一种基于泊洛沙姆的可注射骨修复水凝胶制作方法

摘要

本发明提供了一种基于泊洛沙姆的可注射骨修复水凝胶制作方法，属于医用材料技术领域。本发明可注射骨修复水凝胶制作方法，包括如下步骤：提供一种羧甲基壳聚糖‑海藻酸钠纳米颗粒，将羧甲基壳聚糖和海藻酸钠乳化后在三聚磷酸钠的作用下交联，获得羧甲基壳聚糖‑海藻酸钠纳米颗粒；提供一种泊洛沙姆水凝胶，将泊洛沙姆和纳米羟基磷灰石在搅拌条件下混合，获得泊洛沙姆‑纳米羟基磷灰石水凝胶；提供一种可注射骨修复水凝胶，将所述羧甲基壳聚糖‑海藻酸钠纳米颗粒加入到所述泊洛沙姆‑纳米羟基磷灰石水凝胶中，搅拌混合，获得可注射骨修复水凝胶。本发明可注射骨修复水凝胶具备温敏可注射性，并且具有较好的成骨生物性能。

说明书

技术领域

本发明涉及医用材料技术领域，具体涉及一种基于泊洛沙姆的可注射骨修复水凝胶制作方法。

背景技术

对于临床上大量存在的不规则骨缺损，传统骨修复材料需在体外预制成型，经过手术切开后植入体内，病人需承受手术创伤，这种方式创伤较大，且不能完全充填骨缺损。近年来，伴随着微创外科的发展，可注射自固化材料的应用克服了这个问题。在精确手术定位下，注射材料只需微小的创伤即可到达骨缺损部位，在一定时间里固化并达到合适的机械强度，刺激新骨生成或为成骨细胞提供良好的支架，自身则在缺损修复过程中逐渐降解。目前临床常用的可注射性骨修复材料有磷酸钙骨水泥(CPC)和半水α-硫酸钙(CSH)。CPC具有良好的骨诱导性和骨传导性，但其注射性能差，易塌陷。CSH与水混合后，转化为二水硫酸钙(CSD)，强度高，不易崩塌，但缺乏骨诱导活性。理想的骨缺损修复材料需要生物相容性、骨传导性、骨诱导性等。根据天然骨设计的仿生人工骨结构往往由有机和无机材料构成基本支架，这也是目前骨移植替代物的主要研究方向。水凝胶具有固有的生物相容性、生物降解性和可注射性，可以通过注射器注射，然后自组装成一个完整的物体，封闭缺损的复杂轮廓，实现缺损的完全填充，而且水凝胶做为一个缓释载体，能够使功能材料性能发挥更稳定。此外，水凝胶的其3D微环境可支持细胞粘附和增殖，且其的生物学特性可以进一步调整以匹配靶组织的特性。

泊洛沙姆是由聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)组成的三嵌段共聚物，是一种温敏性合成聚合物，通常用来制备可注射水凝胶。泊洛沙姆通过聚合物内环氧乙烷和环氧丙烷间的亲疏水相互作用，能够在高于其临界溶液温度时形成水凝胶。因此，随着温度改变，泊洛沙姆溶液表现出溶胶－凝胶可逆转变，利用这一特性有望应用于原位骨修复。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于泊洛沙姆的可注射骨修复水凝胶制作方法以及使用这种方法制得的可注射骨修复水凝胶，该水凝胶具备温敏可注射性，常温呈液态，体温下呈固态，具有较好的注射性能。

为达到上述发明目的，采用如下技术方案。

一种基于泊洛沙姆的可注射骨修复水凝胶制作方法，包括如下步骤：

提供一种羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒，将羧甲基壳聚糖和海藻酸钠乳化后在三聚磷酸钠的作用下交联，获得羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒；

提供一种泊洛沙姆水凝胶，将泊洛沙姆和纳米羟基磷灰石在搅拌条件下混合，获得泊洛沙姆-纳米羟基磷灰石水凝胶；

提供一种可注射骨修复水凝胶，将所述羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒加入到所述泊洛沙姆-纳米羟基磷灰石水凝胶中，搅拌混合，获得可注射骨修复水凝胶；

其中泊洛沙姆-纳米羟基磷灰石水凝胶和可注射骨修复水凝胶在37℃以上为凝胶状态。

优选地，泊洛沙姆-纳米羟基磷灰石水凝胶和可注射骨修复水凝胶在20-37℃(不包含37℃)为液态，37-45℃为凝胶状态。

优选地，一种基于泊洛沙姆的可注射骨修复水凝胶制作方法，包括如下步骤：

取羧甲基壳聚糖和海藻酸钠，加入去离子水搅拌获得混合溶液；加入液体石蜡继续搅拌，然后用超声波振动使其完全乳化；加入表面活性剂继续搅拌后，缓慢滴加三聚磷酸钠溶液，继续搅拌至完全交联；将反应溶液滴至无水乙醇中，离心并去除上清液，洗涤后再悬浮并冷冻干燥即得羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒；

取泊洛沙姆溶液加入羟基磷灰石，搅拌均匀后加入羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒，再次搅拌均匀即得可注射骨修复水凝胶。

优选地，羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的用量比为1-4mg/mL:0.5-2mg/mL。

更优选地，混合溶液中羧甲基壳聚糖溶液的浓度为1-4mg/mL；海藻酸钠溶液的浓度为0.5-2mg/mL。

优选地，去离子水和液体石蜡的体积比为5-15:2-8。

优选地，去离子水和表面活性剂Span80的体积比为5-15:0.8-1。

优选地，泊洛沙姆-纳米羟基磷灰石水凝胶中泊洛沙姆的浓度为22-28wt％。

优选地，泊洛沙姆-纳米羟基磷灰石水凝胶中纳米羟基磷灰石的浓度为7-13wt％。

优选地，羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒的浓度为1-10mg/mL。

优选地，上述泊洛沙姆为泊洛沙姆407。

泊洛沙姆407具有温敏性，室温下为液体，随着温度的升高而变成凝胶状态，因此具有良好的注射性能。然而，现有技术中单独使用泊洛沙姆在骨组织工程中的应用受到限制。在本发明中，使用具有温度敏感特性的泊洛沙姆做为支架，纳米羟基磷灰石用于提供成骨生成无机成分，并以纳米羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米粒发挥骨诱导作用，构建出一种注射性能好、具有骨诱导和骨引导作用的骨组织原位修复支架体系。

优选地，可注射骨修复水凝胶制作方法，包括如下步骤：

步骤(1)羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒的制备：

准确称取羧甲基壳聚糖和海藻酸钠，加入去离子水，使得羧甲基壳聚糖的浓度为1-4mg/mL，海藻酸钠的浓度为0.5-2mg/mL；在室温下用磁力搅拌器以200-250r/min搅拌1-2h；加入的液体石蜡，去离子水和液体石蜡的体积比为5-15:2-8；搅拌10-20min，然后用超声波振动15-20min，使其完全乳化；加入的表面活性剂Span80，去离子水和表面活性剂Span80的体积比为5-15:0.8-1，调整转速为500-600r/min，继续搅拌30-60min，缓慢滴加1-4mg/mL的三聚磷酸钠溶液，使三聚磷酸钠终浓度达到1-4mg/mL；滴下后调整转速为200-250r/min，继续搅拌1-2h至完全交联；交联反应温度为30-50℃，pH为5-9；将交联反应溶液滴至-20至-25℃无水乙醇中，交联反应溶液与无水乙醇的体积比为1:5-9；滴加完毕后离心25-35min，并去除上清液；用去离子水冲洗沉淀物以去除表面乙醇，再悬浮并冷冻干燥即得羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒。

步骤(2)可注射载药水凝胶的制备：

取浓度为20-30％的泊洛沙姆溶液加入羟基磷灰石，使得羟基磷灰石的终浓度为6-14％，搅拌均匀后加入羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒，使得羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒的终浓度为1-10mg/mL，再次搅拌均匀即得可注射骨修复水凝胶。

本发明还公开了上述制作方法制得的可注射骨修复水凝胶。

优选地，可注射骨修复水凝胶还包括桑色素和普拉格雷。

桑色素自身具有一定抗菌性，可以避免可注射骨修复水凝胶在制备或使用过程中收到细菌污染；普拉格雷自身具有减少血小板凝集的作用，使用过程中可以避免注射处产生较大血栓，更有利于细胞吸附在可注射骨修复水凝胶上；而桑色素和普拉格雷共同使用时，产生协同作用加速了成骨细胞增生。

本发明还公开了上述的羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒在制备可注射骨修复水凝胶中的用途。

本发明还公开了上述的羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒和/或可注射骨修复水凝胶在制备促进成骨细胞碱性磷酸酶表达的药品和/或材料中的用途。

本发明还公开了上述的羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒和/或可注射骨修复水凝胶在制备促进成骨细胞钙化的药品和/或材料中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明制得的可注射骨修复水凝胶具备温敏可注射性，常温呈液态，体温下呈固态，具有较好的注射性能。该可注射骨修复水凝胶还具备骨生成所具备的无机成分纳米羟基磷灰石，以及能够诱导骨生成的羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒，具有较好的成骨生物性能，可以促进成骨细胞碱性磷酸酶表达以及促进成骨细胞钙化。此外，通过不同组分间比例的调控，获得了能够满足临床非承重下不同形态骨缺损修复的需求，能够很好的固定自体骨于骨缺损位置，避免异位成骨。本发明可注射骨修复水凝胶中还添加有桑色素和普拉格雷，在为可注射骨修复水凝胶提供抗菌性和抗血小板凝集功能的同时，还能够协同作用，进一步促进成骨细胞增殖，从而提高骨修复的速度。

附图说明

图1为纳米颗粒的粒径和分散系数测定结果；

图2为透射电子显微镜下最佳合成条件下纳米颗粒的形态；

图3为成骨细胞增殖测定结果；

图4为ALP表达的测定结果；

图5为使用碱性磷酸酶检测不同浓度羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒培养后成骨细胞的活性；其中A为纳米颗粒含量为0μg/mL的检测结果；B为纳米颗粒含量为125μg/mL的检测结果；C为纳米颗粒含量为250μg/mL的检测结果；D为纳米颗粒含量为500μg/mL的检测结果；E为纳米颗粒含量为1000μg/mL的检测结果；F为纳米颗粒含量为2000μg/mL的检测结果；

图6为使用茜素红检测不同浓度羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒培养后成骨细胞的矿化程度；其中A为纳米颗粒含量为0μg/mL的检测结果；B为纳米颗粒含量为125μg/mL的检测结果；C为纳米颗粒含量为250μg/mL的检测结果；D为纳米颗粒含量为500μg/mL的检测结果；E为纳米颗粒含量为1000μg/mL的检测结果；F为纳米颗粒含量为2000μg/mL的检测结果；

图7为不同浓度泊洛沙姆的可注射性和不同浓度泊洛沙姆-羟基磷灰石水凝胶可塑性观察结果；

图8为可注射骨修复水凝胶的溶血试验测定结果；

图9为可注射骨修复水凝胶对成骨细胞增殖情况的影响测定结果；

图10为可注射骨修复水凝胶对成骨细胞增殖情况的影响电镜观察结果；

图11为可注射骨修复水凝胶体外骨诱导特性的测定结果。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下试验中所使用试剂盒以及培养基均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；所使用细胞均为MC3T3小鼠成骨细胞，购自上海冠导生物工程有限公司。

本公开实施例提供一种羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒，其具有合适的粒径和分散性，并且具有促进碱性磷酸酶表达和促进成骨细胞钙化的作用。

在一可选的实施方式中，羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒的制备方法包括：

1、采用乳液离子交联法制备了羧甲基壳聚糖(CMCS)-海藻酸钠纳米(SA)粒子。准确称取一定量的CMCS和SA，加入15mL去离子水，使CMCS和SA的终浓度如表1所示，之后在室温下用磁力搅拌器以250r/min搅拌1.5h。

2、加入液体石蜡，搅拌15min，然后用超声波振动15min，使其完全乳化。加入表面活性剂Span80，调整转速为600r/min，继续搅拌45min，缓慢滴加三聚磷酸钠溶液，滴下后调整转速为250r/min，继续搅拌1.5h至完全交联；液体石蜡、表面活性剂Span80、三聚磷酸钠(TTP)的加入量如表1所示。

3、将交联反应溶液滴至-20℃的无水乙醇中，交联反应溶液和无水乙醇的体积比为1:6，滴加完毕后离心30min(4℃，11000r/min)，并去除上清液，用去离子水冲洗沉淀物三次以去除表面乙醇，再悬浮并冷冻干燥即得羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒。

表1羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒合成条件

本公开实施例还提供一种可注射性和可塑性良好的泊洛沙姆水凝胶。

在一可选的实施方式中，泊洛沙姆水凝胶中含有10wt％的泊洛沙姆。

在一可选的实施方式中，泊洛沙姆水凝胶中含有20wt％的泊洛沙姆。

在一可选的实施方式中，泊洛沙姆水凝胶中含有25wt％的泊洛沙姆。

在一可选的实施方式中，泊洛沙姆水凝胶中含有30wt％的泊洛沙姆。

本公开实施例还提供一种泊洛沙姆水凝胶，由泊洛沙姆和纳米羟基磷灰石在搅拌条件下混合，获得泊洛沙姆-纳米羟基磷灰石水凝胶。泊洛沙姆和纳米羟基磷灰石的加入量如表2所示，余量为去离子水。

表2泊洛沙姆-纳米羟基磷灰石水凝胶合成条件

本公开实施例还提供一种可注射的可注射骨修复水凝胶，其具有良好的血液相容性，能够促进成骨细胞增殖、钙化以及促进碱性磷酸酶分泌。

在一可选的实施方式中，可注射的可注射骨修复水凝胶的制备方法包括：

将羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒加入到10mL实施例11制得的泊洛沙姆-纳米羟基磷灰石水凝胶中，搅拌混合，获得可注射骨修复水凝胶。其中羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒的浓度如表3所示。

表3可注射的可注射骨修复水凝胶合成条件

在一可选的实施方式中，可注射的可注射骨修复水凝胶的制备方法包括：

将羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒加入到10mL实施例11制得的泊洛沙姆-纳米羟基磷灰石水凝胶中，使终浓度达到10000μg/mL，加入桑色素和普拉格雷搅拌混合，获得可注射骨修复水凝胶。其中桑色素和普拉格雷的浓度如表4所示。

表4可注射的可注射骨修复水凝胶合成条件

试验例1

一、羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒性能测定

1、通过粒度分析仪测量实施例1-9中制得的羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒的粒径和分散系数PDI。测定结果如图1所示。其中图1-1为实施例1、2、3的测定结果；图1-2为实施例4、5、6的测定结果；图1-3为实施例7、8、9的测定结果。

由图1可知CMCS 2mg/mL，SA 1mg/mL，30℃，pH＝9为最优合成体系，具备较为均匀且大小合适的粒径。

2、使用透射电子显微镜验证干燥条件下最优合成条件下纳米颗粒的形态，测定结果如图2所示，进一步证实纳米颗粒合成成功。

二、羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒体外生物性能测定

使用MC3T3细胞检测实施例9中制得的羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒的生物学特性。

1、使用含有不同浓度(0μg/mL；125μg/mL；250μg/mL；500μg/mL；1000μg/mL；2000μg/mL)的羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒的培养基培养成骨细胞，培养1、3、5和7天后，使用CCK-8试剂检测细胞增殖，测定结果如图3所示。

由图3可知不同浓度的纳米颗粒在第3天开始，增殖速度快于空白对照组，第7天基本持平；增殖速度快于空白对照组说明羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒具有促进成骨细胞增殖的作用，而第7天时与空白对照基本持平则是由于细胞数量过多产生了接触抑制所致。

2、使用碱性磷酸酶ALP定量检测试剂盒在第7天检测使用含有不同浓度(0μg/mL；125μg/mL；250μg/mL；500μg/mL；1000μg/mL；2000μg/mL)的羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒的培养基培养的成骨细胞的ALP表达。

检测结果如图4所示。由图4可知羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒可以促进成骨细胞碱性磷酸酶表达。

3、分别使用碱性磷酸酶和茜素红检测使用含有不同浓度(0μg/mL；125μg/mL；250μg/mL；500μg/mL；1000μg/mL；2000μg/mL)的羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒的培养基培养的成骨细胞的活性和矿化程度，以确定成骨分化潜能。检测结果如图5和图6所示。

由图5和图6可知不同浓度的羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒对成骨细胞均具有不同程度的促进碱性磷酸酶表达和钙化的作用，其中，A为0μg/mL；B为125μg/mL；C为250μg/mL；D为500μg/mL；E为1000μg/mL；F为2000μg/mL。从图5和图6可看出，1mg/mL效果最佳。

试验例2

泊洛沙姆水凝胶和泊洛沙姆-纳米羟基磷灰石水凝胶性能测试

1、泊洛沙姆水凝胶固化时间

采用小瓶倒置法测定了浓度为10wt％、20wt％、25wt％、30wt％的泊洛沙姆水凝胶的固化时间，具体操作为：将2mL凝胶添加到玻璃瓶中，并放置在37摄氏度下，直到凝胶溶液不再流动。

观察结果如图7-1所示。从左到右四列照片分别为浓度为10wt％、20wt％、25wt％、30wt％的泊洛沙姆水凝胶；第一排为室温下泊洛沙姆水凝胶的状态，第二排为37℃下泊洛沙姆水凝胶的状态。

由图7-1可知，浓度为20wt％及以下的泊洛沙姆水凝胶室温及37℃(15min)均无法成胶，而浓度为30wt％的泊洛沙姆水凝胶在室温和37℃(0min)均成胶，因此浓度在20wt％以下或在30wt％以上的泊洛沙姆均不适合做为可注射水凝胶。浓度为25wt％的泊洛沙姆室温下不成胶，但在37℃，2min即可成胶，因此浓度为25wt％的泊洛沙姆可作为最佳浓度制备泊洛沙姆-纳米羟基磷灰石水凝胶。

2、泊洛沙姆-纳米羟基磷灰石水凝胶可注射性与可塑性

在室温下用注射器注入取实施例10、11、12制得的泊洛沙姆-纳米羟基磷灰石水凝胶，然后注入37℃的水中，观察水凝胶的可注射性和可塑性。

观察结果如图7-2所示。

由图7-2可知，添加10％羟基磷灰石时，泊洛沙姆的性能较为稳定；而添加5％羟基磷灰石容易分叉，添加15％羟基磷灰石容易断裂。

试验例3

可注射骨修复水凝胶的性能测试

一、溶血试验

向EDTA抗凝管中加入3mL新鲜小鼠血，离心(2000rpm，4℃)，丢弃上清液，加入等量0.9％生理盐水，离心，重复三次。0.1MPBS(10×PBS)重新悬浮红细胞并稀释50倍，以获得红细胞悬浮液。分别将900μL红细胞悬浮液添加100μL实施例13、18、19中制得的可注射骨修复水凝胶中。红细胞悬浮液分别添加生理盐水和TritonX-100(1％)用作阴性和阳性对照。37℃孵育60min后，离心(2000rpm，5min)，取上清液100μL于96孔板上，在541nm处测量其吸光度值。计算溶血率。

溶血率(％)＝(样品吸光度-阴性对照吸光度)/阳性对照吸光度×100％。

测定结果如图8-1和8-2所示。图8-1中从左至右依次为阳性对照、阴性对照、实施例13、18、19中制得的可注射骨修复水凝胶的测定结果。

由图8-1可知，本发明水凝胶无明显溶血；由图8-2可知实施例13、18、19中制得的可注射骨修复水凝胶溶血率均小于3％，符合植入体内血液相容性要求。

二、促进成骨细胞增殖能力测定

1、用含有不同浓度的羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒的可注射骨修复水凝胶(实施例13、实施例18，实施例19)以及实施例20、21、22，构建细胞浓度为5×10

由图9可知，负载不同浓度羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒的泊洛沙姆-纳米羟基磷灰石水凝胶，均能促进成骨细胞增殖，并且加入5000μg/mL和10000μg/mL的纳米颗粒促进效果较优且效果相近；而加入桑色素和普拉格雷的可注射骨修复水凝胶具有更优的促进成骨细胞增殖的作用，单独添加桑色素或普拉格雷不能进一步促进成骨细胞增殖。

2、用含有不同浓度的羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒的可注射骨修复水凝胶(实施例13、实施例18，实施例19)，构建细胞浓度为2×10

由图10可知含有不同浓度羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒的可注射骨修复水凝胶均能促进成骨细胞增殖。

三、体外骨诱导特性测定

碱性磷酸酶活性测定：含有不同浓度羧甲基壳聚糖-海藻酸钠纳米颗粒的可注射骨修复水凝胶(空白对照、实施例13、实施例18)在24孔板中培养7天。PBS洗涤两次后，在室温下用4％多聚甲醛固定20min，然后用PBS洗涤两次。碱性磷酸酶显色试剂盒37℃孵育4h，PBS洗涤2次，显微镜下观察。

茜素红S染色：含有不同浓度纳米颗粒的水凝胶(实施例13、18、19)在24孔板中培养7天。PBS洗涤两次后，在室温下用4％多聚甲醛固定20min，然后用PBS洗涤两次。在室温下用0.5％茜素红孵育20min，用PBS冲洗两次，并在显微镜下观察钙化结节。

观察结果如图11所示。

由图11可知实施例13和18制得的可注射骨修复水凝胶具有较好的促进碱性磷酸酶分泌和促进胞外钙盐沉积进而促进骨化的作用。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。