一种基于数字PCR检测EGFR 19del的引物探针组合物、试剂盒和检测方法

摘要

本发明公开了一种基于数字PCR检测EGFR 19del的引物探针组合物、试剂盒和检测方法。所述引物探针组合物包括一对19del位点特异性引物和一对竞争性结合探针，其能够在ddPCR仪上实现基因突变定性定量检测。本发明引物探针组合物用于数字PCR检测EGFR 19del，方法操作简便，结果准确直观，可应用于组织和cfDNA等样本的检测，具有很高的灵敏度和特异度。

说明书

技术领域

本发明属于EGFR基因突变检测技术领域，具体涉及一种基于数字PCR检测EGFR19del的引物探针组合物、试剂盒和检测方法。

背景技术

目前中国的肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，防治形势非常严峻。不过，近几年非小细胞肺癌NSCLC已经成为精准医疗领域发展最成功的一个范例。在中国非小细胞肺癌患者中约有一半都含有EGFR突变，EGFR有多种突变，分为敏感突变和耐药突变，敏感突变最主要的是19del和L858R突变，占全部敏感突变的约90％，19del又占到其中的一半，而耐药突变最主要的是T790M突变和20ins突变。EGFR敏感突变可以使用Gefitinib/Erlotinib/Afatinib等TKIs靶向抑制剂治疗，具有良好的疗效。

对基因突变进行检测是精准医疗的第一步，目前大多是对肿瘤组织中DNA进行基因检测。近年来，随着检测技术的进步和液体活检的巨大优势，检测血液中的ctDNA越来越被重视，得到了飞速发展。ctDNA是肿瘤细胞凋亡或坏死时释放到血液中的DNA，被降解为160-180bp的游离DNA片段，含有原始肿瘤细胞的突变状态。与肿瘤组织样本相比，采集外周血比较方便、创伤小，而且可以多次，另外检测ctDNA可以克服由于肿瘤异质性导致的组织检测不准确的问题。大量研究结果表明两种样本的检测具有高度的一致性，说明检测ctDNA是可以替代组织或作为组织检测的补充。检测ctDNA不但能用于突变检测和用药指导，而且能够用于疗效跟踪、耐药监测和预后，甚至于早期筛查和诊断等方面。

目前基因突变检测方法主要有荧光定量PCR、二代测序NGS和数字PCR三大类。ctDNA在血浆cfDNA中的含量大多处于1％以下，因此对检测技术要求非常高。数字PCR是第三代PCR技术，可实现核酸分子的绝对定量，并具有极高的检测灵敏度，可小于0.1％，因此非常适用于血液中ctDNA的EGFR、KRAS等基因重要突变位点的检测。

19del突变是EGFR 19号外显子上的一段区域发生频繁的缺失突变现象，缺失类型多样，多达几十种。虽然基于数字PCR检测EGFR 19del突变已有多种方法，但是一种更简便准确的检测方法需要进一步发掘。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明目的是提供一种基于数字PCR检测EGFR 19del的引物探针组合、试剂盒和检测方法，本发明基于竞争性结合探针的设计原理，具有操作简便，结果准确直观，可应用于组织和cfDNA等样本的检测，具有很高的灵敏度和特异度。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种基于数字PCR检测EGFR 19del的引物探针组合物，其特征在于，所述组合物包括如下所示的一对特异性引物和一对竞争性结合探针：

正向引物:CTCTCTGTCATAGGGACTCTGGA(SEQ ID NO 1)

反向引物:CACATCGAGGATTTCCTTGTTG(SEQ ID NO2)

探针1:FAM-AGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-BHQ1(SEQ ID NO3)

探针2:VIC-TCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCG-BHQ1(SEQ ID NO 4)。

一对引物用于扩增EGFR 19del特异性序列。探针1和探针2序列有部分重合。探针1和探针2序列都和野生型序列一致。探针2包含热点突变区域，探针1不包含热点突变区域。探针2比探针1的Tm值高5-10度。探针5’端分别用FAM和VIC荧光基团修饰，3’端用BHQ1淬灭基团修饰。

本发明还提供了一种基于数字PCR检测EGFR 19del的试剂盒，所述试剂盒包含所述的引物探针组合物。

本发明还提供了所述的引物探针组合物，或所述的试剂盒在基于数字PCR检测EGFR 19del中的应用。

本发明最后提供了一种基于数字PCR检测EGFR 19del的方法，包括如下步骤：

(1)将数字PCR预混液与待测的DNA样本、权利要求1所述的引物探针组合物混合，制备得到数字PCR混合液；

(2)将数字PCR混合液制备成微滴，然后进行PCR扩增反应；

(3)对PCR扩增反应后的产物进行信号分析，在分析软件中根据不同的荧光信号来判断待测样本的突变情况，并计算突变模板的含量。

优选的，步骤(2)中，所述PCR扩增反应的条件为：95℃，10min；94℃，30s；60℃，60s；98℃，10min；4℃，终止；其中，94℃和60℃进行40个循环，升降温速度为2℃/s。

优选的，步骤(2)中，所述PCR扩增反应的体系包括：

ddPCRSupermix for Probes(No dUTP)、待测的DNA样本、权利要求1所述的引物探针组合物和水。

优选的，步骤(3)中，将PCR扩增反应后产物放入微滴读取仪中进行微滴读取，在软件上查看和分析结果，将不同荧光信号的微滴分成4种类型，无模板微滴/突变型微滴/野生型微滴/杂合型微滴；当突变型微滴数≥3个时判定为突变型，并计算突变频率FractionalAbundance＝(a/a+b)。

数字PCR是一种核酸分子绝对定量方法，利用微流控或微滴化方法，将核酸分子分散至芯片的微反应器中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。经过PCR扩增后，有一个核酸分子模板的反应器就会产生荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。这样根据反应器的数量和含有荧光信号的反应器比例，就可以推算出原始溶液的核酸含量。数字PCR作为第三代PCR技术，具有定量快速准确等优势，广泛用于拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。

Taqman荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5’末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等，3’端携带淬灭基团，如BHQ、MGB等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。利用特异性探针的荧光信号就可以区分出不同的模板类型。

有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：

1)本发明方法操作简便，结果直观，几乎覆盖所有的19del突变类型。

2)本发明方法适用于组织和cfDNA的检测，具有准确性高、灵敏度高等优点，结果可以定性定量。

附图说明

图1为本发明的引物探针设计原理图。

图2为使用本发明的方法检测EGFR 19del的阳性结果图。

具体实施方式

通过以下实施例进一步对本发明进行进一步阐述。这些实施例完全是例证性的，他们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1引物和探针设计

1.材料

所用数字PCR仪为Bio-Rad QX-200仪，所用ddPCRSupermix for Probes(no dUTP)及相关耗材均购自Bio-Rad公司。

2.样本准备

所用样本为cfDNA标准品套装，购自菁良基因科技(深圳)有限公司。此套装包含3个样本，EGFRΔE746_A750的突变频率分别是0％、0.1％和1％。

3.引物及探针序列设计

正向引物:CTCTCTGTCATAGGGACTCTGGA(SEQ ID NO 1)

反向引物:CACATCGAGGATTTCCTTGTTG(SEQ ID NO 2)

探针1:FAM-AGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-BHQ1(SEQ ID NO 3)

探针2:VIC-TCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCG-BHQ1(SEQ ID NO 4)

一对引物用于扩增EGFR 19del特异性序列。探针1和探针2序列有部分重合。探针1和探针2序列都和野生型序列一致。探针2包含热点突变区域，探针1不包含热点突变区域。探针2比探针1的Tm值高5-10度。探针5’端分别用FAM和VIC荧光基团修饰，3’端用BHQ1淬灭基团修饰。

实施例2利用本方法检测EGFR 19del突变

操作具体流程为：

1.按下表配置数字PCR反应体系：

2.将配制好的20ul样品反应体系加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔内，在DG8cartridge最底下一排8个孔中各加入70ul微滴生成油(DG Oil)，盖上胶垫(gasket)，注意两边的小孔都要钩牢；将微滴发生卡底座放置到微滴生成仪中，进行微滴生成。生成的微滴在上面一行的反应孔内，从发生卡上层孔内吸取微滴转移至96孔板的内，然后使用PX1热封仪将96孔板封膜。

3.将封好膜的96孔板放入PCR仪中，运行如下反应程序：

注：升降温速度为2℃/s

4.结果分析：PCR反应程序结束后，将96孔板放入QX200微滴读取仪中进行微滴读取，在软件QuantaSoft上查看和分析结果。坐标轴channel1为FAM信号，channel2为VIC信号。将不同荧光信号的微滴分成4种类型，无模板微滴/突变型微滴/野生型微滴/杂合型微滴。当突变型微滴数≥3个时判定为突变型，并计算突变频率Fractional Abundance＝(a/a+b)，见图2。

5.利用本发明方法，本次cfDNA标准品的EGFR 19del突变检测结果为0％、0.08％和1.1％，与预期结果一致。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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