一株鸭沙门氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其在防治鸭沙门氏菌感染的疾病中的应用

摘要

本发明公开了一株鸭沙门氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其在治防治鸭沙门氏菌感染的疾病中的应用，该噬菌体被命名为PYC03，保藏编号为CGMCCNo.22370，于2021年4月12日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，该噬菌体对鸭源沙门氏菌表现出强裂解性、宽裂解谱的特点，具有降低鸭群死亡率、保持肉质的新鲜度以及良好的清除鸭肠道内沙门氏菌的作用，可被用于制备治疗或预防鸭沙门氏菌感染的疾病的药物、环境消毒剂、饲料和水添加剂、食品保鲜剂和检测试剂盒等，在解决鸭沙门氏菌感染的同时，避免了由于使用抗生素带来的抗生素残留和病原菌耐药性的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种鸭沙门氏菌噬菌体及其在防治鸭沙门氏菌感染的疾病中的应用。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是一种常见的人兽共患病原菌，WHO将沙门氏菌列入具有严重危害的食物传播性病原。据资料统计，由沙门氏菌引起的食品安全事故占我国细菌性食物中毒的70％～80％。由此可见，沙门氏菌等微生物污染已对我们的食品安全构成了主要的威胁。

鸭沙门氏菌病是指由沙门氏菌属的任何一个或多个成员引起的鸭急性或慢性病的总称。引起发生沙门氏菌病的病原菌种类较多，它们都属于沙门氏菌属中的各血清群，常见的有鸭伤寒沙门氏菌、鸭沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等。本病一年四季均可发生，对雏鸭具有高度的敏感性和致病性，一般3周龄以内的雏鸭最易发病死亡，死亡率为20％～80％，耐过者发育迟缓，增重缓慢，饲料报酬下降，成年鸭感染后多成为带菌者，是鸭最严重的细菌性传染病之一。在自然界中，家禽是沙门氏菌最主要的贮存者，污染的禽肉和蛋与人类沙门氏菌病的发生密切相关，因而鸭沙门氏菌病的预防控制对促进养鸭产业发展，保障食品安全，维护人类健康具有重要的意义。

噬菌体是自然界中最丰富的生物之一，在地球上大约蕴藏着10

目前，噬菌体已经被逐步开发，作为杀菌剂或药物已经应用于部分领域，如对鸡白痢的防治。江苏省农业科学院在2011年申请的公开号为CN102296051A的专利中公开了一株强裂解性噬菌体PSPu-4-116，可应用于高效抑制鸡白痢沙门氏菌。华中农业大学的公开号为CN110305851A的专利公开了一种宽裂解谱的鸡白痢沙门氏菌噬菌体Pu20及其在液蛋中的应用，其于公开号为CN110241091A的另一件专利中公开了另一株都柏林沙门氏菌噬菌体D1-2及其在液蛋样品中的应用。申请人于2018年申请的公告号为CN108359644B的专利公开了一株沙门氏菌噬菌体SP4，该噬菌体对鸡白痢沙门氏菌的裂解率高达95.83％，对鸡源沙门氏菌病的防治效果很突出。申请人于2020年申请的公开号CN111254121A的专利中又公开了另一株耐高温性能优异的沙门氏菌噬菌体SPP11及其在防治鸡群沙门氏菌病中的应用，鸡源沙门氏菌包括鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和鸡肠炎沙门氏菌，由此可见，目前噬菌体已经被广泛开发用于鸡沙门氏菌病的防治。

但是，目前还没有出现专门针对鸭沙门氏菌具有高裂解性能的鸭沙门氏菌噬菌体，现有噬菌体类产品难以高效用于防治鸭沙门氏菌导致的疾病，因此，现有技术有待进一步改进。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一株新沙门氏菌噬菌体PYC03及其应用，上述噬菌体可被用于制备治疗或预防鸭沙门氏菌感染的疾病的药物、环境消毒剂、饲料和水添加剂、食品保鲜剂和检测试剂盒等，在解决鸭沙门氏菌感染的同时，避免了由于使用抗生素带来的抗生素残留和病原菌耐药性的问题。

本发明的技术方案具体如下：

第一方面，本发明提供了自山东某场的鸭粪中分离得到的一株具有广谱强裂解性的鸭沙门氏菌噬菌体，该噬菌体被命名为PYC03，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年4月12日，保藏编号为CGMCC No.22370。

该噬菌体PYC03具有呈多面体的头部结构和无收缩性的尾部，头部宽60nm，长68nm，尾部长约132nm，根据病毒分类国际委员会(ICTV)的分类方法，其形态符合长尾噬菌体科的特征，属于长尾噬菌体。

第二方面，本申请还提供一种噬菌体组合物，其包括鸭沙门氏菌噬菌体PYC03。在实际应用中，为了进一步拓宽噬菌体制剂的裂解谱，充分发挥不同噬菌体的裂解谱的差异，进行优势互补，可将上述鸭沙门氏菌噬菌体PYC03和其他噬菌体进行组合使用，如与同为沙门氏菌噬菌体的SP4、PYC03中的一种或两种进行组合使用，扩大杀菌谱，尽可能杀灭环境中的所有沙门氏菌，用于沙门氏菌病的防治。此外，也可将上述鸭沙门氏菌噬菌体PYC03与其他不同种类的噬菌体(抑制引发同类疾病的不同病原菌)配合，用于同一类疾病的防治。

第三方面，本申请还提供了上述沙门氏菌噬菌体PYC03或上述噬菌体组合物在制备防治鸭源沙门氏菌噬菌体感染的疾病中的用途。所述防治包括预防和治疗。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述组合物来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述组合物而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。

优选地，所述鸭源沙门氏菌选自鸭沙门氏菌、鸭伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌。

第四方面，本申请还提供一种噬菌体药物制剂，其有效成分包括前述的鸭沙门氏菌噬菌体或噬菌体组合物；优选的，所述噬菌体药物制剂还包括其他抑菌或杀菌活性成分；所述药物制剂形式为口服给药剂型、外用剂型或肠外给药剂型。

可选地，所述噬菌体药物制剂中还包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、各类的培养基等。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当还与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂和口服剂型(例如，水性溶液、悬浮液和乳液、丸剂、胶囊、粒剂)和其他中间剂型，如冻干剂。

第五方面，本申请还提供一种环境消毒剂，其有效成分包括如上所述的沙门氏菌噬菌体PYC03或噬菌体组合物；优选地，噬菌体的浓度为10

可选地，环境消毒剂还包含其他用于环境中细菌抑制或消灭的活性成分；优选的，可应用环境消毒剂的环境包括饲料、水和养殖环境，所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。

第六方面，本申请还提供上述环境消毒剂在养殖场环境消毒中的应用，具体地，所述环境消毒剂可通过喷雾、浸泡的方式对养殖环境、饲养器具进行沙门氏菌的消毒，所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等。

第七方面，本申请还提供一种饮用水添加剂或者饲料添加剂，其有效成分包括上述的沙门氏菌噬菌体PYC03或噬菌体组合物；优选地，噬菌体的浓度为10

可选地，饮用水添加剂还包含其他用于水中病毒、细菌抑制或消灭的活性成分；所述饮用水添加剂的形式为液体剂型、粉末剂型或固体剂型，但不仅限于以上三种剂型。

第八方面，本申请还提供一种食品保鲜剂，其包括如上所述的沙门氏菌噬菌体PYC03或噬菌体组合物，将其喷洒于肉质表面，或者将鸭肉产品进行浸泡在加有食品保鲜剂的溶剂，都可抑制鸭产品中沙门氏菌的繁殖，达到保鲜效果。

第九方面，本申请还提供一种检测试剂盒，该试剂盒包括前述的沙门氏菌噬菌体。基于沙门氏菌噬菌体PYC03对宿主菌的裂解特异性，本发明的鸭沙门氏菌噬菌体可应用于鸭沙门氏菌的快速检测，包括但不限于以试纸、试纸盒等形式对鸭沙门氏菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，有效确保检测的灵敏度。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供一种烈性宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体，能够有效防治鸭沙门氏菌病，具有降低鸭群死亡率、保持肉质的新鲜度以及良好的清除鸭肠道内沙门氏菌的作用。该噬菌体可用作消毒剂活性成分、饲料和水添加剂、食品保鲜剂和检测试剂盒等，在解决鸭沙门氏菌感染的同时，避免了由于使用抗生素带来的抗生素残留和病原菌耐药性的问题。

2、本发明涉及的上述噬菌体从自然界中获得，易于进行工业化生产，由上述噬菌体制备而的药物或消毒剂不仅可降低成本，还具有绿色环保的优点。

附图说明

图1为鸭沙门氏菌噬菌体PYC03的噬菌斑图片；

图2为噬菌体PYC03的电镜图片；

图3为噬菌体PYC03的热稳定性测试结果；

图4为噬菌体PYC03的pH值稳定性测试结果；

图5为噬菌体PYC03的一步生长曲线；

图6为噬菌体PYC03对鸭舍中菌含量的影响；

图7为噬菌体PYC03对细菌生物膜形成的影响；

图8为噬菌体PYC03对肉质新鲜程度影响效果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1噬菌体的分离纯化

1、实验方法：取适量采自山东某养殖场的鸭粪样品。取少量样品加入肉汤培养基中，并向培养基中加入1株鸭沙门氏菌临床分离株新鲜菌液，将粪样-菌液混合物置于恒温摇床37℃，170rpm培养约12h，取培养液经0.22μm的无菌微孔滤膜滤过，得到噬菌体增殖液；将噬菌体原液通过10倍比稀释，取合适梯度噬菌体稀释液分别和1株沙门氏菌菌液1:1混合均匀，37℃孵育5min后，吸取200μL混合液置于上层琼脂(琼脂浓度为0.7％)中，混匀后迅速倾倒下层琼脂(琼脂浓度为1.5％)平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃培养箱倒置培养4～6h后，在沙门氏菌培养皿中获得形成噬菌斑的双层平板。将获得的沙门氏菌噬菌体命名为PYC03。

在形成噬菌斑的双层琼脂培养基挑取单个噬菌斑，并置于1mL的NB肉汤中于恒温摇床37℃，170rpm培养约30min得到噬菌体浸出液。取噬菌体浸出液与对应成斑的沙门氏菌(后面称为宿主菌)增殖液1:1混合均匀(37℃孵育5min)，吸取200μL置于上层琼脂，混匀后迅速倾倒下层琼脂平皿上，摇匀平置至培养基凝固，置于37℃培养箱倒置培养4～6h后，再次获得形成噬菌斑的双层平板。在形成噬菌斑的双层培养基上用灭菌镊子挑取单个噬菌斑置于1mL的LB肉汤中，于恒温摇床37℃，170rpm培养约30min得到噬菌体浸出液。重复以上步骤3次，得到纯化后的噬菌体浸出液，取等量纯化后的噬菌体浸出液与宿主菌增殖液于5mL液体NB培养基中，37℃，170rpm振荡培养，直至液体变清亮，将清亮液体11000rpm离心10min，取上清，使用0.22μm的无菌微孔滤膜滤过，得到噬菌体增殖液。

2、实验结果：如图1所示，沙门氏菌噬菌体PYC03在双层琼脂培养基平板上形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰可见，直径约1.75mm。

实施例2沙门氏菌噬菌体PYC03的形态学观察和鉴定

1、实验方法：取20μL噬菌体样本滴在带有碳涂布膜的铜网上，待其自然沉淀15min，用滤纸稍吸干后，再用2％(W/V)磷钨酸(PTA)染色1～2min，滤纸稍吸干，待干燥后，采用透射电子显微镜下进行观察拍照。

2、实验结果：如图2所示，噬菌体PYC03具有呈多面体的头部结构和无收缩性的尾部，头部宽60nm，长68nm，尾部长约132nm，根据病毒分类国际委员会(ICTV)的分类方法，本申请的噬菌体形态符合长尾噬菌体科的特征，属于长尾噬菌体。

实施例3沙门氏菌噬菌体PYC03的温度稳定性

1、实验方法：

将加有相同体积的5.2×10

2、实验结果及分析：

如图3所示，噬菌体PYC03在40℃、50℃和60℃作用60min后基本上保持原活性，70℃作用60min后，效价仍保持在1×10

实施例4沙门氏菌噬菌体PYC03的pH稳定性

1、实验方法：

取无菌试管中加入不同pH值(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的NB肉汤4.5mL，各三支，然后将试管置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μL的3.42×10

2、实验结果及分析

从图4可知，噬菌体PYC03在pH5.0～11.0范围内，其效价保持在10

实施例5沙门氏菌噬菌体PYC03的一步生长曲线

1、实验方法：

将感染复数为10的噬菌体增殖液和宿主菌新鲜增殖液各1mL，充分混匀(此时开始计时)，37℃孵育5min，13000rpm离心30s，用微量移液器尽量吸去上清，再用5mL NB肉汤洗涤1次(13000rpm离心30s)，弃上清。用预热的NB肉汤混悬沉淀(总体积为5mL)并充分混匀，迅速置于37℃摇床中170rpm振荡培养，在0时刻和每隔5min取出150μL，10000rpm离心1min，用NB肉汤做10倍倍比稀释后采用双层平板法测噬菌体效价，做3个平行，结果取平均值，以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，得到噬菌体PYC03的潜伏期、爆发期，计算出爆发量。

爆发量＝噬菌体爆发末期的总个数/爆发初期细菌的总个数

2、实验结果及分析

从图5的结果可知，噬菌体PYC03感染宿主菌后，在10min内效价基本不变，效价稳定在10

实施例6噬菌体裂解谱的测定

1、材料准备：

准备新鲜的噬菌体增殖液PYC03和临床分离的来自全国不同地区养殖场分离的284株鸭沙门氏菌、鸭伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌；其中，山东地区分别分离出31株鸭沙门氏菌、28株鸭伤寒沙门氏菌、35株肠炎沙门氏菌；山西地区分别分离出鸭沙门氏菌30株、鸭伤寒沙门氏菌36株、肠炎沙门氏菌32株；广西地区分别分离出鸭沙门氏菌38株、鸭伤寒沙门氏菌33株、肠炎沙门氏菌21株。

2、实验方法：

①裂解率的检测方法：

在96孔板中，向试验组的每孔中分别加入5μL 1×10

OD值下降比例＝(对照组OD值—试验组OD值)/对照组OD值

②与现有噬菌体的对比：

将PYC03能裂解的鸭沙门氏菌选出，并用本公司已授权专利CN108359644B中SP4和本公司另一件专利CN111254121A公开的噬菌体SPP11对其进行裂解谱测定，比较三株不同沙门氏菌噬菌体的裂解差异性。

3、实验结果及分析

①从表1的裂解结果可知，临床分离的284株鸭致病性沙门氏菌中，噬菌体PYC03可裂解其中的253株沙门氏菌，总裂解率为89.10％，这一结果说明该噬菌体具有强裂解性、宽裂解谱的特点。

具体地，噬菌体PYC03对三种不同沙门氏菌表现出裂解率高低的差异。该噬菌体能裂解99株鸭沙门氏菌中的92株、97株鸭伤寒沙门氏菌中的86株、88株肠炎沙门氏菌中的75株，对三种沙门氏菌的裂解率分别为92.93％、88.66％、85.23％。可见，噬菌体PYC03对鸭沙门氏菌的裂解率最高。

②从表2的实验结果可知，PYC03可裂解的253株沙门氏菌中，噬菌体SP4能裂解92株鸭沙门氏菌中的74株、86株鸭伤寒沙门氏菌中的61株、75株肠炎沙门氏菌中的57株，即其对上述PYC03可裂解的三种沙门氏菌的裂解率分别为80.43％、70.93％、76.00％。噬菌体SPP11能裂解92株鸭沙门氏菌中的59株、86株鸭伤寒沙门氏菌中的47株、75株肠炎沙门氏菌中的38株，裂解率分别为64.13％、54.65％、50.67％。

总体来说，噬菌体SP4对PYC03可裂解的253株鸭源沙门氏菌的总裂解率为75.8％，而噬菌体SPP11对PYC03可裂解的253株鸭源沙门氏菌的总裂解率为56.9％。

因此，噬菌体PYC03对鸭源沙门氏菌裂解率远高于噬菌体噬菌体SP4和噬菌体SPP11，噬菌体PYC03对鸭源沙门氏菌表现出更优异的裂解性能、更宽的裂解谱。

表1 PYC03噬菌体对284株鸭源沙门氏菌的裂解谱

表2 SP4、PYC03噬菌体对253株鸭源沙门氏菌的裂解谱

实施例7噬菌体PYC03对非宿主性细菌的裂解试验

1、实验方法

选取10株大肠杆菌、5株葡萄球菌、5株变形杆菌和5株魏氏梭菌株这些不同的非宿主性细菌，按照实施例6中裂解谱的测定方法进行PYC03的裂解实验。

2、实验结果及分析

PYC03与20株非宿主性细菌进行混合培养4h后，OD值下降比例小于5％，表明噬菌体PYC03均无法识别上述10株大肠杆菌、5株葡萄球菌、5株变形杆菌和5株魏氏梭菌株非宿主性细菌，这说明供试噬菌体具有极强的宿主特异性，且对微生物群落无损伤作用。

实施例8噬菌体PYC03环境消毒试验

1、实验方法

山东某白羽肉种鸭场，随机选取1日龄鸭棚9个，分为3个试验组，3个对照组和3个空白对照组。试验组每天2次喷洒养殖场饮用水稀释的噬菌体悬浮液(10

按奥氏公式记数菌落总数C＝50000N/AT，式中C:每立方米菌落总数(CFU/m

2、实验结果及分析

如图6所示，试验组的环境中沙门氏菌含量低于对照组(84消毒液消毒)和空白对照组，这表明，噬菌体PYC03能够明显降低环境中沙门氏菌的含量，减少沙门氏菌感染率，该噬菌体可用于做为一种新型生物环境消毒剂进行应用。

实施例9噬菌体PYC03作为饮用水添加剂对鸭沙门氏菌的治疗试验

将40只感染沙门氏菌的病鸭，随机分为2组，每组20只，分别为对照组和试验组。试验组饮用含有噬菌体(10

结果：从下表3的结果可知，试验组中病鸭的死亡率比对照组低70％。这说明上述噬菌体能够作为一种饮用水生物添加剂来防治沙门氏菌病。其作为饲料添加剂对鸭沙门杀菌病也具有防治效果。

表3病鸭的死亡结果

实施例10噬菌体PYC03对肉质的保鲜作用

1、实验方法：

准备无菌的新鲜鸭肉300g等分成6份，平均分成两组实验组和对照组，每组各3份。制备高浓度噬菌体悬液，然后生理盐水稀释成适宜的使用浓度(约10

2、实验结果：

结果如图8所示，试验组中沙门氏菌菌浓度明显低于对照组。如图7所示，试验组中挥发性盐基氮(TVB-N)值明显低于对照组，这些结果说明噬菌体PYC03对鸭肉产品中的沙门氏菌起抑制作用，其对鸭肉肉质的保鲜具有非常重要的作用。

实施例11噬菌体PYC03的全基因组分析

提取噬菌体PYC03的基因组，进行全基因组测序，测序得到的基因组序列在NCBI的GenBank号为OK288022.1，序列分析结果如下：

(1)PYC03基因组全长114770bp，G+C含量为40.3％，碱基C、G、A、T含量依次为19.7％、20.6％、30.3％、29.5％。全基因组RAST在线注释结果显示该基因组含有181个开放阅读框(ORFs)。在这181个开放阅读框(ORFs)中，发现结构蛋白有54种，主要包括噬菌体的结构和包装蛋白(头蛋白、尾蛋白、尾纤维蛋白、颈蛋白、衣壳蛋白和末端酶大亚基等)、噬菌体的裂解有关蛋白(裂解酶)、DNA复制和修饰有关的蛋白质(限制性内切核酸酶、DNA结合蛋白、含内含子的DNA聚合酶前体、HNH核酸内切酶、DEAD/DEAH盒解旋酶等)、其他功能性蛋白(重复感染免疫蛋白)。同时在181个ORFs中，有147个起始密码子为ATG，8个起始密码子为GTG，4个起始密码子为TTG。经软件tRNAscan-SE分析该基因组不含tRNA基因。经在线工具CGE server分析该基因组不含耐药基因及毒力基因。经PHASTER分析该基因组不含溶原性相关基因。

(2)噬菌体PYC03的基因组中：与噬菌体宿主识别相关的尾部纤维(tail fibersprotein)蛋白基因序列见序列表序列1；高度保守的末端酶大亚基(terminase largesubunit)蛋白基因的序列见序列表中序列2；DNA聚合酶(DNA polymerase)基因的序列见序列表中序列3；与裂解能力相关的裂解酶(lysozyme)基因序列见序列表中序列4，这些序列的相关信息具体见下表4。

表4基因序列信息表

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 青岛诺安百特生物技术有限公司

<120> 一株鸭沙门氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其在防治鸭沙门氏菌感染的疾病中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3216

<212> DNA

<213> 噬菌体PYC03的尾部纤维蛋白基因(tail fibers protein gene of PYC03)

<400> 1

atggcactta aaactaaaat tattgtacag cagattctga acatagatga cactacaact 60

actgctagta agtatcctaa gtatacagta gttttaggta attctatcag ttctattact 120

gctggtgaac taacagcggc tgttgaagcc gctgcagagt ctgctgctgc tgctaaagat 180

tctgaaatag cagctaaaga ctctgaaaat aaagctaaag attcggaaat tcaagcgggt 240

attcatgctg gtgcttctga ggcttcagca acccagtctg ctgcttctgc tgctgaatct 300

gaaagacaag ctaacttatc tcaaggtagt gcggaaaact ctgctgcttc tgctttagaa 360

tctaagaatt ttaaagatgc ttcggaactt gctgctcaaa atgcagagca gagtaagatt 420

ttagcagagc aagctcaaag agcggcagaa gctgcccagt ctggtgctca agcttctgaa 480

aataaagcat cagcatttgc tacacaagct gctgcatctt cagcttccgc aggagatttt 540

gctgcagccg ctaaacaatc tgaattaaat gctaaaactt ctgaaaccaa tgccgcaaca 600

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gctggaactg ctgaggctcc agtattagag ttagtagaga cagagcaaaa gctagtttct 900

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ccttccttat ggttgggtga agttacttgg ttcccttatg acaaagattc aggtgttggc 1020

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gctatttggt acaccttaat ggaggttggt gtatggcagc catggagacg tttgaccaca 2040

gaacatggta ttattcctat tacttcaggg ggtactggta caaataatgc aaatgacgca 2100

agaataaatc taggtcttgg tcctataaat gcacctactt ttagtggtat gactcttcag 2160

ggtactaatg aaactacttc aggtatagcg gtttttagta atagaaatac ggaagggact 2220

caactttcct attctagaat gtaccatgaa attcagagtg gtgttggtaa aactactatt 2280

cagactacaa gagagggcgg ggcgactaac tatttccaaa ttgatgagta tggtaatatt 2340

gggaatatta actcaattat tgcatatgga tatatgggat taggtgctgc taatgctatg 2400

ggaaatgcct ctattgcgat tggtgactct gactctgggc taaaatggaa tagtgatggt 2460

aacataagta ccatagcaga tggtgtaaaa atagccacat ggacacctca tggattttat 2520

acacataaaa taataagctc agatgttgct aataccgaaa gagggatgta tgtaaacggg 2580

gttaggacta ccggtgcctc cgctcttgta gctggggttg tagaagctgg atctcatgtt 2640

ggttggagag atagagcttc aggtatgctt gttgaattga atactagagg agctgctgcc 2700

aatatctgga aagcaactag atggggtgat caacatgctg gtgcatctga catcgttatt 2760

tatgatgatg gatctcctta ttatagaact cttgtaggcg gtggtgaatt tgggttcaat 2820

ggccttggac aagctacctg tacttcttgg attagtacat ctgatattag gcttaaggca 2880

cagctaaaag agatagtatc tgctaaagat aaggtaaaat ccctacaggg gtacacttat 2940

tttaaacgta atagtttggt tgaagatgag cattcttttt attgtgaaga ggcaggatta 3000

atcgcacagg atgttcaaac tgtactaccg gaagctgtat ataaaatagc taactcagat 3060

cttctcggtg ttaattactc tggtgttacc gcattattgg ctaacgcagt aaaagagatg 3120

ttggcggatg cggaggctca ggaagctcgt atcagtaatc tagaggaaga actggcagag 3180

ttaaaagctc tagtagccac tctggtaaat aagtaa 3216

<210> 2

<211> 1317

<212> DNA

<213> 噬菌体PYC03的末端大亚基(terminase large subunit of PYC03)

<400> 2

atgaaagtct ctagagacta tattaacacc acagatgtta ttgactttgg tattgacaaa 60

cgattctttc gtctaccagt ctctagcatc ctagcacaag agggaattac acctaatgcc 120

cctcagattg caattattaa tgcattggaa gacccaagac atcgtttcgt gactgcatgt 180

gtatcacgtc gtgtaggtaa gtcattcatc gcatatacac ttgggttctt aaaacttctg 240

gaacccaatg tgaaggtgct ggtagttgca cctaactact cactggctaa cattggttgg 300

tcacagattc gtggtcttat taagaagtat ggattacaga ctgaacgtga gaacgccaaa 360

gataaagaga ttgaactagc gaatggttct ctctttaagc tggcttctgc agcgcaggct 420

gactccgcgg ttggtcgttc gtatgacttc atcatctttg acgaagcagc gatttccgat 480

gttggtggtg cagctttcga tattcagtta cgtcctaccc tagataagcc aaactctaaa 540

gctctattta tctctactcc tcgtgggggt aactggttca aagagttcta tgagaaagga 600

tttaacgaaa cgctacctaa ttgggtatct attcatggta catatcgtga taacccacgc 660

gctgacctga acgatatcga ggaagcgcgt cgtactgtta gtaaaaatta cttccgtcaa 720

gaatacgagg ctgacttctc cgtattcgaa ggtcagatct ttgatacctt caatgctatc 780

gagcatgtta aagaccttaa aggtatgcgt cacttcttta aagatgatga ggcattcgaa 840

acgttacttg gtattgacgt tggttatcgt gaccctacag cagttcttac tattaagtat 900

cactacgatg aagatgttta ttacgtactg gaagaatatc agcaagctga aaagactacc 960

gctcaacacg ctgcatatat ccaacactgc atagatcgtt ataatgttga tcgtatattt 1020

gtagactccg ctgctgctca gttccgtcag gacttagctt atgaacatga aatagcttct 1080

gcacctgcta agaaatctgt cctagatggt ttggcatgcc tgcaagcact gttccagcaa 1140

ggtaagatca tcgtagatgc ttcatgcacc tcattgattc acgccctagc gaactacaag 1200

tgggacttcc aggaaggcga agagaaatta tcacgtgaaa aaccacgtca tgatgcgaac 1260

tctcaccttt gtgacgcact gcgttatgga atttactcaa tttcccgtgg gaaataa 1317

<210> 3

<211> 2568

<212> DNA

<213> 噬菌体PYC03的DNA聚合酶(DNA polymerase of PYC03)

<400> 3

ttgaaaattg cagtagttga taaagctcta aataacactc gttatgataa acacttccag 60

ctttatggtg agaaagttga tgtattccat atgtgtaacg agaagttatc tggtcgtttg 120

ctgaaaaagc atattacaat cggaactcca gataacccgt tcgatccgaa cgattatgat 180

tttgttgtac tagttggtgc tgaacctttc ctgtatttcg caggtaagaa aggtatcggt 240

gattatactg gtaaacgtgt agagcatggt ggctatgcca actggattgc aagtattagt 300

ccagctcagc tacactttaa acctgaaatg aaaccagttt tcgatgcaac tgttgaaagt 360

attcatgaca ttattaatgg tcgtgagaag attgcaaaag ctggtgatta tcgtcctatt 420

actgatccag atgaagctga agaatacatc aagatggtgt ataacatggt tatcggacct 480

atcgcattcg actccgaaac ctcagctctg tatgctcgtg atggttatct tcttggtgtt 540

tctatgtctc accaagagta tcagggagtc tatattgact ctgacagcat caccgaagta 600

gctgtacatt atctccagaa aattctggat agcaagaatc atcagatcgt ttttcataac 660

ttgaagttcg atatgcactt ttactcctat catctaggac tttccttcga gaaagcacat 720

aaagagcgta gacttcatga taccatgttg caacactatg ttcttgatga acgtcgtggt 780

actcacggct tgaaatctct ggctatgaag tatactgaca tgggcgatta tgactttgaa 840

ctggataagt tcaaggatga ttattgcaag gcacataaga tcaagaaaga ggatttcagc 900

tatgatctga ttccatttga tattatgtgg ccttatgctg caaaagatac cgatgctact 960

ctgcgtctgc ataacttctt cttaccgaaa attgagaaga atgaaaaact ttgcagtcta 1020

tactatgatg ttctgatgcc tggttgcgta ttcctgcaac gtgttgaaga tcgtggtgta 1080

ccgatttctg ttgaccgctt gaaagaagct cagtatcagt taactcacaa cctgaacaag 1140

gctcgtgaaa agctgtatac ttatccagaa gtcgttcagc tagagaaaga tcagaacgaa 1200

gcgtttaacc cgaactctgt taagcaactt cgtgttcttc tgtttgatta tgttggctta 1260

actccaactg gtaaactgac tgatacaggt gcagattcta caaacgcaga agctctgaac 1320

gaactagcaa ctcagcaccc gattgcgaaa actctgctag agattcgtaa gctgactaag 1380

ctgatctcta catatgttga gaagattctt ctgagcatcg atgcagatgg ttgcattcgt 1440

accggtttcc acgaacatat gactacttct ggtcgtttaa gttcttctgg taagctaaac 1500

ctgcaacagt taccacgtga tgaatctatt attaagggtt gtgtagtagc tcctcctgga 1560

tatcgtgtaa tcgcatggga cttaacaact gcggaagttt actatgctgc tgttctgtct 1620

ggtgacagaa atatgcaaca agtatttatc aacatgaaga atgagcctga taaataccct 1680

gacttccatt caaacatcgc acacatggta tttaaactga cttgtgaacc acgtgatgtt 1740

aagaagctgt tcccagctct acgtcaggct gctaaggcaa ttaccttcgg tattctatat 1800

ggttctggcc cagcgaaagt agctcattct gttaacgaag ctcttctgga acaggctgct 1860

aaaacaggcg aaccgtttgt tgaatgtacc gttgcagatg cgaaggacta tatcgaaact 1920

tacttcggtc agttccctca gcttaagcgt tggattgata agtgccacga tcagatcaag 1980

aactttggat tcatctatag tcactttggt cgtaagcgtc gtctgcacaa catccattcc 2040

gaagatcgtg gtgttcaggg tgaagaaatc cgttctggat ttaacgcaat cattcagtct 2100

gcatcttctg atagcctgtt gttaggtgct attgatgctg atgaagaaat cctgtccctg 2160

ggtctaggaa aagagatgaa gatcgtcatg ttggttcacg actccgtggt tgctattgta 2220

cgtgaagatc tgattgatca gtataacgag attctgattc gtaacatcca gaaggatcgt 2280

ggtattagta tccctggctg cccaattggt attgattctg attccgagaa aggtggttct 2340

cgtgactact cttgtggtaa gatgaagaaa cagcacccat caatcgcttg tattgatgat 2400

gatgagtata ctcgttatgt taagggtgta ttactcgatg cagatttcga gtataagaag 2460

ttagctgcaa tggataaaga gcatccagac cacagcaagt acaaggatga taagtttatt 2520

gctgtatgta aagatctgga taatgtgaaa aggattttag gtgcttga 2568

<210> 4

<211> 369

<212> DNA

<213> 噬菌体PYC03的裂解酶(lysozyme of PYC03)

<400> 4

atgaaagcat atcaaagtct taagtctggc gtaattaaca ttgttcataa taatcagatc 60

attcaactat attctaaaga tggtgaactt aaacagaaag ttctagtcga agatctagag 120

ggtatcacac ctcactttga ccctgaggcc tttcgcattg tagatgtgga agttgttcct 180

caagtcgagg gtggtcagca cctaaatgtc aatgtgttaa gccgtgatca gcttttggat 240

gcacagaaac atcctgaaaa atatcctcag ttgaccatcc gtgtctctgg ctatgctgtt 300

cgatttaacg cattgacgcg tgaacaacag aacgacgtta ttagtcgtac atttactcag 360

gcgatataa 369