Bestrophin3血管平滑肌特异性基因敲除小鼠和主动脉夹层小鼠模型的构建方法

摘要

本发明公开Bestrophi n3血管平滑肌特异性基因敲除小鼠和主动脉夹层小鼠模型的构建方法，涉及小鼠模型建立领域。主动脉夹层小鼠模型包括以下构建步骤：采用Bestrophi n3血管平滑肌特异性基因敲除小鼠，简称Best3

说明书

技术领域

本发明涉及小鼠模型建立领域，尤其涉及Bestrophin3血管平滑肌特异性基因敲除小鼠和主动脉夹层小鼠模型的构建方法。

背景技术

主动脉夹层(Aortic Dissection,AD)是一种常见的血管急性疾病，伴随着高血压等心血管疾病的年轻化，发病率也逐年提高。主动脉夹层病情发展十分险恶，一旦发病，如果不能及时治疗，便会发生血管破裂，进而造成心脏压塞、气管急性出血，引起休克死亡。主动脉夹层患者血管一旦发生破裂，只能通过手术进行人工血管置换，置换面临着巨大的手术风险，并且术后血管会进一步退行性病变，面临二次手术和破裂的风险以防主动脉破裂。目前，没有任何药物可以通过修复主动脉结构达到治疗和修复主动脉夹层，轻微主动脉夹层和危重主动脉夹层术后，只能通过维持血压、血脂等控制主动脉夹层的发生发展，因此，主动脉夹层发病机制的研究以及防治靶点的寻找变得尤为重要。

动物模型是研究主动脉夹层发病机制和药物研究的关键工具，目前常用的主动脉夹层小鼠模型的构建方式主要有如下3种：(1)载脂蛋白E(ApolipoproteinE, ApoE)敲除小鼠加血管紧张素II诱导高血压28天，成模率约40-60％；(2)低密度脂蛋白受体(Low-Density Lipoprotein Receptor，LDLR)敲除小鼠加血管紧张素II诱导高血压28天，成模率约40-50％；(3)予3周龄野生型C57LB 小鼠β-氨基丙腈饮水4周，随后予血管紧张素II诱导高血压3天，主动脉夹层形成率达90％。以上3种方法虽被广泛使用，但都存在一定的缺点，第(1) 和第(2)种敲除小鼠成模率低，且发病多在腹主动脉，病理表现更像腹主动脉瘤，与主动脉夹层的病理表征存在差异；第(3)种方法成模率高，但对造模小鼠周龄要求有严格的限制，必须使用3周龄的小鼠，这与临床主动脉夹层的发病人群不一致，而且造模期间死亡率高，实验损耗大。

因此，急需开发造模方法简单、与人体发病进程和表征一致、成模率高的全新的小鼠主动脉夹层模型。

发明内容

本发明提供了Bestrophin3血管平滑肌特异性基因敲除小鼠和主动脉夹层小鼠模型的构建方法，以提供一种造模方法简单、与人体发病进程一致、发病率高的全新的小鼠主动脉夹层模型。

为了解决上述技术问题，本发明目的之一提供了Bestrophin3血管平滑肌特异性基因敲除小鼠模型的打靶载体，所述打靶基因包括在Bestrophin3基因和两个Loxp位点，两个Loxp位点包括插入Bestrophin3基因的intron2里的 loxP和插入Bestrophin3基因的intron4里的FRT-Neo表达框-FRT-loxP。

作为优选方案，所述打靶载体的序列如SEQ ID NO.1所示。

为了解决上述技术问题，本发明目的之二提供了一种Bestrophin3血管平滑肌特异性基因敲除小鼠的构建方法，包括以下步骤：

(1)采用Cre/LoxP重组系统，选择Bestrophin3基因的exon 3和exon4 作为敲除区域，删除该区域应导致小鼠Bestrophin 3基因功能丧失，使用 C57BL/6小鼠基因组作为模板扩增上游同源臂、下游同源臂和flox区域，在 Bestrophin3基因intron2里插入LoxP,在intron4里插入FRT-Neo表达框 -FRT-LoxP，连接到骨架上，构成打靶载体；

(2)将上述打靶载体线性化后转染到C57BL/6小鼠的胚胎干细胞，通过PCR 鉴定筛选出成功同源重组的胚胎干细胞，随后将阳性表达的胚胎干细胞显微注射入囊胚，移植到假孕小鼠体内；

(3)通过传代获得F1代杂交小鼠，利用PCR鉴定获得的Bestrophin3-flox 杂合子小鼠；

(4)将Bestrophin3-flox杂合子小鼠自交繁殖并PCR筛选获得 Bestrophin3-flox纯合小鼠，随后与血管平滑肌cre工具鼠进行杂交繁殖，获得F1代杂交小鼠，于3周时离乳并利用鼠尾法鉴定其基因型，将Bestrophin3 嵌合flox杂合且Tagln-Cre阳性小鼠再次同Bestrophin3-flox纯合小鼠杂交，经PCR鉴定筛选得到Bestrophin3-flox纯合且Tagln-Cre阳性的Best3

作为优选方案，所述打靶载体的序列如SEQ ID NO.1所示。

作为优选方案，所述Best3

作为优选方案，Bestrophin3血管平滑肌特异性敲除小鼠的鉴定引物包括：

Tagln-Cre-F：5’GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC 3’；

Tagln-Cre-R：5’GTGAAACAGCATTGCTGTCACTT 3’；

Best3_LoxP_F：5’GTGGCTGAGGCAGGAGAATTACA 3’；

Best3_LoxP_R：5’AACCTGTGGGAAAACCTCTATCTCC 3’；

Best3_Neo_Del_F：5’CAGAAGTAGCCGAAAGCCAAGATGCC 3’；

Best3_Neo_Del_R：5’TTACCTGGACGAAAACCGACAGCA 3’。

为了解决上述技术问题，本发明目的之三提供了Bestrophin3血管平滑肌特异性基因敲除小鼠在筛查治疗或预防主动脉夹层或主动脉瘤的药物中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明目的之四提供了主动脉夹层小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：采用Bestrophin 3基因功能丧失的Best3

作为优选方案，所述Best3

作为优选方案，在Best3

作为优选方案，血管紧张素Ⅱ诱导浓度为1-2mg·kg

相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：

本申请目明确了血管平滑肌细胞内Bestrophin3缺失可以诱发主动脉夹层，构建获得的Bestrophin3平滑肌特异性敲除鼠是一种发病率高且与人类主动脉夹层发病年龄相似、优质的主动脉夹层/动脉瘤小鼠模型，其自身基础可以自发形成AD；若同时采用血管紧张素Ⅱ进行同步诱导，可以加速主动脉夹层或动脉瘤的形成，Best3

附图说明

图1：为本发明实施例一中Bestrophin3血管平滑肌特异性敲除小鼠的构建方法；

图2：为本发明实施例一中Bestrophin3血管平滑肌特异性敲除小鼠LoxP 插入位点示意图；

图3：为本发明实施例二中Bestrophin3血管平滑肌特异性敲除小鼠 (Best3

图4：为本发明实施例二中Best3

图5：为本发明实施例二中Best3

图6：为本发明实施例二中Best3

图7：为本发明实施例二中Best3

图8：为本发明实施例三中血管紧张素II诱导Best3

图9：为本发明实施例三中血管紧张素II诱导高血压4周内Best3

图10：为本发明实施例三中血管紧张素II诱导高血压4周后活体超声检测Best3

图11：为本发明实施例三中血管紧张素II诱导4周后Best3

图12：为本发明实施例三中血管紧张素II诱导4周后Best3

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Bestrophin是一类分子量约为68kD的蛋白质。目前为止，Bestrophin家族目前为止已发现4种亚型Bestrophin1，Bestrophin2，Bestrophin3和 Bestrophin4。这4种亚型的分布具有组织特异性，其中Bestrophin1主要分布于视网膜色素上皮细胞的基底膜，也可见于肺上皮和肠道；Bestrophin2分布较局限主要位于嗅上皮和眼部；Bestrophin4在人体主要组织中非常罕见，在许多器官中都难以检测到，而Bestrophin3在组织中分布较为广泛，很多组织中都可以检测到其表达。

Bestrophin3作为Bestrophin家族的一个重要亚型，目前已知有12个转录本，其中可以编码蛋白质的有10个，因此，Bestrophin3存在多个剪接体，其在不同的组织中剪接体存在的形式会有所不同。近年来，对Bestrophin3的研究多集中在结构和功能学上。Wang X等研究表明，维生素C能有效地抑制氢化可的松诱导的微血管内皮细胞的损伤，且可能是因为促进了Bestrophin3的表达有关；在小鼠新生脑损伤后，Bestrophin3蛋白表达上调，并与Nestin(巢蛋白)共同表达。Bestrophin3的mRNA剪接变异体在不同受损组织中不同，表明其在受损组织中作用不同；Bestrophin3可以作用于NF-κB，通过抑制其激活减小内皮细胞中因TNFα诱导的炎症；同时，Bestrophin3可以抑制CHOP的表达，进而降低肾脏上皮细胞由于内质网应激而引起的细胞死亡；还有研究者通过蛋白质组学的分析方法发现Bestrophin3还可以作为乳腺癌筛查的生物标记物，Wu等人发现小鼠Bestrophin3的C-末端的剪切体可以影响溶酶体-核内体复合体，同时促进溶酶体肿胀，内质网内钙离子释放等。表明Bestrophin3 在成肌细胞中发挥着调节钙离子释放功能；另外，Golubinskaya等人发现Bestrophin3在足细胞和肾皮质中的分子量高于心脏。不同组织中预测和观察到的蛋白质重量之间的差异可能是由于Bestrophin3的翻译后修饰所致，但需要进一步研究以阐明其潜在机制。虽然，Bestrophin3参与了肿瘤、细胞增殖、炎症等多种生理过程，但是其在心血管系统尤其是血管平滑肌细胞内发挥的病理生理学意义仍不明确。

本申请明确了血管平滑肌细胞内Bestrophin3缺失可以诱发主动脉夹层，Bestrophin3平滑肌特异性敲除鼠是一种发病率高且与人类主动脉夹层发病年龄相似优质主动脉夹层/动脉瘤小鼠模型。

实施例一

Bestrophin3-fLoxP小鼠模型的构建方法，具体包括以下步骤：

(1)材料：Bestrophin3-flox小鼠(C57BL/6小鼠)的构建委托赛业生物科技有限公司；实验所用B6.Cg-Tg(Tagln-cre)1Her/J小鼠来源于The Jackson Laboratory；C57BL/6小鼠来源于赛业生物科技有限公司；PCR鉴定试剂盒购买于美国sigma公司；。

(2)质粒载体的构建：

如图1所示，采用Cre/LoxP重组系统进行构建条件性敲除小鼠，首先构建Bestrophin 3条件敲除载体，Bestrophin 3基因有10个外显子，ATG在exon 2 上，TAA在exon10上，选择Bestrophin3基因的exon 3和exon4作为敲除区域，删除该区域应导致小鼠Bestrophin 3基因功能丧失。使用C57BL/6小鼠基因组作为模板扩增上游同源臂、下游同源臂和flox区域，在Bestrophin3基因intron2里插入loxP,在intron4里插入FRT-Neo表达框-FRT-loxP，连接到骨架上，LoxP插入位点示意图如图2所示，构成打靶载体(带有Neo标记基因)，打靶载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

(2)将上述打靶载体线性化后转染到C57BL/6小鼠的胚胎干细胞，通过PCR 鉴定筛选出成功同源重组的胚胎干细胞，PCR所用引物序列如表1所示，随后将阳性胚胎干细胞显微注射入囊胚，移植到假孕小鼠体内。

(3)通过传代，获得F1代小鼠，利用PCR鉴定获得的Bestrophin3-flox 杂合子小鼠，PCR所用引物序列如表1所示。

(4)Bestrophin3血管平滑肌特异性敲除小鼠的繁殖与筛选：

将上述Bestrophin3-flox杂合小鼠自交繁殖并PCR筛选获得 Bestrophin3-flox纯合小鼠，随后与血管平滑肌cre工具鼠进行杂交繁殖，即 B6.Cg-Tg(Tagln-cre)1Her/J小鼠，简称Tagln-Cre小鼠。获得的F1代杂交小鼠于3周时离乳并利用鼠尾法鉴定其基因型，将Bestrophin3嵌合flox杂合且 Tagln-Cre阳性小鼠再次同Bestrophin3-flox纯合小鼠杂交。

(5)进行PCR鉴定生产所得小鼠，PCR所用引物序列如表1所示，筛选可得对照组(Bestrophin3-flox纯合且Tagln-Cre阴性，即Best3

表1-实施例一中PCR鉴定所用引物序列

实施例二

验证Best3

试验步骤：记录自然生长状态下Best3

试验结果：如图3所示，在饲养小鼠的过程中，随着年龄的增长Best3

实施例三

血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导Best3

血压升高是主动脉夹层发生发展的一个重要诱因，为模拟临床主动脉夹层发病时高血压的病理条件，对4周龄的小鼠背部皮下埋置AngⅡ缓释泵，诱导高血压4周，诱导流程示意图如图8所示，包括以下步骤：

(1)待Best3

(2)小鼠超声检测使用VEVO 3100超声设备(Visual Sonics加拿大多伦多)采集，先将待测小鼠置于麻醉箱内以2％异氟烷麻醉至昏迷，随后固定在载体板上以1％异氟烷持续麻醉，选择合适的体位分别采集升主动脉、主动脉弓、胸主动脉及腹主动脉图像，观察整条主动脉结构以及是否形成主动脉瘤，同时测量其最大内径，图像结果如图10所示。同时对样品进行解剖，结果如图11 所示。

试验结果：如图10所示，在诱导高血压后第28天，通过超声对小鼠主动脉进行扫描观察其管壁结构，可看到Best3

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学

<120> Bestrophin3血管平滑肌特异性基因敲除小鼠和主动脉夹层小鼠模型的构建方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15721

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 打靶载体

<400> 1

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300

cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360

agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420

cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600

taaaacgacg gccagtgaat tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg gtacgcggcc 660

gcaccctgga ctcactacac gctggatcgc cacagcagca ggagaactag gaggaaaccc 720

agctggtcac cagtgagggt ggaagccggc acctcttcag ggacggcaga tcgtttgaag 780

atttctcttc ccttgagaga ctccaaagaa ataggttagt gcgcgagccg gcttctgcac 840

ttgaacgtga ccttatgctt ggtgggcgtc gggtttcgga cagagcctga actgagggtg 900

aaggagtgaa tggaagaaaa ggggattggt tagaggctgt cccttgacgg ggcctgcctg 960

gagaagagct taggacattg ctgttctgtt ctcccctgtc gctgagttct cccgaggcag 1020

agagacaagg tggcgatctc aaagcgaagc ctgttttagg gcaggcaccc cacccttctg 1080

tggtgtcacc tactgactta ggcaaagggc cctggtttgt ttaattaaaa tcaacaacca 1140

tggaggacaa atcagcactt tgctgttgtt gctgtggata cagctgccag ctcttacgtc 1200

cttagagaaa ctggataaat cacagttgga tatttgcctg tctaaatgaa acattctctt 1260

atttgtgata gaatgtgtga tataaatcgc tctacggggg gaaaaaaata tgctctaggg 1320

tttgtttggt tgggtttttg tgtgggtgtg tgtattataa ttttgaccta aaatctatca 1380

gcctgtgttg ctctgtgaga agttctttgt agttcctttg gagaaaagtt aacattttaa 1440

agagatctcc ttttgtttgc atgtgaccta tactacccag ttagctgagt aaggtttcca 1500

aacaaaggtc ggctttgagc catctattcg aagtccgatg gcacatctca gtgagaagcc 1560

gaggcatgcc agggagctca aagaaaactg ggattaggcc ccattctcat cctgcccacg 1620

tccacgaaat gaatccagaa caaggtgttc taaattacag acacactagg gatgtagcac 1680

acatgagaca gtgcctgccc agcacacaca agactcggtg ccaagcaaaa cgctaagtaa 1740

atactacata cagtggcggt ggtacagtcc cacaattcca gcgctcactg gaaatggagc 1800

aaaagttcaa ggccaggttc aaggtcaatg tgggatgacc ctgtcttcca aaataagaaa 1860

gaaaagactc agtttgtttg tctctgatta tttcattgag actttccaag gggaaagtgt 1920

agccttttta atatcaagtt tacggctccc tttgaaaggt acagaattcc gactgtacac 1980

cctgagagct gctgagagac tcacatctca ggaagatacc cccacccccc gacacaccca 2040

agtagcccat ctgttaaact gctctggggg ccgggcttcc tcctgacaat cgctcctggt 2100

tcctaagaag ggatcaataa ctttttcctc ttaggaagtt taaaggtgaa atcaatattt 2160

ctttaaggat tttagcagac actggcccaa acaacgagta tagccactgc tttttaaaaa 2220

catcatcagt ttagcaaacc aatttcctaa atcctcctgc gactaagaag tggctagtat 2280

gcctcatgtg ctaatgttga ttatgtattg ggcaaaagct acagactcta aaataatgct 2340

tatcgaatgc agaaatgtca gggcttctaa aaacagtctt tctagggacc atcttcttct 2400

ccttctgtgt cagatttagt gccgagatgc tagatggtga tacggtatta tctacaagtt 2460

ctaaactatg agaggagtgc gtgatgcatg gagggtgggt cagctgatta gtttttggct 2520

ttagtttcct ttggttaaga aagaaaggga aagtgtatgc ctgtgttgac atccaacttt 2580

gcttttcact cgtgttttgt cttcttgctc ttctagaaca aaaccaccca cgatgactgt 2640

cacttactcc agtaaagtag caaatgcaac attttttgga tttcataggt tgcttctcaa 2700

gtggagaggt agtatctaca agctgctgta cagggaattt attgtttttg ctgttcttta 2760

cacagcaatc agtctggtgt acaggtacct tcgttttgca tgtctcctta aatggccccc 2820

ccaggcatta tgtaagaata cagtctcaaa aactggatcc ccttggttgc cgctagcctc 2880

tgcattatgt aacaatctcc ccacccctcc ccaccccccg catgaacctc tctggcgtcc 2940

tctcttcagg atagggtatt ttaatccaca cctaaccacg tatttggagc aattgacagc 3000

caccgttcag acaatgggct ctaattccag ccccacagag atggatcccg atgaggtatc 3060

agcctagctg ctttaagtgt caactgaaag ttttatgctg acatcctcat cggtgtgccg 3120

attaacggcc aaagcccaca gacaaatgct tttgtgtttc tctcagtgat gtcatgtgga 3180

gtttgaacat gtgatctgac agcttactgc aactctacgt ggagttaaca tatgggtgaa 3240

tagaatttac cagacagctt tccttcctgt agtctggatg gtaagctctg acctgggatg 3300

atgtcctcca acctcaccaa agaactaagg cctgaggaat aatttgttct ctttatgtct 3360

tctgatttca ggatgtcaca tttgcaagag aaggtatcta ttctttataa cacgggtacc 3420

tgtcaggttc atactttgag ggctagcata tccacctctc ccaactgaaa agtattgtct 3480

tagtaacatt tcatcactgt gattaaaaaa aaatgaagct ttaggagtta ataaactaaa 3540

actgaattac attggaggaa gctaaaagga aagcctaaga ttttcaaggc tgtatttcca 3600

ccttagctag gtataaaatt ttttcttcca tcgaaggtga actaactgtg agtcacagtc 3660

tcacctacat ccttctttga aactatgaga ctccacttgg agaggagagg tattcattta 3720

gttggctgat catttccaaa agcaaactgt gaacaactat cttgttcaca acaacccatc 3780

agtacttcca gcccaaagat gaggatgtag ctcagttggt acaatgcctg cctagcaagc 3840

acaaaaccct gaactcaatc cccaggcact gatagcacac acctgtaatc ccagtattga 3900

ggcaatggag acaggaggat cctgttcaag ataacttgct gcttgagtta taagaaactc 3960

tgtcaaaaaa aaaaaagaca gaacactatc attccatacc agtatacata ttagaacaga 4020

ttttgtggga ctaaggaatt agctcagtgg tagaatgctt tgcctagcaa ctggcaggct 4080

ctgggttcag tccccagttc aaaaataatc agaacaaaaa acaccaaggc aaaaatcgca 4140

agaatagatt tttgtcaaat attcttagag acgtctgata tctttcagat atctcctata 4200

ttaccttaac agttcactta tctgttcctt gaaccttcag agtatgacat ggtggcagat 4260

tagtggtgtt ccagtatcac tatctcatca gttcattctt cactaatgtg agtttactgc 4320

tgctactgct gtttagaaga gagaagcccc aagagcaact gctatatccc tggaaatgct 4380

ccaatatcaa acttacaccc caaaactcta cacagatttt tgtctttcca aagatcaaag 4440

agtacaaaca ttcgcagcaa tcactttaac ttgctttttt cttctttttt aaaaaagtct 4500

cattgtaaat tcttataaaa gcagatcctt tttatcttaa atatttacca agaactgttg 4560

gattcatagg tctccaaaat caagcagacc tgaaaatata accatagttt gtgctttgcc 4620

tggtattgac tttgagttta actcttccag tttggaggaa tttgacataa tactctctgt 4680

ggtattttct agataagaat atccacatat atctgtccaa ttagcatcaa taccacccat 4740

tttggtgcta cgtttgaaga tatacagttg ccttacagtt atttatgtaa ttgatatttc 4800

tggtctttac aacaccataa actaaaaaga accctgagac tcctagagct ttgacaatat 4860

ccccaagtct aaatctatga caaacctgtt ctataccttg gcctggccca gctgatccca 4920

ggagctgtgc tttctacact gaatacttta atgtgcataa ttaaatactt tatgtatcag 4980

aaagccgctc tgtgacttgt tatcaacagg accctccctg attccacgaa cttgatcgcc 5040

tcacccaaag ctgacacaag aactccccac aacccctata cctcaaattc tttattcacc 5100

aagaccagcc tgacagtcct ctgcctgcag cccccgtggc tggacactgc tcctcttcta 5160

tcagcattcc actcacgggc gggaactttt gagacttgtt ccgataggtt ttttcttaga 5220

tttcttgttc tttagatgaa ctgaactatt aatctatgca aattcatatg tagcctctct 5280

ttccacatcc tggtaattat tattaatgtg tctttagatt ccttctggct ctgaattccc 5340

tccctgaaac ataataacgg tctcattatg ggcaggtgtg tttagcaatc tcagaaaata 5400

agtttgggga ggtaaagtca gatctacagg aaaggttttg atatttgagc ccatggccaa 5460

atataacagt gaaagtttct gcctttcagg ttaaatcagc tttatttata tcccaagcat 5520

tgcgaatatt aaagtaaaca atcacaatat ttcctgacag gtagtatatg cacaatctag 5580

aatgcattaa ttggcttggt taaattagta cgttctggat taaaggtcaa gatgttgaat 5640

gttactcaat aatgacttaa taactcttac ccaccaaatc aatagtctct ttcttttaag 5700

tattcctaat gaataattga aaaatggaaa ccaagcctgg tggtgaaggc ctataacctc 5760

agctaattga gtggctgagg caggagaatt acaaggacag gtaggtcgtc gcacgtataa 5820

cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat tactgcgtac gagcatcgat ttcagggtct 5880

gcttggtcaa cagcagcagt tctcaacctt cctgatgctg tagtccttta atacagtccc 5940

tcatgttgtg gtgaccccca ccccccaccc cgaaccataa cactattctg ctttctactt 6000

cacaactgta atcttgctac tgttatgaat tgtaatttaa atatttttgg agatagaggt 6060

tttcccacag gttgagaacc actagtctat aacatgagct caagccaatg gggcgacccc 6120

tgtctcaaaa cagaaaagag tgacctgccg gtggtattca gtgattgtct gtctgacacg 6180

ccccggccct ggctttaatt ctcagaaaga aaaacaaaag actcttttgt aacatgtctt 6240

tctccaaaat ccaatgaacc agttatataa aactttaaaa ctacaaagct ttaagaaacg 6300

aagtggttaa caattccatt acttaatggt tatcagattt atgtgctaaa aacctttaat 6360

accggaagca caaagcattt ttttttttta aattttagag gcacaccagt tcaagggaaa 6420

acaaaaaaca aaaacaaaac aaaaaacaac aacaacaaca acaacaaaaa accaagccaa 6480

ctgagattaa gatttgtggt taactgtttg cacttgctgt ctcctgcaga gcaggggcag 6540

gagttccgcg tcataaaggg ctgtgcgttt tatttttgct ccagattgtt acttacagga 6600

gcccaaaaac gttactttga aaaattatca atttactgtg acagatatgc tgaacaaatt 6660

ccagtaacct ttgtgcttgg taagtatagg tcacacgcag aatgcagcca cacagctgtc 6720

tccgttagat gacacagatg accgcatgag agtgcttccg ggctgtgagg cttgccggga 6780

aagccgctgc ttgcaatcgt gcacagccga ccctaaagtt cgccttcagg gctgcttctg 6840

ctaagttagc atgggacagt ttgaggtcgt aatctgctgt tggaccttta agctttctct 6900

tcactaaccg tccatttttg cagtcagtat ttgagttcta atacccactt accgggtgcc 6960

ctgaccttgt caggcatata tggcatttcc tcccctccag gagggcagaa atcctaaggt 7020

ctggaggata acatattttc atagctcgaa cccctaagaa agctaaaatt ctgctacacg 7080

tgtgtccgct gagatgtctg ctgtaagaaa ctgcatgatg gcgtctggtt atcccaacag 7140

ggttttacgt cactctggta gtgaaccgat ggtggaacca gtttgtgaat ctgccttggc 7200

cagacaggct gatgctcctc atttccagca gtgtccacgg gagcgaccag catgggcgcc 7260

tgctcagaag gacgctgatg cgctacgtca acctgacgtc cctgctcatc ttccgctcgg 7320

tgagcaccgc ggtgtacaag aggtttccca ccatggacca cgtggtcgaa gcaggtacgg 7380

ggtgtgcgct tggtaggagc caccaaaatg cttttgaaag cacccgggtg tatttattca 7440

agaaatgtgg cagaagcatt cttaaagggc aaagataagt aggtaagata ggactcctgc 7500

cctcaagaag tttccttggc aggtagaaga cagaagtagc cgaaagccaa gatgccttaa 7560

gataaataat acagtgatgg tgatcggtca ttaaaagcaa tttattttgt ttattttgtt 7620

ctgtttttca cttgtttttt gctttgttgg tggtgtttgt ttgtttgttt gttttacttg 7680

gtttggcttt ggctttggat atcgaattcc gaagttccta ttctctagaa agtataggaa 7740

cttcaggtct gaagaggagt ttacgtccag ccaagctagc ttggctgcag gtcgtcgaaa 7800

ttctaccggg taggggaggc gcttttccca aggcagtctg gagcatgcgc tttagcagcc 7860

ccgctgggca cttggcgcta cacaagtggc ctctggcctc gcacacattc cacatccacc 7920

ggtaggcgcc aaccggctcc gttctttggt ggccccttcg cgccaccttc tactcctccc 7980

ctagtcagga agttcccccc cgccccgcag ctcgcgtcgt gcaggacgtg acaaatggaa 8040

gtagcacgtc tcactagtct cgtgcagatg gacagcaccg ctgagcaatg gaagcgggta 8100

ggcctttggg gcagcggcca atagcagctt tgctccttcg ctttctgggc tcagaggctg 8160

ggaaggggtg ggtccggggg cgggctcagg ggcgggctca ggggcggggc gggcgcccga 8220

aggtcctccg gaggcccggc attctgcacg cttcaaaagc gcacgtctgc cgcgctgttc 8280

tcctcttcct catctccggg cctttcgacc tgcagcctgt tgacaattaa tcatcggcat 8340

agtatatcgg catagtataa tacgacaagg tgaggaacta aaccatggga tcggccattg 8400

aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 8460

actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 8520

ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg 8580

aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 8640

ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 8700

tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 8760

tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 8820

gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 8880

aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgatg 8940

atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 9000

tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 9060

tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 9120

tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 9180

tcttctgagg ggatcaattc tctagagctc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt 9240

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ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 9420

ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc ggaaagaacc agctggggct 9480

cgactagagc ttgcggaacc cttcgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttcat 9540

cagtcaggta cataatataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat taggtggatc 9600

cactaggcgc gccgatatcc tttggctttg gttttggttt gtgagacagg ttatcactgt 9660

gtagcccagg ctggccttga actcactgca atcctcctgc cttagcctcc ctggtggtgg 9720

gattacagat gtgagccacc gagcctagtt tatagctatt ccagttaggt ctcaggatgt 9780

cctgaaaaca gtagaaggtg gattttagag attgcaagcc gtcctgagtc acatagctgc 9840

agagcggaag gaagagaatt aatattcagg ctcagaaacg ctataataaa atgtgtcttg 9900

aagcaaagtt gaaggctggt ttgctgtcgg ttttcgtcca ggtaaattgg gtgaaaccct 9960

cctccccgga tgtggtagtg aaaggctctc tcagggtgga cctgttgtct ctcttgtgtt 10020

tcatgagacg gtagatgtag ctattctatg taggttcctg ggtcgttcct gggcctagca 10080

tgctgaaaac gagtcacgtg tgaggtatgg tgctctctgg tatgtaaatg tttagtgaag 10140

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tgctcgattc tgccttcatt taggctgcaa agtaagaaaa cgaaagtgta ctctccagtg 10260

tccattttcc tccaagaaga aaactggagg gttttgtttg tttgggtttg tttttgtttt 10320

tactttgatg tctttctcct tgttttgagg tttttttatt ttatgttttt attatttttt 10380

tatttgatgg gtagcacaga taatatctaa gagcacatag cacaagggtt ggaattctga 10440

ctccaccgct cactagtcac atgacagtgc ttaggtactt agccttcctg tgcctctatc 10500

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agccgattca aggcagatta gagtatatta cggcaggttt gttgggaagt tgctctaagg 10860

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gagaaagaga gaaagggtgt gtacagggag agaagacaga gagagagaga aggggggaga 10980

gagagggggc gtggaaaatg cctggattat atcatgaaga acctctaaag gaagggcagc 11040

ccagccccta ggctggaaag ttcagaactg ggggcagggt ttgtcaggta gggactgagg 11100

gatgctggga gaatctggag gccagatctg atttgatatg taaactatgc acctcagttc 11160

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ggatccaggc agaaggttga gtagcctggc aaacacacag gggtattgtg tgaaatgcca 11280

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aataactagc ctgaaccgct cctgggcagc ttcagtttct taccctacca ctgactgacc 11400

tcttgtgcat ctaaagtgca ttgccctggg ccccactttg aacttactga ccataaccaa 11460

cttgaacctt tagatgtcat gcttagaccc ctcagttaga cacgctgcca tgtctctccc 11520

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caaaaaagga agagggagag gataagagcc atcaccacta acaaataccc acaaagaaga 11760

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accaaccata aaagggcccc attgatcctg ggacaatggc agatagtggg ggctcctagg 12060

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tgatgaatgg gagcagtggt ggaatgcaga tcctagagct cgctgatcag cctcgactgt 13260

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aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag 13380

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gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac 13620

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tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 13860

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c 15721

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ttacctggac gaaaaccgac agca 24