及/或减少腰围达到提升身体机能的用途。根据任一实施例的李子萃取物，其借由改善肠胃道机能达到提升身体机能的用途。并且，根据任一实施例的李子萃取物，在每日服用李子萃取物2克的情况下即能有效达到提升身体机能的用途。

虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神所作些许的更动与润饰，皆应涵盖于本发明的范畴内，因此本发明的保护范围当视后附的专利范围所界定者为准。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

【序列表】

<110> 百岳特生物技术（上海）有限公司

<120> 李子萃取物用于制备提升身体机能组合物的用途

<150> US 63/153,955

<151> 2021-02-26

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LIPE -F

<400> 1

tggcacacca ttttgacctg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LIPE -R

<400> 2

ttgcggttag aagccacata g 21