一种广西甜茶优良单株愈伤组织分化丛生芽的方法

摘要

本发明公开了一种广西甜茶优良单株愈伤组织分化丛生芽的方法，包括以下步骤：1)改良Ms培养基的配制；2)采用甜茶的顶芽作为外植体，经消毒后接种在诱导愈伤组织的培养基中培养，获得愈伤组织，诱导率最高可达98.28％；3)通过愈伤组织在继代增殖培养基里增殖，其增殖系数约6.73倍；4)愈伤组织诱导分化出丛生芽，分花率最高可达61.43％；对各阶段采用不同培养基，严格要求控制培养室条件，本发明对广西甜茶优良品种进行快速繁殖，大大提高其繁殖系数，使用采购方式简单且安全系数更高的氯化铵、硫酸铵和磷酸二氢铵替代价格更高的国家管制化学药品硝酸铵，有很好的经济效益和广泛应用前景。

说明书

【技术领域】

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种广西甜茶优良单株愈伤组织分化丛生芽的方法。

【背景技术】

广西甜茶(Rubus Suavissimus S.Lee.)是蔷薇科悬钩子属植物，别名为甜叶悬钩子、野生茶，民间又称之为“神茶”，为多年生有刺落叶灌木，高1～2m，单叶，矩圆状卵形，长5～10cm，叶柄长1.5-4cm；花单生叶腋，白色，直径2-3cm，垂生；萼裂片长矩圆状卵形，渐尖，无毛；聚合果球形、黄色、味甜。其叶可做药食两用，毒性低、副作用轻微，且富有甜茶甙、黄酮类、多酚类、蛋白质和氨基酸等活性成分，具有降血脂、降血糖作用，并具有抗过敏，止咳、祛痰、抗炎、止痛和镇静等功效。甜茶全身是宝，根、茎、叶、果实均可入茶入药。甜茶叶常用来作为甜味剂加工食品，民间入药用于补肾降压，被誉为神茶，与罗汉果、合浦珍珠、广西香料等齐名为广西十大名品。野生分布于广西昭平、金秀、平乐、荔浦等海拔在200～1000米以上的山地。在民间，尤其是在瑶族、壮族等少数民族中有悠久的使用历史，主要是采摘野生甜茶的叶子阴干，一般作茶饮用及加工食品用(甜味剂)。但长久以来，在瑶族地区更是作为一种著名瑶药使用，治病救人。近年来研究人员对甜茶的叶子有效成分进行提取，成分包括甜茶素、黄酮甙、茶多酚、蛋白质、维生素(A、B、C、E、K)、20多种氨基酸(含18种人体必需的氨基酸)、微量元素(钙、铁、锌、硒)等；甜茶素具有降低血压、降低血糖、降血脂，抗过敏，抗氧化、润喉祛痰等功效。

目前甜茶育苗主要采用以下几种方法：(1)分株繁殖：4月挖取母株支根上萌发的幼株进行移植；(2)分根繁殖：每年3月份在气温回升时在侧根上出现许多突起的白色不定芽支根，切成长15-20cm根段，平埋于苗床中，淋水保湿，半个月后根段即萌发成植株；(3)种子繁殖：果实成熟呈橙红色或红色时采收，取出种子用沙土覆盖保存，待种子长出2片叶后，移入营养袋育苗，营养土用黄泥土、泥炭土1:1混合而成。但是甜茶野生资源少，且种子发芽率低、硬枝扦插成活率低，靠分株和扦插繁殖育苗数量有限，因此对甜茶进行组织培养，可快速繁育种苗，供生产上需要。

通过对甜茶产区的了解，人工栽培的面积逐年增长，随着种植面积的扩大，种苗的来源成了最大的问题。因而人们尝试利用枝条进行扦插，但极难成功。原因在于甜叶悬钩子的髓心(中空)较大，韧皮部薄，不易形成愈伤组织，且甜茶属落叶树种在落叶前已把营养运输到根部。因此传统的种苗主要来源：一是分株繁殖，即利用母株枝根萌发的幼苗进行移栽；二是分根繁殖，即在春雨季节，水平支根上出现许多白色突起的不定芽，此时挖取支根，切段，斜插或浅埋均可。

传统种植带来如下问题：1)受种苗来源及数量限制，无论分株繁殖或分根繁殖，增殖系数低，一年只能分一次，短时不能获得稳定的种苗而不能大面积种植，难产生规模效益；2)病毒逐代积累使种性下降退化，通过调研发现许多种植户的甜叶悬钩子到第五年后，成片甜茶林子都会发生枯死，又需开荒重新种植。以上可看出大面积的种植受限于种苗的来源及品质的稳定，发展无病毒组培苗尤为重要且十分紧迫。

【发明内容】

针对现有技术中甜茶大面积的种植受限于种苗的来源及品质的稳定的问题，本发明提供了一种广西甜茶优良单株愈伤组织分化丛生芽的方法，是一种广西甜茶苗的快繁方法，解决了人工种植甜茶优良种苗紧缺的问题，为大面积种植展示了广阔的前景。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种广西甜茶优良单株愈伤组织分化丛生芽的方法，包括如下步骤：

1)改良MS培养基的制作，改良MS的配方如下：

大量元素的组分及浓度为：硝酸钾2500mg/L、硫酸铵260mg/L、氯化铵320mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢铵230mg/L、四水硝酸钙707mg/L；

有机化合物的组分及浓度为：肌醇200mg/L、烟酸2mg/L、盐酸吡哆醇2mg/L、盐酸硫胺素0.5mg/L、甘氨酸2mg/L；

微量元素的组分及浓度同MS培养基；

以改良MS为基本培养基，各阶段的培养基配方如下：

a：愈伤组织初代诱导培养基：改良MS+胺鲜酯0.2-0.5mg/L+IBA 2.0-5.0mg/L+硝酸银0.5-2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5-8g/L，pH 5.5-6.0；

b：愈伤组织继代增殖培养基：改良MS+胺鲜酯0.05-0.1mg/L+IBA 1.0-2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5-8g/L，pH 5.5-6.0；

c：愈伤组织分化培养基：改良MS+ZT 3.0-5.0mg/L+IBA 0.1-0.2mg/L+水解络蛋白300-600mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5-8g/L，pH 5.5-6.0；

各培养基配制完成后，在灭菌锅中成功灭菌后使用；

2)组织培养阶段：

d：材料类别；

甜茶的组织培养材料选择带顶芽茎段；

e：取材与消毒；

取甜茶长(0.5±0.05)cm的带顶芽茎段，用流水冲洗干净，然后在超净工作台上用75％酒精浸泡2s，再用0.1％HgCl

f：愈伤组织继代增殖培养；

将步骤e得到的愈伤组织分离成直径0.2cm均匀小块，再接到愈伤组织继代增殖培养基中，培养温度(23±2)℃，光照强度为1000-1500Lx，光照时间12h/d，20d后愈伤组织增殖；

g：愈伤组织分化丛生状芽；

将步骤e经继代增殖培养获得浅黄色或浅绿色颗粒状的愈伤组织，将其均匀分割后，接入到分化培养基中，30d后，分化出丛生芽，控制培养室的光照时间为14h/d，光照强度为2000-2500Lx，培养室温度(23±2)℃。

本发明中：

步骤1)所述的以改良MS为基本培养基，优选各阶段的培养基配方如下：

a：愈伤组织初代诱导培养基：改良MS+胺鲜酯0.4-0.5mg/L+IBA 3.0-5.0mg/L+硝酸银1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5-8g/L，pH 5.5-6.0；

b：愈伤组织继代增殖培养基：改良MS+胺鲜酯0.07-0.1mg/L+IBA 1.5-2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5-8g/L，pH 5.5-6.0；

c：愈伤组织分化培养基：改良MS+ZT 5.0mg/L+IBA 0.2mg/L+水解络蛋白500-600mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5-8g/L，pH 5.5-6.0；

本发明对MS培养基做了改进，改良后基本培养基大量元素对比：

本发明对MS进行了改良，主要目的如下：

1、改良后的MS用氯化铵、硫酸铵和磷酸二氢铵替代了硝酸铵，因为硝酸铵属于国家管制的化学药品，采购程序复杂且存放具有一定的风险，而氯化铵、硫酸铵和磷酸二氢铵采购方式简单且安全系数更高，一定程度提升了广西甜茶优良单株愈伤组织的诱导率和分化率。

2、改良后的MS用四水硝酸钙替代了氯化钙，氯离子维持在一个较低浓度可以有效减少组培烧苗的现象出现，同时有利于提升了广西甜茶优良单株愈伤组织的诱导率和分化率。由于MS中已经使用了氯化铵，因此用四水硝酸钙替代了氯化钙可以在保证钙元素含量的同时减少氯离子的使用。

3、改良后的MS增加了硝酸钾用量替代了磷酸二氢钾的使用，由于MS中已经使用了磷酸二氢铵，使用硝酸钾替代磷酸氢二钾，可以降低磷酸根离子浓度，降低其与钙离子形成沉淀的几率，有利于愈伤组织的诱导。

和现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明所述的一种广西甜茶优良单株愈伤组织分化丛生芽的方法，采用组培苗快繁技术，一可免除种苗内生菌、病毒逐代积累使种性下降、退化及带病传播的危险，种植后种性稳定，产量高；二是短期内可大量增殖，大面积种植带来可靠的种苗保证。确保产量增加和品质的提高。

2、本发明所述的一种广西甜茶优良单株愈伤组织分化丛生芽的方法，所使用的培养基中，硝酸铵是一种管制化学药品，市场上很难购买，通过更改MS基本培养基中大量元素组分，把硝酸铵和氯化钙换成氯化铵、硫酸铵和硝酸钙并调整各组分的浓度、结合使用特定浓度的胺鲜酯、IBA植物生长调节剂，使所得的初代诱导培养基和分化芽培养基能有效促进甜茶芽尖外植体愈伤组织的形成和分化芽体，为实现甜茶组培产业化和推广应用提供了技术支撑。

【附图说明】

图1是本发明实施例的广西甜茶优良单株愈伤组织初代诱导培养的图；

图2是本发明实施例的广西甜茶优良单株愈伤组织初代诱导培养的图；

图3是本发明实施例的广西甜茶优良单株愈伤组织继代增殖培养的图；

图4是本发明实施例的广西甜茶优良单株愈伤组织继代增殖培养的图；

图5是本发明实施例的广西甜茶优良单株愈伤组织分化芽培养的图；

图6是本发明实施例的广西甜茶优良单株分化成植株的图；

图7是本发明实施例的广西甜茶优良单株分化成植株的图。

【具体实施方式】

以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。

实施例：

一种广西甜茶优良单株愈伤组织分化丛生芽的方法，包括如下步骤：

1)改良MS培养基的制作，改良MS的配方如下：

大量元素的组分及浓度为：硝酸钾2500mg/L、硫酸铵260mg/L、氯化铵320mg/L、七水硫酸镁370mg/L、磷酸二氢铵230mg/L、四水硝酸钙707mg/L；

有机化合物的组分及浓度为：肌醇200mg/L、烟酸2mg/L、盐酸吡哆醇2mg/L、盐酸硫胺素0.5mg/L、甘氨酸2mg/L；

微量元素的组分及浓度同MS培养基；

以改良MS为基本培养基，各阶段的培养基配方如下：

a：愈伤组织初代诱导培养基：改良MS+胺鲜酯0.2-0.5mg/L+IBA 2.0-5.0mg/L+硝酸银0.5-2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5-8g/L，pH 5.5-6.0；

b：愈伤组织继代增殖培养基：改良MS+胺鲜酯0.05-0.1mg/L+IBA 1.0-2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5-8g/L，pH 5.5-6.0；

c：愈伤组织分化培养基：改良MS+ZT 3.0-5.0mg/L+IBA 0.1-0.2mg/L+水解络蛋白300-600mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5-8g/L，pH 5.5-6.0；

各培养基配制完成后，在灭菌锅中成功灭菌后使用；

2)组织培养阶段：

d：材料类别；

甜茶的组织培养材料选择带顶芽茎段；

e：取材与消毒；

取甜茶长(0.5±0.05)cm的带顶芽茎段，用流水冲洗干净，然后在超净工作台上用75％酒精浸泡2s，再用0.1％HgCl

f：愈伤组织继代增殖培养；

将步骤e得到的愈伤组织分离成直径0.2cm均匀小块，再接到愈伤组织继代增殖培养基中，培养温度(23±2)℃，光照强度为1000-1500Lx，光照时间12h/d，20d后愈伤组织增殖，增殖系数约为5-7倍，通过反复切割培养，在较短时间里可或得到大量愈伤组织；

g：愈伤组织分化丛生状芽；

将步骤e经继代增殖培养获得浅黄色或浅绿色颗粒状的愈伤组织，将其均匀分割后，接入到分化培养基中，30d后，分化出丛生芽，控制培养室的光照时间为14h/d，光照强度为2000-2500Lx，培养室温度(23±2)℃。

表1改良前的愈伤组织初代诱导培养基配方和诱导情况表

表2改良后的愈伤组织初代诱导培养基配方和诱导情况表

表3改良前的愈伤组织继代增殖培养基配方和增值情况

表4改良后的愈伤组织继代增殖培养基配方和增值情况

表5改良前愈伤组织分化芽培养基配方和分化情况

表6改良后愈伤组织分化芽培养基配方和分化情况

结果与总结：

1、由表1和表2可知，使用改良后的愈伤组织初代诱导培养基可以明显增加广西甜茶优良单株愈伤组织的诱导率，使用改良后的培养基甜茶诱导率可以达到98.28％，比改良前的最高诱导率提高了10.37％，影响显著。

2、由表3和表4可知，使用改良后的愈伤组织继代增殖培养基可以明显增加广西甜茶优良单株愈伤组织增殖倍数，使用改良后的培养基甜茶增殖倍数最高可以达到6.73，比改良前的最高增殖倍数提高了26.03％，影响显著。

3、由表5和表6可知，使用改良后的愈伤组织继代增殖培养基可以增加甜茶愈伤组织分化率，使用改良后的培养基甜茶分化率最高可以达到61.43％，比改良前的最高增殖倍数提高了14.73％，影响显著。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，做出若干改进和变化，这些都属于本发明的保护范围。