鉴别香菇双单杂交杂合子的引物及其鉴别方法

摘要

本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及鉴别香菇双单杂交杂合子的引物及其鉴别方法，本发明的引物P1和受体融香7号的特异性引物d引物对和e引物对都可以快速准确的鉴别以香菇融香7号为供体、以商品菌株808的单孢菌株为受体的双单杂交后代，特异性条带d和e分别位于供体的两个核基因组内，上述引物能快速对d和e条带进行标记和扩增，当杂交后代拥有d或e条带时，为杂交成功的杂合子，同时拥有d和e条带时，为未杂交成功的供体亲本融香7号，d和e条带均没有时，为未杂交成功的受体单孢菌株，该方法能快速、精准鉴别香菇双单杂交菌株的杂合子和非杂合子，为香菇杂交选育和遗传分析提供了技术支撑。

说明书

【技术领域】

本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及鉴别香菇双单杂交杂合子的引物及其鉴别方法。

【背景技术】

香菇是我国传统的菜肴，其味道鲜美、营养丰富，深受普通老百姓喜爱。香菇的人工栽培历史悠久，并在近20年得到迅猛发展，已成为我国栽培规模最大的食用菌品种，年产量达900多万吨。我国培育出的香菇优良品种也不断推陈出新，为香菇产业的快速发展作出了卓越的贡献。

香菇杂交育种是其新品种选育中最常用、最有效的技术手段，主要包括单单杂交与双单杂交两种方法。双单杂交是以两个亲本中的一个亲本的单核体作为受体，以能提供所需优良性状的另一个亲本双核菌株为供体，其一个核进入受体细胞完成配对的非对称杂交方法。双单杂交具有杂交后代筛选工作量相对少、育种周期相对短等优点，从而被广泛应用。

杂交后代的鉴定筛选是香菇杂交育种过程中的关键步骤之一，传统方法通过拮抗试验和显微观察菌丝是否存在锁状联合结构进行判别，非常费时、费工，而且效率低、误判率高。随着分子生物技术的快速发展，分子标记技术被越来越多的应用于食用菌杂交育种中，其中ISSR(inter-simple sequence repeat)作为一种常用的分子标记，具有稳定性好、可重复性高、引物通用等优点，而被广泛应用食用菌的遗传差异分析。ISSR标记也成功应用于香菇单孢杂交后代的分析。本研究将ISSR分子标记和SCAR分子标记技术拓展应用于香菇双单杂交后代的鉴别筛选，同时通过区分供体核对杂交子进行归类分组，以期为香菇杂交育种和优异性状遗传分析提供技术支撑。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要提供鉴别香菇双单杂交杂合子的引物及其鉴别方法，该引物的组合应用，能快速的对香菇双单杂交的后代进行分析，能快速精准地区分出双单杂交的杂合子，能为后期育种提供快速筛选的模板和种质库。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

鉴别香菇双单杂交杂合子的引物，所述引物为P1，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述香菇双单杂交的供体亲本为融香7号的双核菌株；所述融香7号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO：40139，保藏日期为2022年04月24日。

进一步的，所述引物P1可同时标记位于融香7号两个不同核的特异性条带d和e，所述d条带的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述e条带的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，所述d条带的特异性扩增引物对为d引物对，其正向引物序列如SEQ IDNO.4所示；反向引物序列如SEQ ID NO.5所示；所述e条带的特异性扩增引物对为e引物对，其正向引物序列如SEQ ID NO.6所示；反向引物序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明还包括应用所述引物对香菇的双单杂合子进行鉴别的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取香菇亲本菌株808的单孢菌株，任意选取一定数量单孢菌株分别与双核菌株融香7号进行杂交，挑取杂交子代的菌丝提取杂交子代的总DNA；

(2)应用如权利要求1所述的对两个亲本进行扩增，通过比对获得位于双核菌株融香7号两个核上的特异性条带d或e；

(3)然后对步骤(1)获得的杂交子代样本总DNA进行PCR扩增，进行对比，当扩增产物中含有d或e特异性条带，则判定该杂交子代样本为杂交成功的杂合子；若扩增产物中d和e特异性条带均没有，则判定该杂交子代样本为未杂交成功的单孢菌株亲本；若扩增产物中同时含有d和e条带，则判定该杂交子代样本为未杂交成功的双核菌株亲本融香7号。

进一步的，所述步骤(2)PCR反应体系为：10μL的2×Taq PCR MasterMix，10μmol/L的引物1μL，150ng的模板DNA 1μL，8μL的ddH

进一步的，所述d条带的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述e条带的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还包括应用所述d引物对和e引物对进行香菇的双单杂合子鉴别的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取香菇亲本的单孢菌株，任意选取一定数量单孢菌株分别与双核菌株融香7号进行杂交，挑取杂交子代的菌丝提取杂交子代样本的总DNA；

(2)采用所述d引物对和e引物对分别对步骤(1)的杂交子代样本总DNA进行PCR扩增，当仅d引物对或e引物对有扩增产物时，则判定该杂交子代样本为杂交成功的杂合子，当d引物对和e引物对均没有扩增产物时，则判定该杂交子代样本为未杂交成功的单孢菌株亲本，当d引物对和e引物对均有扩增产物时，则判定该杂交子代样本为未杂交成功的双核菌株亲本融香7号。

进一步的，所述步骤(2)d引物对的PCR反应体系为：10μL的2×Taq PCRMasterMix，10μmol/L的正反引物各1μL，150ng的模板DNA 1μL，7μL的ddH

进一步的，所述步骤(2)e引物对的PCR反应体系为：10μL的2×Taq PCRMasterMix，10μmol/L的正反引物各1μL，150ng的模板DNA 1μL，7μL的ddH

本发明还包括所述引物P1或所述d引物和e引物对在选育、筛选和/或鉴别香菇双单杂交杂合子上的应用。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明的引物P1可以快速准确的鉴别以香菇融香7号为供体、以商品菌株808单孢菌株为受体的双单杂交后代，经过研究发现该引物可以标记出位于融香7号不同核的基因片段，通过识别不同核的特异性条带d和e，能对杂交后代的样本进行快速区分，具体区分方法为：拥有d或e条带的样本为杂交成功的杂合子，同时拥有d和e的样本为未杂交成功的供体亲本融香7号，d和e条带均没有的为未杂交成功的受体单孢菌株，该引物和方法能快速、精准鉴别香菇双单杂交菌株的杂合子和非杂合子，还能依据导入核的不同将杂合子区分成两组，并且可以判断非杂合子来源，为香菇杂交选育和遗传分析提供了技术支撑。

2、本申请还对位于融香7号不同核d和e条带进行了测序，并设计出特异性扩增d条带的d引物对和特异性扩增e条带的e引物对；采用d引物对和e引物对也可以对以双核菌株融香7号为亲本的单双杂交后代进行准确鉴别，即：当仅d引物对或e引物对有扩增产物时，则判定该杂交子代样本为杂交成功的杂合子，当d引物对和e引物对均没有扩增产物时，则判定该杂交子代样本为未杂交成功的单孢菌株亲本，当d引物对和e引物对均有扩增产物时，则判定该杂交子代样本为未杂交成功的双核菌株亲本融香7号，而且d引物对和e引物对的条带明亮，扩增效果良好，能更准确的区分双核菌株融香7号为供体亲本的香菇的双单杂交后代。

【附图说明】

图1是P1引物对杂交后代的扩增结果图；图中M为：DNA marker，从上至下依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1和2分别为亲本菌株808和融香7号，泳道3-16分别为杂交菌株d8s7-1、d8s7-2、d8s7-3、d8s7-7、d8s7-13、d8s7-23、d8s7-24、d8s7-31、d8s7-34、d8s7-39、d8s7-42、d8s7-49、d8s7-52m和d8s7-56m；箭头指示分别为特异性条带d和e。

图2是d引物对和e引物对对两亲本和40个杂交子代的扩增结果图：M：DNA Marker，泳道1至2为亲本菌株808和融香7号，泳道3至21是拥有d条带标识细胞核的19个杂交菌株d8s7-2、d8s7-3、d8s7-9、d8s7-13、d8s7-23、d8s7-31、d8s7-35m、d8s7-37m、d8s7-37e、d8s7-38、d8s7-46、d8s7-52e、d8s7-57、d8s7-58e、d8s7-66、d8s7-67、d8s7-70、d8s7-70e和d8s7-79，泳道22至29分别为拥有e条带标识细胞核的8个杂交菌株d8s7-7、d8s7-8、d8s7-24、d8s7-34、d8s7-39、d8s7-42、d8s7-47、和d8s7-52，泳道30至40分别为误挑取的供体亲本融香7号的11个菌株d8s7-1、d8s7-15、d8s7-36m、d8s7-36e、d8s7-49、d8s7-52m、d8s7-58m、d8s7-60、d8s7-68、d8s7-74和d8s7-78，泳道41和42分别为未杂交成功的808单孢菌株d8s7-56m和d8s7-73。

图3是香菇菌株间的不同拮抗反应的结果图；

图4是P4引物对杂交后代的扩增结果图：M：DNA Marker，泳道1至2为亲本菌株808和融香7号，3至6为杂交菌株d8s7-1、d8s7-2、d8s7-3和d8s7-7；箭头a和b所指分别为亲本菌株808和融香7号的特异性条带，c为两亲本共同条带。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1：

一、供试菌株与培养基：

亲本菌株香菇808和香菇融香7号均由广西农业科学院微生物研究所提供。

香菇808是广西推广栽培品种，具有外观品种好，栽培产量高等优良性状；

香菇融香7号是广西农业科学院微生物研究所分离驯化自广西野生香菇的菌株，具有较耐高温、香味浓、出菇早等优良性状；融香7号菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO：40139，保藏日期为2022年04月24日。

PDA培养基：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1 000mL。

二、试验方法：

(1)单孢菌株的获取：亲本香菇菌株808栽培出菇后，分别选择菇形圆整、开伞七八分的子实体，在无菌环境下采集孢子。采用稀释涂板法分离单孢子，菌丝萌发并纯化1次后，显微镜检3次无锁状联合结构的判定为单孢菌株，试管培养保存备用。

(2)双单杂交及杂交菌株的获得：任意选取亲本菌株808的40个单孢菌株，分别与供体亲本菌株融香7号同时接种到PDA平板上进行两两配对杂交，两菌株接种点相距1.5cm，25℃下培养15d，挑取远离融香7号一边的单孢菌株菌丝块接种于新的PDA平板上纯化两次，保存作为d8s7系列候选杂交子。

(3)分别挑取两亲本和杂交子代的菌丝提取各菌株的总DNA，采用引物P1：5'-AGAGAGAGAGAGAGAGT-3'(SEQ ID NO.1)进行PCR扩增，对PCR产物进行电泳，电泳图谱如图1。对电泳图谱进行比对，找出受体亲本808没有而供体亲本融香7号拥有的特异性条带d和e，对d和e两条带在杂交子代中的分布情况进行分析，发现它们在杂交子代中存在分离现象，说明d和e两条带的基因位点分别位于供体亲本融香7号的两个细胞核，即d和e可标识融香7号的两个不同细胞核。

(4)对40个杂交子代基于引物P1的PCR扩增图谱进行分析，当扩增产物中含有e或f特异性条带，则说明该子代为香菇双单杂的交杂合子；若扩增产物中d和e条带均未出现，则说明该子代为未杂交成功的非杂合子，即仍是受体亲本808的单孢菌株；若扩增产物中同时含有d和e条带，则说明该样本为误挑取的供体亲本融香7号。

部分菌株的电泳图见图1，其中M为：DNA marker，泳道1和2分别为亲本菌株808和融香7号，泳道3-16分别为杂交菌株d8s7-1、d8s7-2、d8s7-3、d8s7-7、d8s7-13、d8s7-23、d8s7-24、d8s7-31、d8s7-34、d8s7-39、d8s7-42、d8s7-49、d8s7-52m和d8s7-56m；箭头所指为特异性条带d和e。从图中可见：仅有d条带的杂交子代有：d8s7-2、d8s7-3、d8s7-13、d8s7-23、d8s7-31，仅有e条带的有：d8s7-7、d8s7-24、d8s7-34、d8s7-39、d8s7-42，它们属于真正杂交成功获得的杂合子；两条带都没有的样本有：d8s7-56m，两条带都有的有d8s7-1和d8s7-52m，它们属于没有杂交成功的非杂合子，其中d8s7-56m为受体亲本808的单孢菌株，d8s7-1和d8s7-52m则是误挑取的供体亲本融香7号。

40个杂交子代判断得到的结果如表1所示：

表1不同子代的判断分型结果

由表1可见，采用本申请的方法，能很好的区分香菇808的单孢菌株与融香7号双单杂交的杂交后代，能对香菇808和融香7号的杂交后代进行快速区分和分型。本申请方法确定双单杂交的杂合子27个，分别为：d8s7-2、d8s7-3、d8s7-7、d8s7-8、d8s7-9、d8s7-13、d8s7-23、d8s7-24、d8s7-31、d8s7-34、d8s7-35m、d8s7-37m、d8s7-37e、d8s7-38、d8s7-39、d8s7-42、d8s7-46、d8s7-47、d8s7-52、d8s7-52e、d8s7-57、d8s7-58e、d8s7-66、d8s7-67、d8s7-70、d8s7-70e和d8s7-79。本申请方法将27个杂合子归为两组，其中含有d条带的一组为：d8s7-2、d8s7-3、d8s7-9、d8s7-13、d8s7-23、d8s7-31、d8s7-35m、d8s7-37m、d8s7-37e、d8s7-38、d8s7-46、d8s7-52e、d8s7-57、d8s7-58e、d8s7-66、d8s7-67、d8s7-70、d8s7-70e和d8s7-79共19个菌株，含有e条带的一组为d8s7-7、d8s7-8、d8s7-24、d8s7-34、d8s7-39、d8s7-42、d8s7-47和d8s7-52共8个菌株。本申请方法同时确定剩余13个菌株均为非杂合子，其中d8s7-1、d8s7-15、d8s7-36m、d8s7-36e、d8s7-49、d8s7-52m、d8s7-58m、d8s7-60、d8s7-68、d8s7-74和d8s7-78共11个菌株为误挑取的供体亲本融香7号，d8s7-56m和d8s7-73两个菌株则为未杂交成功的808单孢菌株。

融香7号通过引物P1扩增得到的位于不同核的d条带和e条带，其中，d条带核酸序列如SEQ ID NO.2所示，e条带核酸序列如SEQ ID NO.3所示；

采用d条带的d引物对(其正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物序列如SEQID NO.5所示)对融香7号进行特异性扩增，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性45s，72℃延伸60s，35个循环；72℃补平7min；4℃保存；

采用e条带的e引物对(其正向引物序列如SEQ ID NO.6所示；反向引物序列如SEQID NO.7所示)对融香7号进行特异性扩增，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃复性45s，72℃延伸60s，35个循环；72℃补平7min；4℃保存；

上述反应中，PCR扩增反应体系为：ddH

得到的结果参见图2所示，亲本808既不能被d引物对也不能被e引物对扩增，亲本融香7号则既可以被d引物对也可以被e引物对扩增；拥有d条带标识细胞核的19个杂交菌株d8s7-2、d8s7-3、d8s7-9、d8s7-13、d8s7-23、d8s7-31、d8s7-35m、d8s7-37m、d8s7-37e、d8s7-38、d8s7-46、d8s7-52e、d8s7-57、d8s7-58e、d8s7-66、d8s7-67、d8s7-70、d8s7-70e和d8s7-79只能被d引物对扩增，不能被e引物对扩增；拥有e条带标识细胞核的8个杂交菌株d8s7-7、d8s7-8、d8s7-24、d8s7-34、d8s7-39、d8s7-42、d8s7-47和d8s7-52则只能被e引物对扩增，不能被d引物对扩增；误挑取供体亲本的11个菌株d8s7-1、d8s7-15、d8s7-36m、d8s7-36e、d8s7-49、d8s7-52m、d8s7-58m、d8s7-60、d8s7-68、d8s7-74和d8s7-78与融香7号一样既可以被d引物又可以被e引物扩增，未杂交成功的808单孢菌株d8s7-56m和d8s7-73则与808一样d引物和e引物都不能扩增。可见，d引物对和e引物对配合使用可以精准鉴别融香7号与808单孢菌株双单杂交子代是杂合子还是非杂合子，并可根据导入核将杂合子归类，该引物对判定的结果与P1判定的结果一致。

实施例2：

本实施例作为本申请方法的对照，是采用镜检和拮抗实验对香菇808和融香7号的杂交后代进行鉴定的方法，具体如下：

(1)孢子单核体菌株的获取：亲本香菇菌株808栽培出菇后，选择菇形圆整、开伞七八分的子实体，在无菌环境下采集孢子。采用稀释涂板法分离单孢子，菌丝萌发并纯化1次后，显微镜检3次无锁状联合结构的判定为单孢菌株，试管培养保存备用。

(2)双单杂交及杂交菌株的获得：将分离自菌株808的不同单孢菌株，分别与双核亲本菌株融香7号同时接种到PDA平板上进行两两配对杂交，两菌株接种点相距1.5cm，25℃下培养15d，挑取远离双核亲本菌株一边的单孢菌株菌丝块接种于新的PDA平板上纯化两次，保存作为d8s7系列候选杂交子。

(3)杂交子的镜检和拮抗试验：挑取候选杂交子菌落边缘不同部位菌丝，置于显微镜下观察是否存在锁状联合结构。同时挑取候选杂交子菌丝块，接种于新的PDA平板上分别与两个双核亲本菌株对峙，25℃下培养15d，观察候选杂交子与两亲本菌株的拮抗反应情况。

得到的结果参见表2：

表2备选杂交子与亲本的拮抗反应和菌丝锁状联合检测结果

由表2可知，40个杂交菌株中，与两个亲本菌株均存在明显拮抗且显微检测出菌丝存在锁状联合结构的杂交菌株共有19个，分别是：d8s7-2、d8s7-3、d8s7-7、d8s7-8、d8s7-9、d8s7-13、d8s7-23、d8s7-24、d8s7-31、d8s7-34、d8s7-35m、d8s7-38、d8s7-39、d8s7-42、d8s7-46、d8s7-52、d8s7-57、d8s7-66和d8s7-67，它们可确定为双单杂交的杂合子。菌株d8s7-1、d8s7-52e和d8s7-68三个菌株与两亲本均有拮抗且显微检测菌丝有锁状联合结构，初步鉴定为杂合子，但它们与供体亲本的拮抗不明显，有待进一步确定；d8s7-15、d8s7-36m、d8s7-36e、d8s7-37m、d8s7-37e、d8s7-49、d8s7-52m、d8s7-58m、d8s7-58e、d8s7-60、d8s7-70、d8s7-70e、d8s7-74和d8s7-78共14个菌株与供体亲本无拮抗但显微检测菌丝有锁状联合结构，这些菌株是否为杂合子也有待进一步确定；d8s7-47、d8s7-56m、d8s7-73和d8s7-79四个菌株则在显微检测时未发现菌丝有锁状联合结构，初步鉴定为非杂合子。不明显的拮抗反应与不拮抗反应两者较难区分，如图3中：上排左右图分别为菌株808与808和融香7号与融香7号的拮抗反应图，同一菌株自身两菌落应不存在拮抗反应，所以结果判为不拮抗(表2中标注为“-”)，但图中显示融香7号自身两菌落交界处有轻微隆起，疑似拮抗；而下排的左右两图分别为d8s7-47与808和d8s7-24与融香7号的拮抗反应图，从图判断的结果为d8s7-47与菌株808存在不明显拮抗反应(表中标注为“+”)，而d8s7-24与亲本融香7号存在明显拮抗反应(表中标注为“++”)。从下排的左图与上排的右图对比可见，不明显拮抗与不拮抗反应的差别并不大，极其容易误判。

与本申请方法相比(实施例1)，40个样本中，本实施例的镜检和拮抗实验方法只能确定与亲本均拮抗明显且检测出锁状结构的杂合子19个，而本申请方法共确定了杂合子27个；镜检和拮抗方法将d8s7-1、d8s7-52e和d8s7-68三个菌株初步确定为杂合子，本申请方法则精确鉴定出d8s7-52e为杂合子，而d8s7-1和d8s7-68是误挑取的融香7号，不是杂合子；镜检和拮抗方法将d8s7-47、d8s7-56m、d8s7-73和d8s7-79四个菌株初步鉴定为非杂合子，本申请方法则精准鉴定出d8s7-47和d8s7-79是杂合子，d8s7-56m和d8s7-73是亲本808的单孢菌株，属于非杂合子。可见，传统镜检和拮抗实验鉴定杂合子的方法存在不全面、不确定和误判错判问题，而本申请方法可全面精准鉴别杂交子代是否为杂合子。

实施例3：

本实施例作为本申请方法的对照，是采用传统的ISSR对香菇808和融香7号的杂交后代进行鉴定的方法，具体如下：

(1)单孢菌株的获取：受体菌株808栽培出菇后，分别选择菇形圆整、开伞七八分的子实体，在无菌环境下采集孢子。采用稀释涂板法分离单孢子，菌丝萌发并纯化1次后，显微镜检3次无锁状联合结构的判定为单孢菌株，试管培养保存备用。

(2)双单杂交及杂交菌株的获得：将分离自菌株808的不同单孢菌株，分别与双核供体亲本菌株融香7号同时接种到PDA平板上进行两两配对杂交，两菌株接种点相距1.5cm，25℃下培养15d，挑取远离菌株融香7号一边的单孢菌株菌丝块接种于新的PDA平板上纯化两次，保存作为d8s7系列候选杂交子。

(3)ISSR分析方法，具体如下：

①将两个亲本菌株和候选杂交菌株分别接种至铺有玻璃纸的PDA平板，25℃下培养10d，收集菌丝，提取样本基因组的总DNA，采用4个ISSR引物进行PCR扩增。

其中，ISSR-PCR的反应体系为：10μL的2×Taq PCR MasterMix，10μmol/L的引物1μL，150ng的模板DNA 1μL，8μL的ddH

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s、相应退火温度下复性45s、72℃延伸90s、循环35次，72℃补平7min，4℃保存；

其中，上述ISSR引物及其退火温度如表3所示：

表3供试ISSR引物及其退火温度

将上述扩增产物采用含有GelRed染料的1.0％琼脂糖凝胶电泳，并于凝胶成像系统中观察拍照。

对上述PCR的结果进行分析，具体如下：

反应结束后根据4条引物：P1、P2、P4和P9呈现的条带判定杂交后代是否为菌株香菇808和融香7号双单杂交的杂合子，具体如下：

对四个引物的扩增结果分别进行判定：同一引物的扩增产物中，两亲本菌株中若仅菌株融香7号拥有的特异性条带标记为“a型”，仅菌株808拥有的特异性条带标记为“b型”，菌株融香7号和菌株808共有的条带标记为“c型”。(具体可参见示例图4，图4为引物P9对杂交后代的扩增结果图，图中：M：DNA Marker，泳道1至2为亲本菌株808和融香7号，3至6为杂交菌株d8s7-1、d8s7-2、d8s7-3和d8s7-7；箭头a和b所指分别为亲本菌株808和融香7号的特异性条带，c为两亲本共同条带。)

杂交后代的DNA在同一引物的扩增反应下，扩增产物有“a型”、“b型”或“c型”条带则在相应条带型号栏标记为“1”，否则标记为“0”；

4个引物的扩增结果分别标记好后，再综合4个引物的标记结果。同一菌株，若某一型号条带在引物P1、P2、P4和P9的扩增产物标记结果均为“0”时，则该菌株这一型号条带的综合标记结果为“0”；如4条引物中有任一引物的扩增产物标记该型号条带为“1”，则该菌株这一型号条带的综合标记结果为“1”；

当某一菌株的“a型”和“b型”条带的综合标记结果均为“1”时，则将该菌株判定为香菇808和融香7号双单杂交的杂合子。

上述试验杂交后代的特异性条带标记结果具体如表4：

①P1、P2、P4和P9为采用的4个ISSR引物，a和b分别代表供体亲本融香7号和受体亲本808的特异性条带，c代表两个亲本菌株供体拥有的条带。

②某一型号条带，有扩增谱带用“1”表示，没有扩增谱带用“0”表示；综合结果中，同一菌株，某一型号条带在P1、P2、P4和P9四个引物中只要有一引物有扩增谱带，则该型号条带标记为“1”，若4个引物均无该型号扩增谱带则标记为“0”。

表4不同杂交后代样本的指纹图谱

从本实施例的综合结果来判断可知，传统ISSR方法可确定双单杂交的杂合子27个，分别为：d8s7-2、d8s7-3、d8s7-7、d8s7-8、d8s7-9、d8s7-13、d8s7-23、d8s7-24、d8s7-31、d8s7-34、d8s7-35m、d8s7-37m、d8s7-37e、d8s7-38、d8s7-39、d8s7-42、d8s7-46、d8s7-47、d8s7-52、d8s7-52e、d8s7-57、d8s7-58e、d8s7-66、d8s7-67、d8s7-70、d8s7-70e和d8s7-79；其他13个杂交后代尚无法确定。

与本申请方法相比，本实施例的传统ISSR法确定的27个杂合子与本申请方法(实施例1)的结果完全相同，说明传统ISSR方法鉴别结果准确性高。但是，本实施例方法无法识别杂合子导入核，而本申请方法则可进一步区别不同杂合子的导入核，从而将杂合子归类为2组，有利于子代后期的农艺性状定位和遗传分析。此外，本实施例仍有13个杂交后代无法确定是否为杂合子，因为本实施例仅仅采用4个引物的综合结果，得到这13个菌株不同时拥有a和b特异条带，若增加引物数量，是否部分菌株能够增加特异条带，这些尚无法判断。相反，本申请方法(实施例1)可以确定这13个菌株不是杂合子，并进一步识别出d8s7-1、d8s7-15、d8s7-36m、d8s7-36e、d8s7-49、d8s7-52m、d8s7-58m、d8s7-60、d8s7-68、d8s7-74和d8s7-78共11个杂交菌株是供体亲本菌株融香7号，d8s7-56m和d8s7-73两个菌株则为未杂交成功的808单孢菌株。

综上所述，本申请的ISSR分子标记单引物P1可以扩增出识别供体亲本融香7号两个不同细胞核的特异性条带，利用该特异性条带，可以全面、准确、快捷的判定以融香7号为供体的双单杂交后代是杂合子还是非杂合子，并能将接受相同先导核的杂合子进行归类，还能判断非杂合子来源，是一种简便、快速和有效的香菇双单杂交后代鉴定技术。本申请技术不仅可运用在香菇杂交育种中，其技术思路还可拓展到其他食用菌品种双单杂交的杂合子鉴别中，不足点是不能用于单单杂交中的杂合子鉴别。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院

<120> 鉴别香菇双单杂交杂合子的引物及其鉴别方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagagagag agagagt 17

<210> 2

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggagagagag agagagagtg atagccaatg aaggacggcc cttctcgcag acagaagtca 60

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<210> 3

<211> 586

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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