胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基突变体、其构建方法及其应用

摘要

本发明公开胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基突变体、其构建方法及其应用。突变后，亚基的编码序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。本发明所构建的胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基突变体菌株的致病降低、对药剂敏感性提高，为研究胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基的功能、互作关系以及胶孢炭疽菌致病机制提供了一个重要的研究工具。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基突变体、其构建方法及其应用。

背景技术

琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase，简称SDH)，也被称为复合体Ⅱ(ComplexⅡ)或琥珀酸泛醌还原酶(succinate-ubiquinone oxidoreductase，SQR)，黄素酶类，属于细胞色素氧化酶，它由4个亚基组成，分别为黄素蛋白(Fp，SDHA)、铁硫蛋白(Ip，SDHB)和另外2种嵌膜蛋白(SDHC和SDHD)，其中SDHA和SDHB组成复合体Ⅱ的可溶性部分，具有琥珀酸脱氢酶活性；SDHC和SDHD将SDHA、SDHB固定在内膜上，且具有泛醌还原酶活性。

琥珀酸脱氢酶各个亚基的突变均存在抗药性风险，已有的研究证明引起抗药性的突变主要体现在SDHB、SDHC、SDHD等亚基上，存在单基因突变引起的抗药性和多基因突变引起的抗药性等普遍现象。如，玉米黑粉病菌SDHB基因上保守的257位组氨酸残基突变为酪氨酸或亮氨酸(9H257Y/L)则会对萎锈灵产生抗药性；灰葡萄孢菌的SDHB基因的H272Y/R、P225L/T/F、H278R、H267L/R、P225F/L、N230I、H132R等多位点突变或单一位点突变均能产生抗药性；禾生球腔菌中SDHB基因突变H267L/Y导致其对萎锈灵的抗性；担子菌Coprinuscinereus的SDHC基因点突变N80K产生对氟酰胺抗性；稻瘟病菌则存在SDHB、SDHC、SDHD基因位点突变对萎锈灵抗性的情况；对黄瓜褐斑菌抗性菌株测序发现SDHB基因发生H278Y突变，后来的研究还发现该菌SDHC或SDHD基因突变都能导致对啶酰菌胺抗性；Alternariaalternata对啶酰菌胺抗性源于SDHB发生S221P、H267N/Y、H272Y/R突变和SDHD D129E突变，并且对啶酰菌胺表现高抗水平性的菌株对萎锈灵存在交互抗性，这与灰霉菌的抗药性突变有相似之处；马铃薯早疫病菌SDHC及SDHD基因发生突变引起对啶酰菌胺的抗性的产生。

而实验室通过紫外诱变同样也能获得抗性突变菌株，如小麦纹枯病Rhizoctoiacerealis抗性突变菌株，对琥珀酸多氢酶亚基测序结果显示主要的突变为B(H246Y)、C(H139Y)和D(H116Y)对fluxapyroxad抗性；Zymoseptoria tritici诱变菌株，测序发现SDHB、C、D亚基共有7处点突变均与抗性有关，包括B亚基H276Y/L、N225T，C亚基T79I、S83G、H152R以及D亚基I50L突变。

胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的炭疽病可以危害新梢、嫩叶、花和果实，同时炭疽病也是果实采收后危害最严重的病害之一，引起贮运期的果实腐烂，严重影响了果实的品质和外观质量。目前有关胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基的研究鲜见报道。因此构建胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基突变体对于胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶及其亚基的功能研究，乃至阐明胶孢炭疽菌致病机理，具有重要意义。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提供胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基突变体、其构建方法及其应用。

本发明技术方案主要包括以下内容：

本发明的目的之一是提供一种胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基突变体，突变后，亚基的编码序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

本发明的目的之二是提供一种靶向胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基基因的靶点RNA，靶向SDHB的靶点RNA序列如SEQ ID NO.4所示，靶向SDHC的靶点RNA序列如SEQ ID NO.5所示，靶向SDHD的靶点RNA序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的目的之三是提供一种含有所述靶点RNA的基因编辑载体，所述载体还含有Hyg、Ori、Amp、Cas9和SV40NLS组件，Cas9氨基酸的编码由Tef1启动子进行启动。

本发明的目的之四是提供所述胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基突变体的构建方法，该构建方法包括以下步骤：

将靶点RNA分别构建至基因编辑CRISPR/Cas9载体上，将构建成功后的载体分别转入大肠杆菌，经扩繁后，提取质粒，经过原生质体转化，获得表达该突变体的菌株。

本发明的目的之五是提供所述胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基突变体、所述靶点RNA或所述基因编辑载体在研究胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶致病机理方面的应用。

本发明的目的之六是提供所述靶点RNA或所述基因编辑载体在降低胶孢炭疽菌致病力方面的应用。

本发明的目的之七是提供所述胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基突变体、所述靶点RNA或所述基因编辑载体在研究胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基互作关系方面的应用。

本发明所取得的效果：

本发明所构建的胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基突变体菌株的致病力降低、对药剂敏感性提高，为研究胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基的功能、互作关系以及胶孢炭疽菌致病机制提供了一个重要的研究工具。

本发明提供了胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基突变体菌株的构建方法，提供了该突变体的的获得途径。在胶孢炭疽菌中成功建立了CRISPR/Cas9技术体系，为研究琥珀酸脱氢酶亚基的功能奠定基础。该构建方法简便易操作，易推广使用。

附图说明

图1：CRISPR/Cas9基因编辑载体构建示意图；注：图中SDHB、SDHC、SDHD位置分别代表表1中的靶点序列

图2：野生型和突变型菌株的致病性试验结果

图3：野生型与突变体菌株病斑直径比较(接种3d)

图4：野生型与突变体菌株病斑直径比较(接种5d)

图5：不同寄主病健交界处糖基转移酶活性

图6：不同寄主病健交界处谷氨酸脱氢酶活性

图7：不同寄主病健交界处多酚氧化酶活性

图8：不同寄主病健交界处几丁质酶活性

图9：不同寄主病健交界处过氧化物酶活性

图10：不同寄主病健交界处过氧化氢酶活性

图11：不同药剂在1000mg/L浓度下对突变体的抑菌作用

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面结合具体实施例和附图，对本发明做进一步的说明。

供试材料：

供试芒果胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides菌株171-1由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所分离、鉴定并保存。

试验所用寄主果实种类有：芒果(Mangifera indica L.)，苹果(Malus pumilaMill.)，梨(Pyrus bretschneideri Rehder.)。

培养基和溶液的配制：

PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、去离子水定容至1L、琼脂20g；

PDB培养基：不含琼脂的PDA；

LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取粉5g、NaCl 10g、去离子水定容至1L、琼脂20g、pH7.0；

LB培养液：不含琼脂的LB；

PDS培养基：含0.8M蔗糖的PDA；

PDS培养液：不含琼脂的PDS；

1M Tris-HCl(pH8.0)：400mL水中溶解60.5g Tris，浓盐酸调节pH至8.0，定容至500mL；

0.1M磷酸缓冲液(含0.8M NaCl，pH5.8)：100mL水中溶解2.5g KH

1.2M STC buffer：1.2M sorbitol，10mM CaCl

2M STC buffer：2M sorbitol，100mM CaCl

溶壁酶和蜗牛酶溶液：用0.1M pH5.8的磷酸缓冲液(含0.8M NaCl)溶解酶，使酶液终浓度为20mg/mL，经0.22μL细菌过滤器过滤后使用；

PEG buffer：PEG4000 60％，100mM CaCl

0.5M EDTA(pH8.0)：160mL水中溶解37.22g Na

CTAB提取液：CTAB 20g，10mM Tris-Cl(pH8.0)100mL，0.5M EDTA(pH8.0)40mL，NaCl 81.82g，去离子水定容至1L。

数据分析：所得的数据经Excel表记录，先用IBM SPSS Statistics进行t-测验、计算平均值和标准差，再通过数据分析软件进行Duncan's新复极差法进行方差分析，p<0.05为显著性差异，用小写英文字母或星号表示。

实施例1突变体的获得

(1)基因编辑载体构建与质粒提取

对琥珀酸脱氢酶亚基SDHB、SDHC、SDHD的CDS序列分析(序列见SEQ ID NO.7～9)，设计靶点RNA(sgRNA)序列(表1)，构建至基因编辑CRISPR/Cas9载体pHS-Cas9上，该载体含有Hyg、Ori、Amp、Cas9、SV40NLS等组件，Cas9氨基酸的编码由Tef1启动子进行启动，构建成功后分别将载体命名为pHS-Cas9-SDHB、pHS-Cas9-SDHC、pHS-Cas9-SDHD(图1)，转入大肠杆菌DH5α后，经扩繁后，用大提质粒提取试剂盒提取质粒，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，以NanoDrop 2000C测定其浓度，经浓缩、纯化后将质粒浓度提纯至1μg/μl，用于后续胶孢炭疽菌的基因编辑。

(2)胶孢炭疽菌的原生质制备与转化

胶孢炭疽菌原生质体的制备，具体步骤为：在胶孢炭疽菌171-1的PDA平板上打3个菌饼于无菌研钵中研磨后，加入2ml无菌水，混匀后接种到100mL的PDB培养液中，于28℃、180rpm摇床中黑暗培养2d；用三层无菌擦镜纸过滤，收集新鲜菌丝，先用无菌水冲洗3次，再用0.8M NaCl冲洗2次，在无菌培养皿中切碎；在50mL无菌三角瓶中加入0.5g的碎菌丝，加入10mL溶壁酶和蜗牛酶酶液，30℃、60rpm摇床中黑暗振荡培养3h，镜检观察细胞壁裂解情况；上述混合液经3层无菌擦镜纸过滤，用15mL尖底离心管收集滤液，4℃、5000rpm离心15min(下同)收集沉淀；弃上清液，用1.2M STC溶液洗涤原生质体2次，再离心收集沉淀，用1.2MSTC溶液稀释原生质体，使其终浓度达3×10

PEG介导的原生质体转化，具体步骤为：15mL尖底离心管中加入100μL质粒，35μL2M STC溶液，110μL原生质体，用移液枪轻轻吹打充分混合，冰浴20min；加入2mL 60％PEG4000溶液，轻轻混匀，室温放置20min；加入3mL PDS再生培养液，轻轻混匀，将离心管水平放置于垫有锡箔纸的铝盒中，28℃光照培养24h，每间隔12h轻轻翻转1次；将上述混合液均匀涂布于含有潮霉素抗性的PDS平板上，于28℃培养箱中培养，待有菌落形成后，加盖上一层含有潮霉素抗性的PDA培养基，继续于28℃培养箱中培养；待平板上长出单菌落后，灭菌牙签挑取单菌落，移至含有潮霉素的PDA平板上，28℃培养。

(3)转化子的PCR鉴定与Sanger测序鉴定

转化子的鉴定，刮取待测突变体的菌丝置于2.0mL的离心管中，经样品快速研磨仪研磨(60Hz、120s)震荡2次后，采用CTAB法提取待测转化子DNA。菌丝总基因组DNA提取后，加入60℃预热的无菌超纯水溶解DNA，-20℃保存备用。以基因组总DNA为模板，以Hyg-F/Hyg-R为引物，用高保真酶pfu酶进行PCR鉴定，经1％琼脂糖凝胶电泳检测有潮霉素目的条带的疑似阳性菌株，再以靶基因的特异性引物序列进行高保真pfu酶扩增，经1％琼脂糖凝胶电泳检测有目的条带后，送华大基因进行Sanger测序，对测序结果与野生型171-1的靶基因序列进行Blast比对分析，判定靶基因靶点上下游的碱基序列缺失、突变、插入等，并根据氨基酸序列的预测判定是否为有效的基因编辑。

表1基因靶点序列

结果：

镜检观察胶孢炭疽菌野生型菌株171-1细胞壁的裂解情况，结果表明，原生质体可用于后续实验，应立即进行转化实验，经加入基因编辑CRISPR/Cas9质粒、细胞壁再生等步骤后，将疑似转化子转接至含有潮霉素B抗性平板上连续培养后，选取长势正常的菌株，这些长势正常的菌株对潮霉素B具有抗性，推测其含有转入的潮霉素B抗性基因Hyg的序列，再以其基因组总DNA为模板、以HygF/HygR引物对进行PCR的片段扩增，得到大小匹配的目标片段，可以确定供试的DNA中含有潮霉素B的抗性基因，而未得到目的片段的则为假阳性；为了更进一步的确认靶基因序列被CRISPR/Cas9基因编辑载体编辑的位置，以靶基因特异性引物扩增，产物送至华大基因进行Sanger测序，以野生型菌株171-1为对照序列。对测序结果进行比对发现，分别转入基因编辑载体pHS-Cas9-SDHB、pHS-Cas9-SDHC、pHS-Cas9-SDHD的突变体，在靶点周围发生了碱基缺失、替换等。经筛选获得的突变体B14菌株(序列见SEQ IDNO.1)、C61菌株(序列见SEQ ID NO.2)、D70菌株(序列见SEQ ID NO.3)。

实施例2基因编辑突变体的致病性测定

为了测定胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶基因被编辑后的致病性，选取能被胶孢炭疽菌侵染的芒果、苹果和梨3个物种的成熟可食的果实为待测对象，经清水冲洗干净后，于1％NaClO溶液中浸泡15min，无菌水冲洗，晾干表面水珠后放置于保鲜盒中，相对湿度100％、25℃恒温环境中，用于致病性测定，以野生型菌株171-1为对照。使用灭菌好的束针刺伤果实表面，在菌株活化5d后，打取5mm菌饼接种于刺伤处，无菌PDA菌饼接种作为对照，在接种处滴加20μL无菌水保湿，3d、5d测量病斑直径并拍照记录，每个菌株接种10个果实、重复3次。

5d后，刮取接种部位及周围的菌丝，经液氮研磨后，加入2倍体积的PBS(pH7.4)的磷酸缓冲液提取总蛋白；挖取发病部位的果肉、病健交界部位的果肉、未感染病斑的果肉，经快速研磨仪研磨(60Hz、60s)震荡2次后，加入10倍体积的无菌水，静置1h后测定上清液的pH；挖取病健交界部位果肉，经快速研磨仪研磨(60Hz、60s)震荡2次后，加入2倍体积的PBS(pH7.4)的磷酸缓冲液，4℃4000rpm离心10min。

使用ELISA试剂盒测定几丁质酶(CHI)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)、糖基转移酶(GT)等活性。

结果：

将野生型和突变型菌株分别接种于刺伤的果实表面(芒果、苹果和梨)，测量病斑直径。接种5d后发现野生型和突变型均能引起3种寄主果实发病，且相同菌株对不同寄主果实所造成的侵染程度基本表现一致，由B14、C61、D70侵染寄主所造成的病斑直径显著小于野生型。这表明B14、C61、D70的致病力显著小于野生型菌株171-1的致病力。(图2)

用十字交叉法对接种于寄主果实表面3d、5d的病斑进行测量，结合两次测量结果可得：较野生型171-1而言突变型菌株B14、C61、D70的病斑扩展速率明显缓慢，其中SDHB与野生型的差异显著性最为明显，SDHC、SDHD次之，说明不同的基因之间的在病原菌侵染过程中所发挥的作用有所不同。(图3、图4)

突变体侵染时寄主抗性相关物质的应急响应情况：

糖基转移酶(GT)催化生物体内活化的糖与不同的受体分子相连接，其产物具有许多生物学功能。根据酶活测定结果可知：不同菌株接种在相同寄主病健交界处上的糖基转移酶活性走势基本相同，接种171-1的寄主中糖基转移酶活性最低，接种C61、D70寄主的糖基转移酶活性较接种171-1、B14的高，接种B14与171-1的寄主梨的糖基转移酶活性差距无显著差异。(图5)

谷氨酸脱氢酶(GLDH)普遍存在植物中，是一种金属酶蛋白。根据酶活测定结果可知：接种突变体的寄主病健交界处的谷氨酸脱氢酶活性显著高于接种野生型的寄主，在不同寄主上接种相同菌株的谷氨酸脱氢酶活性差异具有一致性，接种B14的寄主病健交界处谷氨酸脱氢酶活性最高，C61次之，D70第3，171-1活性最低。(图6)

在植物组织中，多酚氧化酶(PPO)天然状态无活性，其在组织匀浆或损伤后才表现出活性。由酶活测定结果可知：接种171-1的寄主中多酚氧化酶活性显著低于接种突变菌株的寄主，说明接种171-1的寄主腐烂程度更为严重，活体细胞产生多酚氧化酶的能力下降，而测定得到的活性显著低于突变体；在不同寄主上接种同种突变菌株，测得多酚氧化酶活性变化趋势较为一致，其中接种B14的寄主中多酚氧化酶活性较高，说明其腐烂程度低，消耗的多酚氧化物因而也少。(图7)

几丁质酶(CHI)广泛存在于高等植物的各个器官中，平时含量很少，活性很低，但是在受到病原物侵染或受到其他诱导后，几丁质酶迅速产生和积累。根据不同寄主病健交界处几丁质酶活性可知，致病力最强的菌株171-1侵染果实时，几丁质酶活性显著高于突变体B14和C61，但显著性低于突变体D70。(图8)

过氧化物酶(POD)是一类氧化还原酶，参与多种催化反应。过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。根据酶活测定结果可知：不同菌株接种在相同寄主病健交界处上的过氧化物酶活性走势基本相同，接种171-1的寄主中氧化物酶活性最低，接种B14、C61寄主的过氧化物酶活性较接种171-1、D70的高，接种D70与171-1的寄主过氧化物酶活性差距无显著差异。(图9)

过氧化氢酶(CAT)是一类以铁卟啉为辅基的酶类清除剂，又称触媒。酶活测定结果表明：171-1侵染过后的寄主病健交界处的过氧化氢酶活性高于突变体侵染后的病健交界处，接种突变体的寄主过氧化氢酶活性有不同程度的降低，其中B14的过氧化氢酶活性最低，差异显著性最大。(图10)

实施例3基因编辑突变体的药剂敏感性

配制终浓度为1000mg/L的含噻呋酰胺、啶酰菌胺、氟吡菌酰胺的PDA培养基，制成含药PDA平板和不含药的对照PDA平板，分别接种野生型菌株、突变体菌株。无菌操作台内接种后置于28℃培养箱内恒温避光培养，测定菌落直径、统计分生孢子的量。试验重复3次。

结果：

通过测定野生型菌株和突变体菌株在含有终浓度为1000mg/L的含噻呋酰胺、啶酰菌胺、氟吡菌酰胺的PDA平板上的菌落直径，发现在不含药的CK组，突变体的生长速度较为缓慢，菌丝稀疏、紧贴在培养基表面；在含药的平板上，突变体的生长速度显著慢于野生型菌株171-1，部分菌株甚至培养5天后菌落直径仍不足1cm；突变体对噻呋酰胺和氟吡菌酰胺的敏感性高于啶酰菌胺，同一突变体对不同的药剂的敏感性也有所不同。(图11)

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120> 胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶亚基突变体、其构建方法及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 143

<212> DNA

<213> 胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)

<223> SDHB基因突变体序列

<400> 1

atggcagctc tccgctcttc ctctcgagtc cttggaacgg ccacgaaggc cgcttccgcc 60

ctattgtcac gatccctcgc cgtggccttg ccacccctac ggatgcgccc gcggtcaagg 120

agcccaagat gaagaagttc acc 143

<210> 2

<211> 149

<212> DNA

<213> 胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)

<223> SDHC基因突变体序列

<400> 2

atggcgattg gcataacagc gcaggaaagc cctccgtctt cttcaactcc cagatcccca 60

aggccgtcgt cgcctccagc atgtccacga cgcagatccg gtacgcaaac tactcccccc 120

gtcaacgatc cctcgaaact attccctca 149

<210> 3

<211> 218

<212> DNA

<213> 胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)

<223> SDHD基因突变体序列

<400> 3

atggcttcgt ttgtgcgacc tgctctgctc aggcagacgg ccatggctgc ccggatggcc 60

aagaccggcg catcccgctc tgccttcctc aagcctaccg tccagaagga gttcgtcaac 120

aacacgacaa gagtcgccgc cttccacacc accgccaaga gagatttgct gcccgtcggc 180

cctcgtacgt tccaaagcat gacatgcgcc tggtgtac 218

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> CgSDHB靶点序列

<400> 4

ttcctctcga gtccttggaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> CgSDHC靶点序列

<400> 5

cttcaactct cagatcccca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<223> CgSDHD靶点序列

<400> 6

aagagagatt tgctgcccgt 20

<210> 7

<211> 831

<212> DNA

<213> 胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)

<223> 野生型CgSDHB基因cds序列

<400> 7

atggcagctc tccgctcttc ctctcgagtc cttggaacgg ccacgaaggc cgctttccgc 60

cctattgtca cgatccctcg ccgtggcctt gccaccccta cggatgcgcc cgcggtcaag 120

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<210> 8

<211> 546

<212> DNA

<213> 胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)

<223> 野生型CgSDHC基因cds序列

<400> 8

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<210> 9

<211> 555

<212> DNA

<213> 胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)

<223> 野生型CgSDHD基因cds序列

<400> 9

atggcttcgt ttgtgcgacc tgctctgctc aggcagacgg ccatggctgc ccggatggcc 60

aagaccggcg catcccgctc tgccttcctc aagcctaccg tccagaagga gttcgtcaac 120

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atctggaagg cttga 555