一种敲减CCNA2基因的方法与敲减CCNA2基因在制备治疗肺腺癌药物中的应用

摘要

本发明涉及一种敲减CCNA2基因的方法与敲减CCNA2基因在制备治疗肺腺癌药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明的敲减方法包括如下步骤：(1)将细胞接种于无双抗培养基中培养20～28h，得到待转染的细胞；(2)将待转染的细胞在CCNA2基因干扰液中培养4～6h后，转入无双抗培养基中继续培养18～44h。按照本发明的敲减方法敲减肺腺癌细胞中CCNA2基因，可以抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力，为后期研发治疗肺腺癌的药物提供依据。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种敲减CCNA2基因的方法与敲减CCNA2基因在制备治疗肺腺癌药物中的应用。

背景技术

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，死亡率位居全球恶性肿瘤之首。组织病理学上肺癌分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌(small celllung cancer,SCLC)。NSCLC约占肺癌的83％，而肺腺癌(lung adenocarcinoma cell,LUAD)是NSCLC最常见的病理类型。LUAD的发生是多因素、多个基因参与、多阶段形成的过程。随着分子生物学技术的发展，临床上可以根据异常表达的分子来鉴别良、恶性肿瘤。研究LUAD中分子的异常表达有利于为LUAD的分子病理诊断、临床预后和治疗方案的选择提供新的依据。

细胞周期蛋白A2(cyclinA2,CCNA2)是一种重要的细胞周期调节因子，参与有丝分裂的调控。研究发现，CCNA2在乳腺癌、卵巢癌和胃癌中均有高表达。但是现有技术并没有探究CCNA2在LUAD中的表达情况的方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种敲减CCNA2基因的方法与敲减CCNA2基因在制备治疗肺腺癌药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种敲减细胞中CCNA2基因的方法，包括如下步骤：

(1)将细胞接种于无双抗培养基中培养20～28h，得到待转染的细胞；

(2)将待转染的细胞在CCNA2基因干扰液中培养4～6h后，转入无双抗培养基中继续培养18～44h。

作为优选，所述细胞为肺腺癌细胞。

作为优选，所述无双抗培养基为含9～11vt％胎牛血清的RPMI 1640培养基。

作为优选，所述干扰液包括如下体积比的组分：

Lipofectamine 3000：siRNA：优化opti-MEM培养基为4～6:4～6：1988～1992；

所述优化opti-MEM培养基为不含胎牛血清的opti-MEM培养基。

本发明还提供了敲减肺腺癌细胞中的CCNA2基因在制备治疗肺腺癌药物中的应用。

本发明还提供了所述的方法敲减肺腺癌细胞中CCNA2基因在制备治疗肺腺癌药物中的应用。

本发明提供了一种敲减CCNA2基因的方法与敲减CCNA2基因在制备治疗肺腺癌药物中的应用。

本发明通过转染小干扰RNA构建敲减CCNA2的肺腺癌细胞株，发现敲低CCNA2后能显著抑制H1975细胞和H1299细胞的增殖、侵袭和迁移能力，使细胞周期中G2期细胞比例增加。过表达CCNA2能明显促进A549细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

并且本发明通过体外实验验证了CCNA2在肺腺癌组织中的表达水平明显高于正常肺组织；高表达CCNA2的肺腺癌患者的总体生存率低，CCNA2表达的高低与性别和肿瘤的转移有关。还通过免疫细胞浸润相关分析揭示了CCNA2表达的水平与B淋巴细胞和CD4

上述结果可以看出CCNA2基因与肺腺癌有关，敲除肺腺癌中的CCNA2基因后可以显著抑制肺腺癌细胞的增殖，这为后期治疗肺腺癌的药物提供依据。

附图说明

图1为LUAD与正常组织中CCNA2在mRNA和蛋白水平上的表达差异图(其中a表示CCNA2 mRNA在LUAD组织和正常组织的表达差异，b表示LUAD中CCNA2蛋白表达水平，c表示正常肺组织中CCNA2蛋白表达水平)。

图2为LUAD患者高低风险组的生存分析图(其中a表示TCGA数据库中LUAD患者高低风险组的生存分析，b表示GEO数据库中LUAD患者高低风险组的生存分析)。

图3为CCNA2在不同性别、临床病理分期的表达差异图(其中a表示TCGA数据库中分析CCNA2在不同性别中的表达差异，b表示TCGA数据库中分析CCNA2在不同Stage分期中的表达差异，c表示TCGA数据库中分析CCNA2在不同T分期中的表达差异，d表示TCGA数据库中分析CCNA2在不同N分期中的表达差异，e表示GEO数据库中分析CCNA2基因在不同性别中的表达差异，f表示GEO数据库中分析CCNA2基因在不同T分期中的表达差异，g表示GEO数据库中分析CCNA2基因在不同N分期中的表达差异)。

图4为CCNA2在LUAD组的单因素cox回归分析和多因素cox回归分析图(其中a表示单因素cox回归分析，b表示多因素cox回归分析)。

图5为CCNA2共表达基因筛选图(其中a表示共表达差异基因火山图，b表示共表达差异基因热图分析)。

图6为CCNA2共表达基因功能富集分析图(其中表示CCNA2共表达基因GO富集分析，b表示CCNA2共表达基因KEGG富集分析)。

图7为STRING数据库可视化CCNA2共表达基因蛋白-蛋白互作网络图。

图8为CCNA2基因与免疫细胞浸润和免疫检查点基因的相关性分析图(其中a表示CCNA2基因与免疫细胞浸润相关性分析，b表示CCNA2基因与免疫检查点基因的相关性分析)。

图9为CCNA2在LUAD细胞系和正常细胞系中的差异表达图(其中a表示RT-qPCR检测CCNA2 mRNA表达差异，b表示Western Blot方法检测CCNA2蛋白水平表达差异)。

图10为敲低CCNA2后H1975细胞和H1299细胞中CCNA2的相对表达水平图(其中a表示敲低CCNA2后H1975细胞和H1299细胞CCNA2mRNA水平表达情况，b表示敲低CCNA2后H1975细胞和H1299细胞CCNA2蛋白水平表达情况)。

图11为EdU细胞增殖实验观察验证CCNA2敲低组和对照组细胞增殖比例图。

图12为划痕实验检测CCNA2敲减后在H1299、H1975细胞系中的迁移情况图。

图13为Transwell实验检测敲减CCNA2后对H1299、H1975细胞系的迁移能力和侵袭能力图(其中a表示敲减CCNA2后H1299细胞的迁移能力，b表示敲减CCNA2后H1975细胞的迁移能力，c表示表示敲减CCNA2后H1299细胞的侵袭能力，d表示敲减CCNA2后H1975细胞的侵袭能力)。

图14为慢病毒感染A549细胞系过表达CCNA2的感染情况图(其中a表示过表达CCNA2的效率，b表示慢病毒感染A549细胞72小时后，荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达情况)。

图15为EdU细胞增殖实验检测CCNA2过表达组和对照组细胞增殖比例图。

图16为Transwell实验检测过表达CCNA2后对A549细胞系的迁移能力和侵袭能力的影响图(其中a表示细胞迁移能力，b表示细胞侵袭能力)。

具体实施方式

本发明提供了一种敲减细胞中CCNA2基因的方法，包括如下步骤：

(1)将细胞接种于无双抗培养基中培养20～28h，得到待转染的细胞；

(2)将待转染的细胞在CCNA2基因干扰液中培养4～6h后，转入无双抗培养基中继续培养18～44h。

在本发明中，所述细胞为肺腺癌细胞，优选为H1975、H1299或A549细胞；所述H1975、H1299或A549细胞均购自武汉普诺赛生命科技有限公司)。

在本发明中，所述无双抗培养基为为含9～11vt％胎牛血清的RPMI 1640培养基，优选为含有10vt％胎牛血清的RPMI 1640培养基。

在本发明中，步骤(1)所述培养的时间优选为24h。所述培养后得到的待转染细胞的密度优选为60～80％。

在本发明中，所述干扰液包括如下体积比的组分：

Lipofectamine 3000：siRNA：优化opti-MEM培养基为4～6:4～6：1988～1992，优选为5:5:1990；

所述优化opti-MEM培养基为不含胎牛血清的opti-MEM培养基。

本发明还提供了敲减肺腺癌细胞中的CCNA2基因后得到的基因片段在制备治疗肺腺癌药物中的应用。

本发明还提供了所述的方法敲减肺腺癌细胞中CCNA2基因后得到的基因片段在制备治疗肺腺癌药物中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

LUAD与正常组织中CCNA2在mRNA和蛋白水平上的表达差异

GEPIA数据库是一个综合性的数据库，利用生物信息学方法分析肿瘤中异常基因的表达，从而深入挖掘新型治疗靶点和肿瘤分子标记物。登录GEPIA数据库网站，在单基因分析模块(Single GeneAnalysis)中输入基因名称CCNA2进入相关页面，肿瘤类型选择LUAD，设定P值<0.01，log

图1显示，CCNA2在LUAD组织的表达水平显著高于正常肺组织。说明CCNA2的表达水平与LUAD有关。

实施例2

LUAD中基于CCNA2基因的生存分析及临床特征相关性分析

首先在TCGA数据库下载LUAD患者临床资料及其对应的mRNA表达数据。对临床数据进行整理，删除生存时间小于30天的临床样本及部分临床数据缺失样本。利用Perl语言将数据进行合并，得到LUAD患者的生存数据及其对应的CCNA2 mRNA表达数据。在R studio程序中运用“survival R”包进行生存分析，根据CCNA2基因在LUAD患者中表达的中位数，将患者分为高风险组和低风险组，并绘制高低风险组的生存分析曲线，分析两组总体生存时间的差异。为了进一步验证TCGA数据分析的可靠性，我们从GEO数据库下载LUAD患者临床数据及CCNA2基因表达数据进行验证，按上述相同方法绘制生存曲线。结果如图2所示。

为了进一步研究在LUAD中CCNA2基因表达与临床及病理特征的相关性，利用Perl语言将CCNA2基因表达与LUAD患者的年龄、T分期和N分期等临床数据合并，在R studio程序中使用Wilcoxon检验来分析CCNA2的表达与年龄、T分期和N分期等临床特征之间的相关性。结果如图3所示。

图2～3显示，LUAD患者中CCNA2高表达组患者的总体生存率显著降低。男性患者中CCNA2基因表达高于女性，随着肿瘤大小和淋巴结转移数目的增加，CCNA2的表达也升高。这说明CCNA2的表达程度与肺腺癌患者的生存率、患者的性别、患者的分期有关。

实施例3

CCNA2共表达基因功能富集分析

采用GEO中GSE68465数据集进行CCNA2共表达基因筛选、蛋白互作分析及功能富集分析。下载数据并利用Perl语言整理数据得到LUAD患者的所有基因表达数据，在R studio程序使用limma R包进行共表达基因筛选。利用Bayesian(贝叶斯检验)进行统计学分析计算P值。本研究设定P<0.05，logFC绝对值>0.5。在R Studio中使用clusterProfiler包进行功能富集分析，研究对象为CCNA2共表达差异基因，对其进行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes)通路分析，P<0.05被认为具有统计学意义。我们使用STRING在线数据库来分析CCNA2及其共表达基因间的相互作用。结果如图4～7。

图4～7显示，差异基因主要富集在DNA复制、核质运输、细胞周期、细胞衰老、细胞凋亡、P53信号通路、内质网中蛋白质加工等功能通路。说明CCNA2参与细胞周期的所有活动。

实施例4

免疫细胞浸润及免疫检查点相关性分析

利用TIMER2.0在线数据库进行免疫细胞浸润及免疫检查点基因相关性分析。TIMER2.0是一个肿瘤免疫相关的数据库，它可以分析基因表达和某一类免疫细胞浸润的相关性、基因拷贝数的变异和免疫细胞的相关性；免疫浸润细胞对患者预后的影响。在TIMER2.0数据库的免疫研究部分，选择目的基因CCNA2和免疫细胞，得到CCNA2基因表达量与免疫细胞浸润估计值的相关性分析散点图。TIMER2.0在线数据库可以进行两个基因的相关性分析，我们利用该功能来进行CCNA2与免疫检查点基因的相关性分析。结果如图8所示。

图8显示，免疫细胞浸润相关性分析揭示CCNA2表达的水平与B淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞浸润程度呈负相关，和CD8+T淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的浸润程度呈正相关关系。CCNA2与检查点相关基因CTLA-4、PD1(PDCD1)、TIM3(HAVCR2)、LAG3、TIGIT的表达呈正相关。

实施例5

取人支气管上皮细胞株16HBE和LUAD细胞株H1975、H1299和A549，利用RT-qPCR和Western Blot检测CCNA2在上述所述的细胞株中的表达水平。检测结果如图9所示。

所述支气管上皮细胞株16HBE和LUAD细胞株H1975、H1299和A549均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

图9显示，与正常人支气管上皮细胞株16HBE相比，LUAD细胞株H1975、H1299和A549中CCNA2表达升高。

实施例6

将H1975和H1299细胞株接种于六孔板上，用无双抗培养基培养细胞24h，此时细胞的密度为75％，得到待转染的细胞。吸弃6孔细胞培养板中的培养液，吸取1～2mL无菌PBS清洗板中细胞。

配制工作液：每孔准备2个无RNA酶的1.5ml无菌EP管，记为管1和管2，两管各加入245μL优化opti-MEM培养基；其中管1再加入5μLLipofectamine 3000细胞转染试剂，管2再加入5μL siRNA，并分别混匀。此时管1与管2中体系的体积均为250μL，同时室温静置5分钟。将管1中的体系与管2加入到同一个无RNA酶的1.5mL无菌EP管中并混匀，此时混合体系的体积为500μL，室温静置20分钟。将上述步骤中的体系(500μL)加入到6孔细胞培养板中，再加1.5mL优化Opti-MEM培养基，充分混匀后放入细胞培养箱中培养5小时后，换用Opti-MEM培养基继续转染20h。工作液利用管2中加入5μLsiNC替换5μL siRNA为对照，其余步骤相同。转染结束后通过RT-qPCR和WesternBlot方法在mRNA水平及蛋白水平分别检测目的基因的干扰效率。结果如图10所示。

所述无双抗培养基包括：为含有10vt％胎牛血清的RPMI 1640培养基。

所述优化Opti-MEM培养基为不含胎牛血清的Opti-MEM培养基。

图10显示，敲低CCNA2后能显著抑制H1975细胞和H1299细胞的表达水平。

实施例7

EdU细胞增殖实验

准备物品：96孔板、完全培养基、EdU试剂盒、PBS、渗透剂(含0.5％Triton X-100的PBS)、甘氨酸溶液、细胞固定液(含4％多聚甲醛的PBS)。

准备实验细胞：取对数生长期细胞，以每孔4×10

EdU标记：稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量的50μM EdU培养基。在96孔板中每孔中加入100μL 50μM EdU培养基，放置于培养箱中孵育2小时后弃掉培养基。PBS清洗细胞2次，每次5min，将未渗入DNA的EdU培养基洗脱。

细胞固定：向96孔板中每孔加入50μL细胞固定液，室温孵育30分钟，弃固定液。每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液(目的是中和过量的醛基，保证染色反应体系)。加入100μLPBS，清洗5分钟后弃PBS。每孔加入100μL渗透剂孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟。

Apollo染色：每孔加入100μL的1X

DNA染色：稀释试剂F，制备适量1倍Hoechst33342反应液，避光保存；每孔加入100μL反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；每孔每次加入100μLPBS清洗3次。

随机选取的五个视野中计算红色和蓝色荧光的细胞数，增殖率为红色细胞总数/蓝色细胞总数×100％，然后进行统计计算。结果如图11所示。

图11显示，敲减CCNA2的细胞株的细胞增殖率明显低于对照细胞株的细胞增殖效率。说明敲减CCNA2后能抑制肺腺癌细胞株增殖。

实施例8

划痕实验检测敲减CCNA2后的H1975细胞和H1299细胞的迁移情况，Transwell实验检测敲减CCNA2后对H1299、H1975细胞系的迁移能力和侵袭能力的影响，以正常H1299和H1975细胞为对照。结果如图12～13所示。

划痕实验的步骤为：

(1)培养板划线标记:用marker笔在6孔板背后画横线(用直尺比着)，每个孔划三条粗细一致的划痕，每条线均匀且平行。

(2)细胞铺板：在孔内均匀接种5×10

(3)细胞划线：待六孔板内的细胞长满后用100μL枪头垂直孔板背后的黑线划痕，使划痕与标记线相交。

(4)清洗细胞，除掉划下的细胞：用PBS清洗细胞3次，洗掉被划下的细胞，使留下的间隙肉眼即清晰可见，然后每孔加入2mL不含胎牛血清的RPMI 1640培养基

(5)细胞培养与观察：实验组和对照组各取4个观察点，在10×目镜下观察0h和48h细胞的生长情况并拍照。

Transwell实验的步骤为：

(1)准备细胞，在倒置显微镜下观察细胞生长状态。

(2)制备细胞悬液：将原培养基吸弃，用无菌PBS清洗细胞，每孔加入胰酶1mL进行消化，3～5min后细胞不再贴壁，则用等量RPMI 1640培养基止消化，吹打细胞悬液后将其转移至15mL离心管中，离心后得到细胞沉淀。用不含胎牛血清的RPMI 1640培养基悬细胞，调整细胞密度并进行细胞计数。

(3)接种细胞：取细胞悬液100μL加入Transwell小室，每个小室30000个细胞。24孔板下室加入600μL含20％胎牛血清的培养基。将接种好的细胞放于37℃含5％CO

(4)培养24h后将细胞取出，用镊子取出小室，用移液枪吸掉原培养液体，并用无菌PBS冲洗小室。

(5)甲醇固定：在下室中加入甲醇700μL，放回上室固定5min后用移液枪吸弃甲醇，用PBS清洗两遍。

(6)染色：在下室加入0.1％结晶紫700μL，放入上室，室温避光条件下染色30min。

(7)取出小室清洗结晶紫染液，清洗后用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。

(8)在倒置显微镜下观察细胞的迁移情况，在显微镜下拍摄小室底部细胞图像，随机拍摄三个视野观察细胞。

(9)采用Image J软件进行细胞计数，t检验进行统计学分析。

Transwell细胞侵袭实验

(1)配胶：将Matrigel基质胶与无血清培养基按1：8比例配置，配好后迅速置于冰上。将配好的基质胶加入小室中，每孔加入50μL，放置于37℃，5％CO

(2)制备细胞悬液：同Transwell细胞迁移实验中(2)步骤

(3)接种24孔板：同Transwell细胞迁移实验中(3)步骤

(4)培养24h后将细胞取出，用镊子取出小室，用移液枪吸掉原培养液体，并用无菌PBS冲洗小室。

(5)甲醇固定：在下室中加入甲醇700μL，放回上室固定5min后用移液枪吸弃甲醇，用PBS清洗两遍。

(6)染色：在下室加入0.1％结晶紫700ul，放入上室。室温避光条件下染色30min。

(7)取出小室清洗结晶紫染液，清洗后用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS清洗。

(8)在倒置显微镜下观察细胞的迁移情况，打开电脑，在显微镜下拍摄小室底部细胞图像，随机拍摄三个视野观察细胞。

(9)采用Image J软件进行细胞计数，t检验进行统计学分析。

图12～13显示，敲减CCNA2后的H1975细胞和H1299细胞系的迁移能力和侵袭能力显著低于正常H1975细胞和H1299细胞。说明敲减CCNA2能抑制肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力。

实施例9

慢病毒感染细胞

准备物品：将实验所需酒精灯、打火机、无菌离心管、微量移液枪、无菌枪头、巴氏滴管、细胞培养基、胰蛋白酶、6孔细胞培养板、病毒液、病毒增强液等放入超净工作台，紫外线照射30分钟。

接种细胞：在慢病毒感染前将A549细胞铺到6孔板中，37℃培养20小时，待细胞密度至25％进行慢病毒感染。

慢病毒感染：从冰箱取出病毒，置于冰上缓慢融化。吸掉各孔中上清液，根据细胞MOI及病毒滴度，加入相应病毒量和感染增强液，RT-qPCR方法检测感染效率，结果如图14所示。计算公式为(MOI×细胞数目)/病毒滴度。

细胞培养：37℃培养16小时，更换为完全培养基，继续培养。感染后72小时，荧光表达丰度较高时，使用荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达情况。结果如图14所示。

以正常A549细胞为对照检测正常细胞的表达情况，结果如图14所示。

稳定株筛选：慢病毒感染50小时后细胞达到72％融合度，将细胞继续培养于含适当嘌呤霉素的培养液中，空细胞加Puromycin全部死亡，剩下的细胞为成功感染病毒的细胞。待细胞长满后进行传代，反复多次用含嘌呤霉素的培养基筛选，直至细胞不再死亡，得到稳定细胞株。

图14显示，慢病毒感染A549细胞过表达CCNA2后的，感染效率较正常细胞增加，荧光蛋白表达情况也增加。说明过表达CCNA2后提高了肺腺癌细胞的表达情况。

利用实施例7的EdU细胞增殖实验检验过表达CCNA2组和正常对照组细胞的增殖情况。结果如图15所示。

根据实施例8的Transwell实验检验过表达CCNA2组和正常对照组细胞的迁移能力和侵袭能力的影响。结果如图16所示。

由以上实施例可知，本发明提供了一种敲减CCNA2基因的方法与敲减CCNA2基因在制备治疗肺腺癌药物中的应用。利用本发明的方法敲除肺腺癌中的CCNA2基因后可以显著抑制肺腺癌细胞的增殖，迁移和侵袭，为后期治疗肺腺癌的药物提供依据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。