一种I型干扰素受体基因敲除牛肾细胞系及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种I型干扰素受体(type I interferon alpha receptor，IFNAR1)基因敲除牛肾细胞系，是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对牛肾细胞进行基因编辑，并经过单克隆挑选而得到。经表型验证表明IFNAR1敲除的牛肾细胞系不表达IFNAR1且感染牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和3型牛副流感病毒(BPIV‑3)后，病毒滴度均可显著提高，从而可用于牛源病毒临床株的分离鉴定并提高病毒的增殖效率。

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种I型干扰素受体(typeⅠinterferon alphareceptor， IFNAR1)敲除的牛肾细胞系，本发明还涉及该细胞系在牛源病毒分离鉴定和复制增殖中的应用及其构建方法。

背景技术

干扰素(Interferon,IFN)是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的细胞因子。一般分为三大类：以IFN-α，IFN-β为代表的I型干扰素，以IFN-γ为代表的II型干扰素和以IFN-λ为代表的III型干扰素。有研究表明，IFN-I能抑制I型干扰素信号，促进对持续性感染病毒的控制。干扰素的抗病毒作用是间接地依靠自分泌或旁分泌途径，在病毒感染细胞后，靶细胞会释放出干扰素，释放出的干扰素会与下游细胞表面的IFN受体结合，激活细胞内信号传导途径，并通过活化多条细胞内信号传导通路上的蛋白分子来调节细胞的生长、分化，使得下游细胞免受病毒的感染，从而达到抗病毒的目的，而干扰素本身是不发挥直接“抑杀”或者“中和”病毒的作用的，上述干扰素从产生到影响下游细胞产生抗病毒反应的过程可称为 JAK-STAT信号通路。细胞感染病毒后，在靶细胞中，通过干扰素与下游细胞的干扰素受体结合从而向下游细胞传递信号，基于此，本发明提出通过敲除干扰素受体来阻断或降低 JAK-STAT信号通路，从而增加病毒复制的思路。

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)和3型牛副流感病毒(Bovineparainfluenza virus type 3, BPIV-3)牛最常见的致病性病毒，是牛呼吸疾病综合征(Bovine respiratory disease complex, BRD)的主要病毒性病原。其中，BVDV属于黄病毒科、瘟病毒属，与猪瘟病毒及羊边界病病毒具有很高的同源性，有囊膜、球型的单股正链RNA病毒。BVDV除导致BRD外，还可引起牛病毒性腹泻-黏膜病，该病主要以发热、咳嗽、繁殖障碍、免疫抑制造成的呼吸系统和肠道系统疾病、持续感染、血小板减少和出血及致死性粘膜病为临床特征，且呈世界性分布。持续性感染个体症状隐蔽，动物带毒率高，特别是严重影响感染动物的繁殖，是在世界范围内对养牛业造成重大经济损失的疫病之一。但是，BVDV在牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cells,MDBK cells)中的增殖较慢，且病毒滴度较低，给病毒的临床分离和鉴定造成了很大难度。

由成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats, CRISPR)以及CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)组成的CRISPR/Cas9 系统是第三代人工核酸内切酶，具有构建方法简单快捷、成本低廉、突变效率高、易于实施等优点，已在动植物抗病育种，遗传性状改良，人类遗传病研究等领域得到广泛应用，并引领了基因组工程领域的巨大飞跃，是目前最常用的基因编辑技术。

因此，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将MDBK细胞的IFNAR1基因突变。进一步验证该突变细胞株感染牛源病毒后的病毒增殖效率，为更加高效的分离鉴定牛源病毒提供优良的宿主细胞。

发明内容

本发明目的是针对BVDV在MDBK细胞中增殖慢，病毒滴度低的问题，提供一种基因敲除牛肾细胞系，通过敲除I型干扰素受体提高牛源病毒的增殖效率，使MDBK细胞能更好地应用于牛源病毒的临床分离和鉴定。

为实现上述目的，申请人以CRISPR/Cas9系统为研究工具，对MDBK细胞的I型干扰素受体(IFNAR1)进行了基因敲除，获得了IFNAR1敲除的MDBK细胞系，经细胞表型验证，基因敲除后的MDBK细胞不表达IFNAR1，能增加牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovinerhinotracheitis virus,IBRV)、3型牛副流感病毒(Bovine parainfluenza virus type3, BPIV-3)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的病毒滴度，在牛源病毒复制增殖中具有更好的应用前景。

本发明进一步提供一种构建所述基因敲除牛肾细胞系的方法，申请人针对IFNAR1基因序列设计了4条sgRNA，接着分别针对这4条sgRNA的质粒进行慢病毒包装，用包装后的慢病毒感染实验室之前复苏培养的含Cas9蛋白的MDBK细胞系，经过药物筛选得到存活的IFNAR1敲除的MDBK多克隆细胞，最后进行单克隆挑选。待单克隆细胞培养至一定数量，提取其基因组，进行测序分析突变类型。最后对挑选成功的单克隆细胞进行表型验证，得到IFNAR1敲除的MDBK细胞系。

具体步骤如下：

(1)构建含Cas9蛋白的牛肾细胞；

(2)设计针对牛肾细胞I型干扰素受体基因的sgRNA序列及其引物，构建sgRNA表达质粒；

(3)慢病毒包装sgRNA表达质粒；

(4)用包装sgRNA表达质粒的慢病毒感染含Cas9蛋白的牛肾细胞，获得I型干扰素受体敲除的多克隆牛肾细胞系；

(5)从多克隆牛肾细胞系中克隆挑选单克隆细胞。

优选地，所述sgRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述sgRNA序列的引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

优选地，所述sgRNA表达质粒的载体为T载体。

本发明具有以下优点：

1、本发明构建的基因敲除细胞系利用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，具有构建方法简单快捷、成本低廉、突变效率高等优点。

2、本发明构建的基因敲除细胞系由于被敲除的基因是I型干扰素受体，因此与野生型 MDBK细胞相比可显著提高牛源病毒(BVDV,BPIV-3,IBRV)滴度。

3、本发明构建的基因敲除细胞系由于是MDBK细胞，因此可用于牛源病毒的临床分离，解决临床分离和鉴定病毒和增殖难题。

更详细的技术方案请参见具体实施例。

附图说明

图1：本发明构建的含Cas9蛋白MDBK细胞的切割效率测定结果，共挑选5株细胞进行Cas9活性检测，其中编号为I的MDBK细胞切割效率最高，活性最强。

图2：电泳检测T7E1酶切敲除效率的实验结果，验证4条sgRNA均造成有效切割。

图3：编号为sgRNA2-10的IFNAR1敲除的MDBK细胞系测序结果。图中：WT：野生型MDBK细胞序列，-代表碱基缺失。

图4：编号为sgRNA4-L的IFNAR1敲除的MDBK细胞系测序结果。图中：框里代表sgRNA序列，sgRNA4-L峰图显示在sgRNA位置有双峰。

图5：编号为sgRNA4-L的IFNAR1敲除的MDBK细胞的TA克隆测序结果。图中：WT：野生型MDBK细胞序列，-代表碱基缺失。其中挑取的30个克隆里突变类型1占总数的60％，突变类型2占总数的36.7％，突变类型3占总数的3.3％，突变率达到100％。

图6：编号为sgRNA2-10、sgRNA4-L的IFNAR1敲除的MDBK细胞表型验证结果。图中：WT是野生型MDBK，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，mean±SEM(n＝3)。

图7：编号为sgRNA4-L的IFNAR1敲除MDBK细胞的转录水平表达相对定量PCR结果。图中：WT是野生型MDBK，***p<0.001，mean±SEM(n＝3)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。应当理解的是，以下实施例仅用于解释本发明而不是用于限制本发明的保护范围。本领域技术人员在以下实施例基础上做出各种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或工具书《分子克隆：实验室指南》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory,1989)予以实施，或者按照生产商提供的操作手册中建议的方法予以实施。实施例中未注明来源的材料例如MDBK细胞、Cas9蛋白、293T细胞、包装质粒、MSTN慢病毒、T载体等均为本领域所熟知的常用材料，可根据文献报导自行构建或通过商业途径获得。本实验中的质粒具体信息可在http://www.addgene.org/查询，Cas9质粒(#52962)，酶切质粒信息为pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP(#67991)，包装辅助质粒PMD2.G (#12259)、PSPAX2(#12260)。

实施例1：构建含Cas9蛋白的MDBK细胞

CRISPR/Cas9基因敲除系统因其构建方便，设计灵活，是基因敲除的新一代利器。该系统由有DNA切割活性的Cas9蛋白、识别特异靶点的向导RNA组成，由于只需对系统中的向导RNA进行编辑就能实现靶点识别，因此极大提高了构建基因敲除载体的效率。其中，构建稳定表达Cas9蛋白的稳转细胞系是实现基因敲除的前提条件，目前常用的Cas9蛋白稳转细胞系构建方法步骤如下：包装表达Cas9蛋白的慢病毒、Cas9慢病毒感染目的细胞、稳转细胞系筛选及功能验证。

本实验构建了Cas9蛋白的慢病毒表达载体，利用慢病毒的高效转染和稳定表达特点，构建稳定表达Cas9蛋白的MDBK细胞株，后续实验中只需要导入小分子sgRNA就能实现目的基因敲除。具体方法如下：

1.慢病毒包装Cas9表达质粒

复苏及培养：复苏293T细胞于10cm细胞培养皿中，长满后传代，取3代左右生长状态良好的293T细胞(10cm细胞培养皿，90％-95％汇合，含10％FBS新鲜无抗生素的DMEM 培养基)，进行慢病毒包装。

转染：转染前吸弃除旧培养基，加入含5％FBS和1％青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基继续放回培养箱培养(漂浮细胞较多时考虑用PBS清洗一遍)；对于一个10cm细胞培养皿，慢病毒包装时质粒总量为24μg，其中(PMD2.G：PSPAX2：Cas质粒＝1：2：3)；向500μLJetprime Buffer依次加入对应体积的质粒，轻轻吹打混匀后，加入40μL JetprimeRegent，轻轻吹打混匀，室温静置10min后加入到培养皿中，轻轻摇匀放回培养箱；病毒包装后4-6h 换10ml含5％FBS和1％双抗的DMEM培养基，放回培养箱继续培养；换液24h后再补加10ml 含5％FBS和1％双抗的DMEM培养基，混匀后放回培养箱。

超离：病毒包装60～72h，观察细胞形态，收集细胞上清液(每2个10cm细胞培养皿于一个50mL离心管)，封口膜密封后4℃3000rpm/min离心10min，取上清0.45μm滤器过滤到超速离心管，然后30000rpm 4℃超高速离心2.5h；之后倒尽上清液，倒扣于吸水纸上吸尽残液，每管加入120μL预冷的PBS重悬，完全吹开混匀后将同种病毒浓缩液转至同一收集管中4℃过夜弥散；根据后期实验需求量，分装后置于-80℃保存。

2.获得含Cas9蛋白的MDBK多克隆细胞

先复苏MDBK于六孔板，长满后进行1：3传代，待细胞长满至60％左右时，弃掉旧的培养基，每孔加入1mL细胞维持液(含2％FBS+1％双抗的DMEM)，接着加入1μL polybreme，再加入40μL Cas9慢病毒混匀，孵育24h后弃掉旧培养液，加入2mL含5％FBS和1％双抗的DMEM培养液，再孵育24h后，换2mL含5％FBS、1％双抗和5μg/mL杀稻瘟菌素的DMEM 培养液进行药筛。待阴性对照药筛孔全部死亡后，将阳性对照和阴性对照传代(注：阳性对照孔1:2传代六孔板，阴性对照传两个孔，一个作阴性对照药筛组)，如此一共药筛作用7天时间，得到含Cas9蛋白的MDBK多克隆细胞系。

3.含Cas9蛋白的MDBK单克隆挑选及蛋白验证

将含Cas9蛋白的MDBK多克隆细胞系扩大培养后进行细胞计数，取100个细胞铺1个96孔板，共铺2个96孔板。每隔5天进行细胞换液(含10％FBS+1％双抗的DMEM)，逐日进行观察，将由一个细胞长满一个孔的细胞消化下来转移到六孔板，一部分扩大培养进行冻存，一部分进行细胞蛋白质提取，将提取的蛋白质进行Western Blot验证，在验证的49株细胞系中，共有38株含有Cas9蛋白。

4.对确定含Cas9蛋白的单克隆细胞系进行Cas9活性检测

根据MDBK细胞的状态和活力挑选出五株MDBK-Cas9细胞(编号分别为I、P、O、20、25)复苏到六孔板进行培养，待细胞长满至百分之五十左右，弃掉原培养基，加入1mL细胞维持液(含2％FBS和1％双抗的DMEM)，再加入1μL Polybrene Transfection reagent(聚乙烯转染试剂)(作用浓度10μg/μL)，接着加入30μL的MSTN慢病毒，摇匀后放入恒温培养箱培养24h，换2mL细胞维持液，再过36h，换药筛液(含2％FBS、1％双抗和2μg/mL嘌呤霉素的DMEM)进行药筛，待阴性对照药筛孔细胞死光后将阳性药筛孔细胞1:3传代培养，如此作用十天左右，利用TIANamp Genomic DNAKit(公司：天根，货号：DP304-02)试剂盒提取细胞DNA。

将提取的基因组浓度统一调整到300ng/μL(±10ng/μL)，接着进行PCR扩增。扩增引物序列如表1，按照表2配制PCR反应体系。程序为98℃预变性5min，循环数为1；98℃变性10s，57℃退火15s，72℃延伸30s，循环数为35；最后72℃延伸5min。

表1扩增MSTN引物序列信息

表2 PCR扩增反应体系

经2％的琼脂凝胶电泳确定目的条带和大小。利用Universal DNA PurificationKit(公司：天根生化科技有限公司；货号：DP214-03)试剂盒将PCR产物纯化，统一调整浓度到20ng/μL (±2ng/μL)，按照表3配制T7E1酶切反应体系进行T7E1酶切实验。程序为先不加T7E1酶，进行95℃变性5min，95℃到85℃每秒降低2℃，85℃到25℃每秒降低0.1℃，之后再加1μL 的T7E1酶，混匀，37℃反应30min。最后2％的琼脂凝胶电泳确的目的条带和大小。结果如图1所示，编号为I的MDBK细胞切割效率最高，活性最强，因此选取MDBK-Cas9-I进行后续实验。

表3 T7E1酶切反应体系

实施例2：IFNAR1敲除的MDBK单克隆细胞构建

1.对实验室前期挑选的含Cas9蛋白的MDBK细胞进行复苏及传代培养

首先从液氮中取出之前保存的含Cas9蛋白的MDBK细胞(MDBK-Cas9-I)，迅速放入37℃水浴锅中，期间不断摇晃，使细胞解冻。将解冻的细胞放入无菌操作台，用移液器先吸取5mL 细胞培养基(含5％FBS和2％双抗的DMEM)，再吸取细胞悬液，反复吹打几次，注入离心管。1000r/min，离心5分钟，弃去上清液。取2mL细胞培养基加入离心管，反复吹打均匀后将细胞转移至六孔板中，置37℃，5％CO

当细胞铺满六孔板约95％～100％时进行传代培养。具体操作步骤为将铺满MDBK-Cas9-I 细胞的六孔板从恒温培养箱取出，弃去旧培养液，加入1mL PBS清洗，弃掉PBS，加入胰蛋白酶1mL，置37℃，5％CO

2.设计针对IFNAR1基因的sgRNA序列，构建质粒

2.1设计针对IFNAR1基因的sgRNA序列

如表4，根据NCBI中IFNAR1(Gene ID:282257)序列设计了4条sgRNA，且针对4条sgRNA分别设计了4对引物用于质粒构建。

表4 sgRNA序列及质粒构建引物序列信息

2.2sgRNA质粒构建

退火：分别针对每一条sgRNA的正反向引物各取5μL，进行退火程序。即：95℃变性10min；65℃退火60min。

目的片段连接T载体：接着按照表5配制反应体系进行目的片段与T载体(公司：Takara；货号：6013)连接反应，程序为25℃30min；65℃10min。

表5 T4连接酶反应体系

转化：取50μL冰浴上融化的感受态细胞(公司：北京全式金生物；货号：CD201)，加入上述连接产物，轻轻弹匀，在冰浴中放置30min；42℃水浴热激45s，然后快速将管转移到冰上2min，该过程注意不要摇晃离心管；向每个离心管中加入500μL无菌的LB培养基，混匀后置于37℃，200rpm的摇床培养1h，使细菌复苏；接着4000rpm离心5min，弃350μL上清，剩余200μL重悬已转化的感受态，加入含氨苄抗性的LB琼脂平板上，将细胞均匀涂开，待液体被吸收后，倒置平板，37℃过夜培养。

单克隆检测：挑取单克隆加入含氨苄抗性的LB液体培养基中，置于37℃，200rpm的摇床进行扩大培养，大约4-5h，混匀即可。取200μL菌液送擎科测序。

sgRNA表达质粒提取：将测序成功的单克隆菌液根据质粒小提试剂盒(公司：OmegaBio-Tek；货号：D6950-02)提取sgRNA表达质粒。

3.IFNAR1敲除的MDBK多克隆细胞系的获得

按照实施例1步骤1类似的方法进行慢病毒包装sgRNA表达质粒，之后复苏 MDBK-Cas9-I于六孔板，长满后进行1：3传代，待细胞长满至60％左右时，弃掉旧的培养基，每孔加入1mL细胞维持液(含2％FBS+1％双抗的DMEM)，接着加入1μL polybreme，再分别加入40μLsgRNA慢病毒混匀，孵育24h后弃掉旧培养液，加入2mL含5％FBS和1％双抗的培养液，再孵育24h后，换2mL含5％FBS、1％双抗和2μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养液进行药筛。待阴性对照药筛孔全部死亡后，将阳性对照和阴性对照传代(注：阳性对照孔1:2传代六孔板，阴性对照传两个孔，一个作阴性对照药筛组)，如此一共药筛作用7天时间，得到IFNAR1敲除的MDBK细胞系。一部分扩大培养进行冻存，一部分利用TIANamp Genomic DNAKit试剂盒提取细胞DNA。

4.T7E1酶切验证敲除效率

先将步骤3中提取的基因组浓度统一调整到300ng/μL(±10ng/μL)，接着进行PCR扩增。扩增引物序列如表6，按照表2配制PCR反应体系。程序为98℃预变性5min，循环数为1；98℃变性10s，57℃退火15s，72℃延伸30s，循环数为35；最后72℃延伸5min。

表6扩增目的片段引物序列信息

经2％的琼脂凝胶电泳确定目的条带和大小。利用Universal DNA PurificationKit试剂盒将PCR产物纯化，统一调整浓度到20ng/μL(±2ng/μL)，按照表3配制T7E1酶切反应体系进行T7E1酶切实验。程序为先不加T7E1酶，进行95℃变性5min，95℃到85℃每秒降低2℃， 85℃到25℃每秒降低0.1℃，之后再加1μL的T7E1酶，混匀，37℃反应30min。最后2％的琼脂凝胶电泳确的目的条带和大小。结果如图2所示，4条sgRNA均造成有效敲除。

5.IFNAR1敲除的MDBK单克隆细胞挑选

复苏IFNAR1敲除的MDBK多克隆细胞系于六孔板，长满后进行细胞计数，分别取100个细胞铺1个96孔板，每种sgRNA敲除细胞系共铺2个96孔板。每隔5天进行细胞换液(含10％FBS+1％双抗的DMEM)，逐日进行观察，将由一个细胞长满一个孔的细胞消化下来转移到六孔板，一部分扩大培养进行冻存，一部分利用TIANamp Genomic DNAKit试剂盒提取细胞DNA。

将提取的DNA进行PCR扩增，PCR产物送去擎科测序，与野生型MDBK相比，确定突变类型，编号为sgRNA2-10的IFNAR1敲除的MDBK细胞系测序结果如图3显示，有7 个碱基的缺失，编号为sgRNA4-L的IFNAR1敲除的MDBK细胞系测序结果如图4，在sgRNA 位置为双峰。编号为sgRNA1和sgRNA3的IFNAR1敲除的MDBK单克隆细胞因后期验证发现表型与野生型MDBK细胞无差异，故不再展示单克隆挑选结果。

6.TA克隆验证突变类型

将步骤5中提取的编号为sgRNA4-L的IFNAR1敲除的MDBK细胞基因组进行PCR扩增。引物序列信息如表7，按照表8配制PCR反应体系。程序为95℃预变性3min，循环数为1；95℃变性15s，59.5℃退火15s，72℃延伸30s，循环数为45；最后72℃延伸5min。

表7 TA克隆引物序列信息

表8 TA克隆PCR反应体系

经2％的琼脂凝胶电泳确定目的条带和大小。利用Universal DNA PurificationKit试剂盒将PCR产物纯化，按照表9配制T载体连接体系，之后进行16℃连接30min程序。

表9 T载体连接反应体系

转化：取50μL冰浴上融化的感受态细胞，加入上述连接产物，轻轻弹匀，在冰浴中放置30min；42℃水浴热激45s，然后快速将管转移到冰上2min，该过程注意不要摇晃离心管；向每个离心管中加入500μL无菌的LB培养基，混匀后置于37℃，200rpm的摇床培养1h，使细菌复苏；接着4000rpm离心5min，弃350μL上清，剩余200μL重悬已转化的感受态，加入含氨苄抗性的LB琼脂平板上，将细胞均匀涂开，待液体被吸收后，倒置平板，37℃过夜培养。

单克隆检测：挑取30个单克隆加入含氨苄抗性的LB液体培养基中，置于37℃，200rpm 的摇床进行扩大培养，大约4-5h，混匀即可。取200μL菌液送擎科测序，结果如图5所示，挑选的30个单克隆全部是敲除细胞，突变率为100％。

实施例3：IFNAR1敲除的MDBK细胞单克隆细胞表型验证

分别复苏野生型MDBK，以及编号为sgRNA2-10和sgRNA4-L的两株IFNAR1敲除的MDBK细胞系于T25细胞瓶，长满后进行细胞计数，分别取3.5×10

重复上述过程，分别接IBRV和BPIV-3验证其表型是否有差异。结果如图6显示，不论是BVDV，IBRV，还是BPIV-3,编号为sgRNA4-L的IFNAR1敲除的MDBK细胞系的病毒滴度均有显著增加。

实施例4：IFNAR1敲除的MDBK细胞转录水平验证

利用Trizol法分别对野生型MDBK和编号为sgRNA4-L的IFNAR1敲除的MDBK细胞系提取RNA，并利用反转录试剂盒(公司：南京诺维赞生物科技股份有限公司；货号：R223-01)将RNA逆转录为cDNA，进行相对定量PCR验证，IFNAR1转录水平表达相对定量PCR的引物序列如表10，按照表11配制绝对定量PCR反应体系。程序为95℃预变性5min，循环数为1；95℃变性10s，60℃退火30s，仪器默认融解曲线。结果如图7显示，与野生型MDBK 细胞相比，编号为sgRNA4-L的IFNAR1敲除的MDBK在转录水平上表达量显著下降。

表10相对定量PCR引物序列信息

表11相对定量PCR扩增反应体系

最终，将所获得的基因敲除细胞命名为牛肾细胞4-L，该细胞已于2022年4月1日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号CCTCC NO：C202287。本领域技术人员按照说明书具体实施例中的操作能够重现获得该细胞。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种I型干扰素受体基因敲除牛肾细胞系及其构建方法及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggcgcgacg accctgatgc 20

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caccggcatc agggtcgtcg cgccc 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaacgggcgc gacgaccctg atgcc 25