PDL1抗体在视网膜神经损伤和神经退行性眼病中的应用

摘要

本发明涉及抗PDL1抗体用于治疗视网膜神经损伤和神经退行性眼病的应用。本发明构建了3种视网膜神经损伤和神经退行性眼病小鼠，通过ERG、OCT、H&E等实验证实，玻璃体腔注射抗PDL1抗体能显著减少病变小鼠的视网膜神经细胞损伤，保护视功能，延缓视网膜变薄。体内细胞吞噬实验证实抗PDL1抗体可增强视网膜小胶质细胞的吞噬功能，促进其吞噬凋亡神经元，减少视网膜炎症，促进视功能的恢复。本发明为抗PDL1抗体治疗视网膜神经损伤和神经退行性眼病提供实验依据和理论基础，抗PDL1抗体在制备治疗视网膜神经损伤和神经退行性眼病药物制剂中将有明确的转化应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及抗PDL1抗体在制备治疗视网膜神经损伤和神经退行性眼病的药物中的应用。

背景技术

视网膜神经损伤和神经退行性眼病是一大类以视网膜光感受器细胞损伤变性凋亡为病理特征的疾病。这类疾病严重危害人类视功能，已成为日益突出的主要难治性致盲眼病，包括干性老年性黄斑变性（AMD）、视网膜色素变性（RP）和Stargardt病等，临床上尚缺乏有效的治疗方法。小胶质细胞是视网膜的安全卫士，监视和维持着视网膜的免疫稳态，当发现光感受器细胞损伤或凋亡时，损伤相关模式分子迅速激活小胶质细胞，其发生形变并吞噬这些损伤相关模式分子，发挥“清道夫”作用。当小胶质细胞的吞噬功能受损，视网膜中的损伤相关模式分子聚集，将进一步损伤光感受器细胞等神经元，加重视网膜病理损伤。

程序性死亡配体1（PDL1）在多种恶性肿瘤细胞中过表达，其与T细胞表面常见的免疫抑制成员程序性死亡受体1（PD1）结合，从而帮助肿瘤细胞进行免疫逃逸。因此，抗PDL1/PD1治疗成为促进免疫杀伤肿瘤的又一利器，多款抗PDL1/PD1药物被FDA批准应用于抗肿瘤治疗。PDL1不仅表达在肿瘤细胞上，同时还发现在阿茨海默症中促进异常蓄积病理性蛋白的吞噬，从而延缓阿茨海默症的发展。目前尚无应用抗PDL1抗体针对视网膜小胶质细胞进行吞噬调控，治疗视网膜神经损伤和神经退行性眼病的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中视网膜神经损伤和神经退行性眼病治疗所存在的问题，从而提供了抗PDL1抗体在制备治疗视网膜神经损伤和神经退行性眼病的药物中的应用，其以抗PDL1抗体作为活性成分，能够有效促进小胶质细胞的吞噬能力，促进光感受器细胞的存活，减缓其死亡进程，从而显著缓解视网膜神经损伤，发挥神经保护作用。为临床治疗视网膜神经损伤和神经退行性眼病提供了切实的理论依据。

为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。

本发明第一方面提供了抗PDL1抗体在制备治疗眼部疾病和/或改善与眼部疾病相关生理指标的药物中的应用。

作为优选地，所述眼部疾病选自视网膜神经损伤、神经退行性眼病中的一种或多种。

作为优选地，所述与眼部疾病相关生理指标选自视网膜光感受器细胞层厚度、视网膜神经功能、光感受器细胞凋亡情况、Rhodopsin表达水平、小胶质细胞吞噬功能中的一种或多种。具体地，所述抗PDL1抗体能够有效增加视网膜光感受器细胞层厚度、恢复视网膜神经功能、抑制光感受器细胞凋亡、促进Rhodopsin的表达、提升小胶质细胞的吞噬功能。

本发明第二方面提供了一种治疗眼部疾病和/或改善与眼部疾病相关生理指标的药物组合物，包含抗PDL1抗体、磷酸盐缓冲液，所述抗PDL1抗体的浓度为4-6mg/mL。

作为优选地，所述眼部疾病选自视网膜神经损伤、神经退行性眼病中的一种或多种。

作为优选地，所述与眼部疾病相关生理指标选自视网膜光感受器细胞层厚度、视网膜神经功能、光感受器细胞凋亡情况、Rhodopsin表达水平、小胶质细胞吞噬功能中的一种或多种。具体地，所述抗PDL1抗体能够有效增加视网膜光感受器细胞层厚度、恢复视网膜神经功能、抑制光感受器细胞凋亡、促进Rhodopsin的表达、提升小胶质细胞的吞噬功能。

本发明第三方面提供了一种治疗眼部疾病和/或改善与眼部疾病相关生理指标的药物制剂，包含抗PDL1抗体、磷酸盐缓冲液以及药学上可接受的辅料，所述抗PDL1抗体的浓度为4-6mg/mL。

作为优选地，所述药物制剂剂型选自溶液剂、溶胶剂、乳剂、混悬剂中的一种或多种。

作为优选地，所述眼部疾病选自视网膜神经损伤、神经退行性眼病中的一种或多种。

作为优选地，所述与眼部疾病相关生理指标选自视网膜光感受器细胞层厚度、视网膜神经功能、光感受器细胞凋亡情况、Rhodopsin表达水平、小胶质细胞吞噬功能中的一种或多种。具体地，所述抗PDL1抗体能够有效增加视网膜光感受器细胞层厚度、恢复视网膜神经功能、抑制光感受器细胞凋亡、促进Rhodopsin的表达、提升小胶质细胞的吞噬功能。

作为优选地，所述药物制剂剂型选自溶液剂、溶胶剂、乳剂、混悬剂中的一种或多种。

作为优选地，所述药物制剂剂型选自溶液剂。

作为优选地，所述药学上可接受的辅料选自溶剂、增溶剂、表面活性剂、抑菌剂中、抗氧化剂、螯合剂中的一种或多种。

应注意的是，在无特别说明的情况下，本发明上下文中所述“抗PDL1抗体”或类似表述，均是指能够特异性对程序性死亡配体1（PDL1）产生相互作用的抗体类型，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体等，可通过市售获得也可自行制备而得。为了对相关实验及技术方案的充分展示，以及便于本领域技术人员的理解，本发明上下文中均采用市售抗PDL1抗体（Bioxcell InVivoMAb anti-mouse PD-L1 (B7-H1)，货号为BE0101），但所用抗体并不用于对本发明技术方案和保护范围的限制，所有能够对PDL1产生特异性相互作用的抗体均应理解为本发明所提及的“抗PDL1抗体”的范畴。

本发明相对于现有技术具有如下技术效果：

（1）本发明通过大量研究，充分证实了抗PDL1抗体对于视网膜神经损伤和神经退行性眼病的相关治疗作用。在化学物诱导的视网膜神经损伤、光诱导的视网膜损伤、以及基因突变自发性视网膜退行性变的小鼠模型中，玻璃体腔内注射抗PDL1抗体均可以有效改善视网膜外核层变薄，促进视网膜视功能的恢复，减少光感受器细胞的凋亡，为临床治疗视网膜神经损伤和神经退行性眼病开辟了新的治疗思路。

（2）本发明对抗PDL1抗体在治疗视网膜神经损伤和神经退行性眼病中的相关机制进行了深入研究，明确了抗PDL1抗体能够激活视网膜小胶质细胞，提升其吞噬能力，加速小胶质细胞清除视网膜中的损伤相关模式分子，保护光感受器细胞，保护视功能。应用抗PDL1抗体能改善该细胞导致的视网膜微环境，为后续视网膜神经损伤和神经退行性眼病的治疗及药物开发提供了切实的理论依据。

附图说明

图1为抗PDL1抗体对MNU诱导视网膜神经损伤小鼠的光感受器细胞丢失影响结果示意图。

图2为抗PDL1抗体对MNU诱导视网膜神经损伤小鼠的光感受器细胞丢失影响定量结果示意图，*

图3为抗PDL1抗体对光诱导的视网膜损伤小鼠视网膜厚度影响结果示意图。

图4为抗PDL1抗体对光诱导的视网膜损伤小鼠视网膜厚度影响定量结果示意图，*

图5为抗PDL1抗体对自发性视网膜退行性变小鼠光感受器细胞凋亡及其Rodopsin表达水平影响结果示意图。

图6为抗PDL1抗体对自发性视网膜退行性变小鼠光感受器细胞凋亡影响定量结果示意图，**

图7为抗PDL1抗体对自发性视网膜退行性变小鼠视功能神经功能的恢复影响结果示意图，*

图8为抗PDL1抗体对MNU诱导视网膜神经损伤小鼠视网膜小胶质细胞吞噬功能影响结果示意图。

图9为抗PDL1抗体对MNU诱导视网膜神经损伤小鼠视网膜小胶质细胞吞噬功能影响定量结果示意图，**

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在无特别说明的情况下，本发明所使用的试剂、耗材以及仪器中，均通过市售获得。动物伦理及所有实验操作均符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》。本发明所使用的实验方法，例如免疫组化、细胞实验、动物实验等均为本领域的常规方法和技术。

生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SEM展示。所有体外实验至少重复三次，动物实验重复两次。数据采用GraphPad Prism 8.0或SPSS 22.0软件进行分析。采用t检验、卡方检验、方差分析等常规医学统计学方法比较两组或两组以上的平均值差异。

实施例1 疾病模型的构建

包括干性老年性黄斑变性（AMD）、视网膜色素变性（RP）和Stargardt病等在内的视网膜神经损伤和神经退行性眼病，是一大类以视网膜光感受器细胞损伤变性凋亡为病理特征的疾病，目前临床上尚缺乏有效的治疗方法。视网膜神经损伤和神经退行性眼病是一个复杂的过程，致病因素多样，目前尚没有一种动物模型可以充分模拟人类疾病的真实情况，尚没有统一的动物模型，视网膜光感受器细胞损伤的小鼠模型大致分为两类：诱导型和遗传型。

为了充分说明抗PDL1抗体对于视网膜神经损伤和神经退行性眼病的相关治疗作用，本实施例在包括化学物（MNU）诱导的视网膜神经损伤、光诱导的视网膜损伤（LightDamage，LD）、以及基因突变自发性视网膜退行性变（rd10）在内的3种小鼠模型中，分别进行了验证与说明。

1、化学诱导的视网膜神经损伤

N-甲基-N-亚硝基脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU）是一种烷化剂，能特异性诱导视网膜光感受器细胞凋亡，常用于化学诱导的视网膜变性疾病模型的建立。本实施例利用MNU构建化学诱导的视网膜变性模型，具体步骤如下：

（1）称取MNU溶解于磷酸盐缓冲液（Phosphate-Buffered Saline，PBS）中，配制成15mg/mL的浓度备用；

（2）将8-10周的C57BL/6J小鼠随机分成两组，每组10只，组1为MNU诱导造模+IgG对照组；组2为MNU诱导造模+抗PD-L1 nab干预组；

（3）给每只小鼠称重并记录，按照40mg/kg的给药剂量腹腔注射配制好的MNU溶液进行造模。之后，组1小鼠给予玻璃体腔注射1μL lgG溶液（Bioxcell InVivoPlus ratIgG2b isotype control，货号为BP0090），组2小鼠给予玻璃体腔注射1μL抗PD-L1 nab（抗体浓度为4.69mg/ml）；

（4）造模日计为D0，于D3重复注射IgG或抗PD-L1 nab，造模D7取材，评估治疗效果。

2、光诱导的视网膜神经损伤

（1）将8-10周的C57BL/6J小鼠随机分成两组，每组10只，组1为光损伤诱导造模+IgG对照组；组2为光损伤诱导造模+抗PD-L1 nab干预组；

（2）将待造模小鼠提前暗适应12h，充分散瞳后将小鼠放在一个自制的通风的内壁反光的容器中，容器中放置食物和水，容器上方固定有一个冷白光LED光源，调节光源的照度为10，000 lux，并用照度计进行检测校正。将小鼠放入容器中照射4h造模；

（3）光损伤造模结束后，组1小鼠组给予玻璃体腔注射1μL IgG溶液（BioxcellInVivoPlus rat IgG2b isotype control，货号为BP0090），组2小鼠给予玻璃体腔注射1μL抗PD-L1 nab（抗体浓度为4.69mg/ml）；之后于正常光照交替的设施中饲养所有小鼠；

（4）造模日计为D0，于D3重复注射vehicle或抗PD-L1 nab，造模D5取材，评估治疗效果。

3、基因突变自发性视网膜退行性变的小鼠模型

本实施例中采用的基因突变自发性视网膜退行性变的小鼠模型为B6.CXB1-Pde6brd10/J（rd10）小鼠。该小鼠为Pde6b基因第13外显子自发错义点突变引起的小鼠视网膜色素变性。Pde6b基因被确定为视网膜变性疾病的常见致病基因之一，与人类常染色体隐性遗传性视网膜色素变性(autosomal recessive retinitis pigmentosa，ARRP)相关。Pde6b基因编码视杆细胞cGMP磷酸二酯酶的B亚基(beta-subunit of phosphodiesterase，PDEβ)，cGMP PDE通过调节细胞中特定部位的cGMP水平参与脊椎动物视觉传导的级联反应，Pde6b基因突变导致了PDE功能的丧失，使得cGMP不能变成GMP而光传导被阻断，并最终导致光感受器细胞的凋亡。

Rd10在4周龄时表现出硬化性视网膜血管，16天开始进行性视网膜外核层变性，并且视杆和视锥ERG a-和b-波进行性下降，光感受器细胞死亡的峰值大约在25天左右。具体步骤如下：

（1）小鼠出生当天计为P0，正常交替光照环境下饲养，将同窝小鼠随机分成两组，每组10只，组1为rd10+IgG对照组；组2为rd10+抗PD-L1 nab干预组；

（2）分别于P16、P19、P21进行玻璃体腔注射，组1小鼠每次分别注射1μL IgG，组2小鼠每次分别注射1μL抗PD-L1 nab，P25取材，评估治疗效果。

实施例2 石蜡切片 H&E 染色观察视网膜结构变化

（1）在实施例1经化学诱导的视网膜神经损伤小鼠模型造模的取材日，处死小鼠，摘取眼球，置于FAS混合固定液中24h；

（2）梯度乙醇中进行脱水12小时，之后依次在二甲苯浸泡2小时、65℃石蜡浸泡3-4h进行透化和浸蜡；

（3）自动包埋机将组织包制，切片机获得取3-4μm切片贴附于载玻片上；

（4）H&E染色：二甲苯脱蜡，100%、95%、75%梯度酒精清洗至水化；苏木精浸染10-15分钟进行染色，流动水清洗；分化、返蓝：1％盐酸酒精分化1-2秒，饱和氨水蓝化数秒流水冲洗15-30分钟；伊红染色：以1％醇溶性伊红浸染5-15秒；常规脱水、透明、封片。

检测结果如图1-2所示。在MNU诱导的视网膜神经损伤小鼠中，进行抗PDL1抗体玻璃体腔内注射，取小鼠眼球进行病理切片HE染色，结果显示视网膜外核层明显增厚，提示光感受器细胞丢失减少。病理结果显示抗PDL1抗体可有效抑制MNU诱导视网膜神经损伤小鼠的光感受器细胞丢失。

实施例3 光学相干断层扫描进行视网膜厚度活体测量

（1）在实施例1中经光诱导的视网膜神经损伤小鼠模型造模的取材日，采用光学相干断层扫描仪（海德堡，德国）对上述各组小鼠进行视网膜扫描。待检查小鼠腹腔内注射0.5%戊巴比妥钠（0.1mL/10g）进行麻醉；

（2）用复方托吡卡胺滴眼液对小鼠进行散瞳，并注意点水保持角膜湿润，调整小鼠体位，充分暴露眼底，以视盘为中心进行放射状和矩形两种方式的扫描；

（3）用Heidelberg EyE Explorer License Manager3.0.1软件测量并分析结果，在三维成像中，测量距离视盘半径1.5mm的圆形区域内视网膜的平均厚度。

检测结果如图3-4所示。结果显示，在光诱导的视网膜损伤小鼠中，进行抗PDL1抗体玻璃体腔内注射，活体下麻醉进行OCT检测视网膜结构，结果显示视网膜外核层明显增厚，表明抗PDL1抗体可以显著增加光诱导的视网膜损伤小鼠外核层厚度。

实施例4 视网膜冰冻切片免疫荧光TUNEL染色显示显示光感受器细胞死亡情况

（1）在实施例1经基因突变自发性视网膜退行性变的小鼠模型取材日，对各组小鼠进行颈椎脱臼处死，摘取眼球，置于20倍以上体积的4% PFA中室温预固定10min，在角膜表面均匀扎孔，4% PFA中继续室温固定50min；

（2）将PFA中固定的眼球捞出，依次放入15%和30%蔗糖溶液中脱水，待沉底后捞出，OCT包埋，-80℃冷冻过夜；

（3）将冷冻好的标本取出，过视神经截面切厚约10μm的冰冻切片；

（4）冷冻切片在室温下用0.5% Triton-X100/5% BSA封闭1小时，在4℃与按照1:100稀释的一抗视紫红质（Rhodopsin）抗体孵育过夜。PBST洗涤后，用二抗孵育1小时。PBST洗涤后，加入TUNEL试剂37℃孵育1h（注意保湿），之后在室温下用DAPI (Invitrogen)复染5分钟后封片。

（5）于荧光共聚焦显微镜下观察并照相，统计视野下TUNEL阳性细胞数量。

实验结果如图5-6所示。结果显示，通过取小鼠眼球进行冰冻切片染色，发现抗PDL1抗体治疗组能够显著抑制外核层光感受器细胞的凋亡，同时促进Rhodopsin的表达。

实施例5 视网膜电生理检测小鼠视网膜视功能

（1）在实施例1经基因突变自发性视网膜退行性变的小鼠模型取材前1日，将待检测小鼠暗适应12h，之后腹腔注射0.5%戊巴比妥钠进行麻醉，复方托吡卡胺滴眼液散瞳。

（2）用Celeris系统(diagnostics LLC， Lowell，MA，USA)进行ERG检测，并按照国际临床视觉电生理标准化方案实施刺激，实验全程在微弱红光照明条件下进行；

（3）以接触角膜表面的镀金线环电极作为活性电极记录ERGs。将不锈钢针电极插入眼睛附近的皮肤和尾部，分别作为参考导线和接地导线；

（4）利用从0.03cd·s/m

实验结果如图7所示。结果显示，在自发性视网膜退行性变小鼠中，进行抗PDL1抗体玻璃体腔内注射，活体下麻醉进行ERG检查后显示抗PDL1抗体治疗能够有效促进视网膜退行性变小鼠视功能神经功能的恢复。

实施例6 视网膜小胶质细胞吞噬功能检测

（1）将pHrodo Green Zymosan Bioparticles (Thermo Fisher Scientific)配制为20mg/mL的混悬液备用；

（2）0.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉实施例1中经化学诱导的视网膜神经损伤模型待检测小鼠，复方托吡卡胺滴眼液散瞳，玻璃体腔注射1μL配制好的pHrodo Green ZymosanBioparticles溶液；

（3）注射4h后处死小鼠，摘取眼球，4%PFA固定1h，解剖分离完整的视网膜；

（4）将视网膜用封闭溶液(0.5% Triton-X100/5% BSA)4℃孵育过夜。按照1：100的比例用封闭液稀释一抗iba-1抗体，4℃下与视网膜孵育2晚；

（5）PBST洗涤后，将视网膜在室温下用二抗孵育2h，PBST洗涤后并将其在载玻片上切割为花瓣样四瓣并充分铺平。共聚焦显微镜拍摄图像，并统计视野下吞噬pHrodo GreenZymosan Bioparticles的小胶质细胞比例。

检测结果如图8-9所示。结果显示，在经化学诱导的视网膜神经损伤小鼠模型中，进行抗PDL1抗体玻璃体腔内注射治疗，并在玻璃体腔内注射Green Zymosan荧光磁珠作为指示剂，4小时后取视网膜行铺片染色，结果显示抗PDL1抗体治疗组的IBa1阳性的小胶质细胞吞噬Green Zymosan荧光磁珠明显增多，证明抗PDL1抗体能够有效提升小胶质细胞的吞噬功能。

综合上述可知，本发明通过光学相干断层扫描、视觉电生理、视网膜免疫荧光染色等实验证实，玻璃体腔注射抗PDL1抗体能增强视网膜小胶质细胞的吞噬能力，促进细胞碎片的清除，减少凋亡细胞沉积，减轻神经炎症，保护视功能，延缓视网膜变薄。本发明为抗PDL1抗体治疗视网膜神经损伤和神经退行性眼病及抗PDL1抗体作为神经保护剂的潜在临床应用提供实验依据和理论基础，抗PDL1抗体在制备治疗视网膜神经损伤和神经退行性眼病药物制剂中，有明确的临床应用前景。

以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。