一种青少年特发性脊柱侧凸的斑马鱼模型制备方法

摘要

本发明公开了一种青少年特发性脊柱侧凸的斑马鱼模型制备方法，包括以下步骤：S1RNP的合成；S2将RNP注射入出生1h内的野生型斑马鱼胚胎获得F0胚胎；S3PCR检测靶位点突变情况；S4筛选基因敲除稳定的斑马鱼遗传系；S5选取卷尾畸形幼鱼饲养至成年，并定期观察表型；S6成年侧凸斑马鱼中，提取DNA检测确认基因编辑成功；S7根据DNA测序结果和斑马鱼侧凸表型确认模型建立成功，属于动物模型技术领域，从临床遗传学筛查的阳性结果出发，使得该模型具有该疾病的代表性；采用基因编辑的方法，将突变编辑进斑马鱼基因组，Cas9基因编辑技术进行实验，确保基因编辑效率，构建的侧凸模型阳性率高。

说明书

技术领域

本发明属于动物模型技术领域，具体是一种青少年特发性脊柱侧凸的斑马鱼模型制备方法。

背景技术

AIS一种好发于青春期女性的以脊柱3D结构弯曲为特征的发育畸形疾病，也是世界范围内最为常见的骨骼系统畸形疾病之一，其人群中的发病率约为1-5％，其中约10％的患者症状持续加重，需要接受临床干预，针对重症IS患者目前仅有手术矫形治疗这一方法，但手术创伤较大，费用较高，并存在一系列并发症，对患者身心发育，家庭及社会均造成了巨大负担。因此，详细了解AIS的发生发展机制已经成为全社会迫切需要解决的基础医学问题之一。目前，AIS的具体病因仍不明确，严重制约了新的分子治疗手段的研发。

目前AIS的机制研究进展缓慢，其中一个主要原因是缺乏可靠的动物模型。大部分遗传学发现在动物模型中无法得到验证，使得目前发病机制的研究进展缓慢。在已报道的AIS候选基因中，仅有约15％的候选基因在动物模型(鼠、斑马鱼)中能够验证出表型。

在斑马鱼研究中，已经发现数个基因敲除可以导致斑马鱼出现侧凸表型，但这些致病基因均未在AIS患者中得到验证(即这些基因与疾病的关联性仍有待考究)，这使得这些基因敲除的侧凸斑马鱼与人类疾病的关联性大打折扣，无法用于后续机制研究。

既往曾有应用老鼠建立脊柱侧凸动物模型的研究，但转基因小鼠构建周期长，成本较高，饲养所需人力和物力均较大，而后续研究不仅要探究发病机制，还需对相应的分子靶向治疗手段进行实验研究，其中可能涉及多个基因的编辑或敲除。因此，迫切需要一种低成本和繁殖周期短的动物模型用于后续大量的实验研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种青少年特发性脊柱侧凸的斑马鱼模型制备方法。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种青少年特发性脊柱侧凸的斑马鱼模型制备方法，包括以下步骤：

S1RNP的合成；

S2将RNP注射入出生1h内的野生型斑马鱼胚胎获得F

S3PCR检测靶位点突变情况；

S4筛选基因敲除稳定的斑马鱼遗传系；

S5选取卷尾畸形幼鱼饲养至成年，并定期观察表型；

S6成年侧凸斑马鱼中，提取DNA检测确认基因编辑成功；

S7根据DNA测序结果和斑马鱼侧凸表型确认模型建立成功。

优选的，所述步骤S1中，RNP的合成，包括：

S11引物设计及准备：从NCBI数据库获取斑马鱼dnah10基因序列；针对dnah10基因上拟构建突变位置设计guideRNA，设计的靶位点及Oligo序列为：

靶位点：GGATGGCGCCAAGCTCATTT；

Oligo:TAATACGACTCACTATAGGATGGCGCCAAGCTCATTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；

S12sgRNA的合成：

S121解冻必要的试剂盒成分，混合并在微量离心机中快速离心，将溶液收集到试管底部；

S122按照以下顺序在室温下组装反应：2XNTPmix、15μl，步骤S11中的oligo、3μl，T7polymerasemix、2μl，RNAseH20、10μl，总计30μl；

S123充分混合并在微量离心机中点离混合；

S124在37℃下孵育4-16小时得到sgRNA；

S13DNase处理以去除DNA模板：

使用HiScribeT7快速RNA合成试剂盒进行的RNA合成反应以生成足够多RNA，稀释反应后进行DNase处理；

S14sgRNA的沉淀/纯化；

使用P30微型离心柱或ZymoRNACleanandConcentrator试剂盒进行sgRNA的沉淀/纯化，得到RNA后NanodropRNA测浓度，并储存在-80℃的条件下。

优选的，所述DNase处理，包括：

a除去模板DNA：向每个30μl反应中添加20μl无核酸酶的水，然后加入2μlDNaseI，混合并在37℃孵育15分钟；

b将2ulRNA样品与3ulRNA染料混合，并在65℃孵育3-5分钟；

c在2.5％的琼脂糖凝胶上电泳检测产物。

优选的，所述步骤S2中，将RNP注射入出生1h内的野生型斑马鱼胚胎获得F

S21将Cas9蛋白质稀释至20mMTris-HCl，600mMKCl，20％甘油的混合溶液中，终浓度为10μMCas9溶液，并储存在-20℃的环境中；

S22将Cas9溶液与sgRNA1：1混合，得到5μMCas9、1μg/μLsgRNA的混合溶液；

S23往RNP中加入0.05％酚红染料；

S24将Cas9溶液与sgRNA的混合物在37℃下孵育5分钟，随后将RNP置于冰上；

S25通过显微注射仪将0.5-1nL的混合物注入单细胞阶段胚胎的卵黄或细胞质中；

其中，每次注射使用的注射混合物是1ulCas9、200-400ngsgRNA，总共3ul；EnGenCas9为20uM，并将1000ngsgRNA与Cas9一起使用，终浓度为5uM。

优选的，所述步骤S3中，PCR检测靶位点突变情况，包括：

将注射完的斑马鱼胚胎饲养一周，观察是否有卷尾畸形，使用TRIzol试剂提取分离总RNA进行鉴定；

其中，使用TRIzol试剂提取分离总RNA进行鉴定，包括：

S31单个基因收集50个斑马鱼胚胎提取RNA，并立即用1mlTRIzol处理，后续使用QiagenRNEasyMiniKit提纯RNA；

S32使用iScriptcDNA合成试剂盒合成cDNA；

S33使用SYBRGreenSupermix在BioRADCFX96实时PCR检测系统上进行实时PCR检测。

优选的，所述步骤S4中，筛选基因敲除稳定的斑马鱼遗传系，包括：

S41筛选F0代有侧凸表型的斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，得到杂合F1代；

S42F1代杂合斑马鱼随机挑选雄性和雌性进行杂交，得到F2代；

S43筛选F3代中具有侧凸表型的斑马鱼，随后提取DNA鉴定基因型，确定为dnah10突变，确立基因型-表型关联。

优选的，所述步骤S5中，选取卷尾畸形幼鱼饲养至成年，并定期观察表型，包括：

体式显微镜下观察F3代斑马鱼幼鱼，筛选具有卷尾畸形的斑马鱼，单独放入培养缸内喂养，定期观察生长发育情况，记录侧弯表型出现的时间及发生率。

优选的，所述步骤S6中，成年侧凸斑马鱼中，提取DNA检测确认基因编辑成功，包括：

选取具有侧弯表型的F3代成年鱼，断尾提取DNA，PCR扩增突变位点dnah10附近DNA片段，应用上述步骤S3的方法检测靶点突变情况，测序明确突变存在与否。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明从临床遗传学筛查的阳性结果出发，使得该模型具有该疾病的代表性；

本发明采用基因编辑的方法，将突变编辑进斑马鱼基因组，在之前的方法中，通常是采用基因敲除方法构建动物模型，基因敲除后，需要进行正向遗传学筛查，反复交配和培育具有阳性表型的斑马鱼，费时费力；

本发明采用Cas9基因编辑技术进行实验，确保基因编辑效率，之前的模型构建方法中，大多采用morpholino注射方法进行，效率低，容易发生脱靶效应；

本发明构建的侧凸模型阳性率高，超过90％斑马鱼能够表现出侧凸表型。

附图说明

图1是本发明中dnah10突变所致基因结构变化示意图；

图2是本发明中模型测序图；

图3是本发明中F0代斑马鱼幼鱼示意图；

图4是本发明中稳定遗传F2代脊柱侧凸斑马鱼模型。

具体实施方式

以下结合附图1-4，进一步说明本发明一种青少年特发性脊柱侧凸的斑马鱼模型制备方法的具体实施方式。本发明一种青少年特发性脊柱侧凸的斑马鱼模型制备方法不限于以下实施例的描述。

实施例1：

本实施例给出一种青少年特发性脊柱侧凸的斑马鱼模型制备方法的具体实施方式，包括以下步骤：

S1RNP的合成；

S2将RNP注射入出生1h内的野生型斑马鱼胚胎获得F

S3PCR检测靶位点突变情况；

S4筛选基因敲除稳定的斑马鱼遗传系；

S5选取卷尾畸形幼鱼饲养至成年，并定期观察表型；

S6成年侧凸斑马鱼中，提取DNA检测确认基因编辑成功；

S7根据DNA测序结果和斑马鱼侧凸表型确认模型建立成功。

进一步的，步骤S1中，RNP的合成，包括：

S11引物设计及准备：从NCBI数据库获取斑马鱼dnah10基因序列；针对dnah10基因上拟构建突变位置设计guideRNA，设计的靶位点及Oligo序列为：

靶位点：GGATGGCGCCAAGCTCATTT；

Oligo:TAATACGACTCACTATAGGATGGCGCCAAGCTCATTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；

S12sgRNA的合成：

S121解冻必要的试剂盒成分，混合并在微量离心机中快速离心，将溶液收集到试管底部；

S122按照以下顺序在室温下组装反应：2XNTPmix、15μl，步骤S11中的oligo、3μl，T7polymerasemix、2μl，RNAseH20、10μl，总计30μl；

S123充分混合并在微量离心机中点离混合；

S124在37℃下孵育4-16小时得到sgRNA；

S13DNase处理以去除DNA模板：

使用HiScribeT7快速RNA合成试剂盒进行的RNA合成反应以生成足够多RNA，稀释反应后进行DNase处理；

S14sgRNA的沉淀/纯化；

使用P30微型离心柱或ZymoRNACleanandConcentrator试剂盒进行sgRNA的沉淀/纯化，得到RNA后NanodropRNA测浓度，并储存在-80℃的条件下。

进一步的，DNase处理，包括：

a除去模板DNA：向每个30μl反应中添加20μl无核酸酶的水，然后加入2μlDNaseI，混合并在37℃孵育15分钟；

b将2ulRNA样品与3ulRNA染料混合，并在65℃孵育3-5分钟；

c在2.5％的琼脂糖凝胶上电泳检测产物。

进一步的，步骤S2中，将RNP注射入出生1h内的野生型斑马鱼胚胎获得F

S21将Cas9蛋白质稀释至20mMTris-HCl，600mMKCl，20％甘油的混合溶液中，终浓度为10μMCas9溶液，并储存在-20℃的环境中；

S22将Cas9溶液与sgRNA1：1混合，得到5μMCas9、1μg/μLsgRNA的混合溶液；

S23往RNP中加入0.05％酚红染料；

S24将Cas9溶液与sgRNA的混合物在37℃下孵育5分钟，随后将RNP置于冰上；

S25通过显微注射仪将0.5-1nL的混合物注入单细胞阶段胚胎的卵黄或细胞质中；

其中，每次注射使用的注射混合物是1ulCas9、200-400ngsgRNA，总共3ul；EnGenCas9为20uM，并将1000ngsgRNA与Cas9一起使用，终浓度为5uM。

进一步的，步骤S3中，PCR检测靶位点突变情况，包括：

将注射完的斑马鱼胚胎饲养一周，观察是否有卷尾畸形，使用TRIzol试剂提取分离总RNA进行鉴定；

其中，使用TRIzol试剂提取分离总RNA进行鉴定，包括：

S31单个基因收集50个斑马鱼胚胎提取RNA，并立即用1mlTRIzol处理，后续使用QiagenRNEasyMiniKit提纯RNA；

S32使用iScriptcDNA合成试剂盒合成cDNA；

S33使用SYBRGreenSupermix在BioRADCFX96实时PCR检测系统上进行实时PCR检测。

进一步的，步骤S4中，筛选基因敲除稳定的斑马鱼遗传系，包括：

S41筛选F0代有侧凸表型的斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，得到杂合F1代；

S42F1代杂合斑马鱼随机挑选雄性和雌性进行杂交，得到F2代；

S43筛选F3代中具有侧凸表型的斑马鱼，随后提取DNA鉴定基因型，确定为dnah10突变，确立基因型-表型关联。

进一步的，步骤S5中，选取卷尾畸形幼鱼饲养至成年，并定期观察表型，包括：

体式显微镜下观察F3代斑马鱼幼鱼，筛选具有卷尾畸形的斑马鱼，单独放入培养缸内喂养，定期观察生长发育情况，记录侧弯表型出现的时间及发生率。

进一步的，步骤S6中，成年侧凸斑马鱼中，提取DNA检测确认基因编辑成功，包括：

选取具有侧弯表型的F3代成年鱼，断尾提取DNA，PCR扩增突变位点dnah10附近DNA片段，应用上述步骤S3的方法检测靶点突变情况，测序明确突变存在与否。

实施例2：

本实施例给出一种青少年特发性脊柱侧凸的斑马鱼模型制备方法的具体实施方式，实验过程如下：

(1)实验动物：

按标准化方案养殖野生型斑马鱼(TU品系)，水温28.5℃，光照/黑暗周期为14h/10h，成体斑马鱼产卵后收集胚胎，养殖于E3孵化液。

(2)拟应用Cas9方法在斑马鱼dnah10基因上构建一截短突变(c.10304_10307del[p.N3435SfsX20])，通过设计相应的guideRNA，与Cas9蛋白合成RNP，行显微注射在斑马鱼胚胎中编辑dnah10基因该出位置，筛查突变构建成功与否及侧凸表型，培育稳定遗传的侧凸斑马鱼系，构建该专利所描述的AIS斑马鱼模型。

(2.1)引物设计及准备：

构建dnah10基因敲除斑马鱼可采用如下方式：从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/569992)获取斑马鱼dnah10基因序列(GeneID:569992)；针对dnah10基因上拟构建突变(c.10304_10307del)位置设计guideRNA，设计的靶位点及Oligo序列如下所示：

靶位点：GGATGGCGCCAAGCTCATTT；

Oligo:TAATACGACTCACTATAGGATGGCGCCAAGCTCATTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；

配置如下扩增反应体系：通用oligo(10μM)，1μl；基因特异性的Oligo，1μl；Hi-FiPolymeraseMix2X，12.5μl；RNAseH20，12.5μl.总计25μl。

反应条件：a.在98℃下变性2分钟；b.在50℃下退火10分钟；c.在72℃下延伸10分钟；d.2.5％琼脂糖凝胶检测，3-5ul样本电泳20min，可见120bp位置的条带。

(2.2)sgRNA合成：

戴上手套并使用无核酸酶的试管和试剂，以避免RNase污染。反应体系通常为30μl，但可以根据需要扩大规模。反应应在无核酸酶微量离心管或PCR试管中进行。

a.解冻必要的试剂盒成分，混合并在微量离心机中快速离心，以将溶液收集到试管底部。实验过程中保持所有试剂处于冰上。

b.按照以下顺序在室温下组装反应：2XNTPmix，15μl；上一步合成的oligos，3μl；T7polymerasemix，2μl；RNAseH20，10μl.总计30μl.

c.充分混合并在微量离心机中点离混合。

d.在37℃下孵育4小时以获得最大产量的RNA。可以持续孵育16小时(过夜)。建议在干燥空气培养箱或热循环仪中进行加热，以防止样品蒸发。

(2.3)DNase处理以去除DNA模板：

使用HiScribeT7快速RNA合成试剂盒进行的RNA合成反应以生成大量RNA，其浓度最高可达10mg/ml。稀释反应后进行DNase处理。

a.除去模板DNA，向每个30μl反应中添加20μl无核酸酶的水，然后加入2μlDNaseI(无RNase)，混合并在37℃孵育15分钟。

b.将2ulRNA样品与3ulRNA染料混合，并在65℃孵育3-5分钟。

c.在2.5％的琼脂糖凝胶上电泳检测产物。

RNA(sgRNA)的沉淀/纯化

(2.4)使用P30微型离心柱(BIORAD)或ZymoRNACleanandConcentrator试剂盒进行。得到RNA后NanodropRNA测浓度，并储存在-80℃。

(3)显微注射将RNP注射入出生1h内的野生型斑马鱼胚胎获得F0胚胎

将Cas9蛋白质稀释至20mMTris-HCl，600mMKCl，20％甘油的混合溶液中，终浓度为10μMCas9溶液，并储存在-20℃中。

将Cas9溶液与sgRNA1：1混合，得到5μMCas9、1μg/μL(31μM)sgRNA的混合溶液，以生成Cas9RNP复合物。

往RNP中加入～0.05％酚红染料以观察注射是否成功。

将Cas9蛋白与sgRNA的混合物在37℃下孵育5分钟，随后将RNP置于冰上，用于后续注射。

通过显微注射仪将0.5-1nL的混合物注入单细胞阶段胚胎的卵黄或细胞质中。

每次注射使用的注射混合物是1ulCas9、200-400ngsgRNA，总共3ul。EnGenCas9为20uM，并将1000ngsgRNA(混合后的总量)与Cas9一起使用，终浓度为5uM(稀释度为1：4)。

(4)PCR检测靶位点突变情况：

将注射完的斑马鱼胚胎饲养一周，观察是否有卷尾畸形。使用TRIzol试剂提取分离总RNA进行鉴定。

a.单个基因需收集50个斑马鱼胚胎提取RNA，并立即用1mlTRIzol处理。后续使用QiagenRNEasyMiniKit提纯RNA；

b.使用iScriptcDNA合成试剂盒合成cDNA；

c.使用SYBRGreenSupermix在BioRADCFX96实时PCR检测系统上进行实时PCR检测。

(5)筛选基因敲除稳定的斑马鱼遗传系：

筛选F0代有侧凸表型的斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，得到杂合F1代；

F1代杂合斑马鱼随机挑选雄性和雌性进行杂交，得到F2代；

筛选F3代中具有侧凸表型的斑马鱼，随后提取DNA鉴定基因型，确定为dnah10(c.10304_10307del[p.N3435SfsX20])突变，确立基因型-表型关联。

(6)选取卷尾畸形幼鱼饲养至成年，并定期观察表型：

体式显微镜下观察F3代斑马鱼幼鱼，筛选具有卷尾畸形的斑马鱼，单独放入培养缸内喂养，定期观察生长发育情况，记录侧弯表型出现的时间及发生率。

(7)成年侧凸斑马鱼中，提取DNA检测确认基因编辑成功：

选取具有侧弯表型的F3代成年鱼，断尾提取DNA，PCR扩增突变位点dnah10(c.10304_10307del[p.N3435SfsX20])附近DNA片段，应用上述4的方法检测靶点突变情况，测序明确突变存在与否。

(8)根据DNA测序结果和斑马鱼侧凸表型确认模型建立成功：

根据上述表型及DNA测序结果，确认AIS斑马鱼模型构建成功。

成果如下：

如图1所示，dnah10突变在转录本10304-10307位置引入一个4bp的碱基缺失，后导致终止密码子提前出现(截短突变)，在此突变位置之后的4个功能区域丢失。

如图2所示，稳定遗传脊柱侧凸斑马鱼与野生型杂交后获到的杂合子突变，携带该突变的斑马鱼无侧凸表型；

如图3所示，显微注射后出现卷尾畸形的F0代斑马鱼幼鱼，野生型斑马鱼体轴呈直线状，显微注射F0代斑马鱼中可发现体轴弯曲的斑马鱼幼鱼；

如图4所示，稳定遗传F2代脊柱侧凸斑马鱼模型：

F0代突变体中可筛选发现无明显脊柱椎体畸形的侧凸畸形斑马鱼，高度模拟AIS，培育和筛选得到的F2代稳定遗传侧凸斑马鱼模型中，可发现脊柱发育呈S形弯曲，并且未发现椎体缺失、结构异常等模拟先天性脊柱侧凸的表型。

本发明以临床数据出发，采用195例AIS和229健康对照的全外显子测序数据进行对比。测序原始数据经过变异过滤后，共46，499个SNV得到保留进入基因变异负荷分析(Geneburdentest)，寻找与AIS相关的候选基因。经过计算，我们找到了与AIS相关的候选基因288个。进一步的通路、基因家族富集分析以及蛋白功能聚类分析显示，纤毛相关基因与AIS显著相关。其中，基因家族富集分析、PANTHER蛋白功能聚类分析和GO分析显示纤毛相关基因显著富集。因此，我们认为纤毛相关基因(DNAH基因家族共9个基因入选)与AIS发生相关。后续采用家系共分离验证，发现DNAH10基因上存在多个变异与脊柱侧弯共分离。对分析找到的DNAH10基因的致病突变，我们应用Cas9基因编辑技术对斑马鱼dnah10基因进行编辑，确认编辑成功后发现斑马鱼出现了脊柱侧凸表型，饲养成年后通过对斑马鱼骨骼系统染色并观察，确定其表型高度模拟AIS.DNAH10为纤毛相关基因，纤毛基因家族与AIS发生发展相关性在大量文献中得到报道.因此，我们这一通过临床数据出发构建的AIS斑马鱼侧凸模型，用于后续机制研究具有较高代表性，可提高后续机制研究的准确性。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。