TaDRS1蛋白及其编码基因在调控小麦株高及粒形中的应用

摘要

本发明公开了TaDRS1蛋白及其编码基因在调控小麦株高及粒形中的应用。本发明还公开了TaDRS1蛋白或TaDRS1突变蛋白或其相关生物材料在如下M1)‑M12)中任一种中的应用：M1)调控小麦株高；M2)调控小麦籽粒大小和/或形状；M3)调控小麦穗部长度；M4)调控小麦小穗数；M5)调控小麦穗粒数；M6)调控小麦千粒重；M7)调控小麦产量；M8)调控小麦分蘖数；M9)调控小麦茎秆细胞和/或叶细胞的大小和/或形状和/或数目和/或排列方式；M10)调控小麦细胞中的微丝数量和/或微丝单体的聚合；M11)培育粒形和/或粒重改变的转基因小麦；M12)小麦育种。本发明对提高小麦产量及小麦育种具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及TaDRS1蛋白及其编码基因在调控小麦株高及粒形中的应用。

背景技术

小麦是重要的粮食作物，增加小麦产量、改良小麦品质、挖掘调控小麦产量和品质的调控因子并应用于生产一直是研究的重要方向。小麦的产量是由多种农艺性状综合决定的，主要通过增加小麦亩穗数、穗粒数、千粒重三个方面来增产，而小麦的株高和粒形直接影响小麦亩穗数、穗粒数和千粒重，进而影响小麦的产量。所以挖掘小麦株高和粒形的调控基因并阐明其作用机理，对小麦的增产具有重要意义。

20世纪60年代，“绿色革命”的矮化基因应用到小麦的半矮化育种中，增加了小麦抵抗外界恶劣环境的能力，使全球小麦产量大大增加，同时使小麦产量的稳定性也大大增加。在这个过程中，矮化基因的发现及其利用发挥了至关重要的作用。小麦的株高既受到矮化基因及遗传背景的调节，又受环境条件影响。目前，小麦当中已经挖掘到的Rht基因有25个，其中被利用的矮秆基因，有Rht1(Rht-B1b)、 Rht2(Rht-D1b)、和Rht8。目前Rht1及其等位或同源基因(包括Rht2，Rht3，Rht10， Rht11和Rht17)、Rht12、Rht18和Rht23被克隆。

小麦中控制株高的基因/QTL很多，但已经克隆的基因十分有限，且都集中在GA 调控途径中，这些基因存在遗传背景单一、矮秆基因单一化等问题，小麦株高调控网络的研究还较为薄弱，故继续挖掘新的调控小麦株高的基因并解析其作用机理意义重大。

小麦的产量由亩穗数、穗粒数、千粒重共同决定，其中千粒重遗传力最高，而小麦中粒形直接影响小麦的千粒重，为了更好的将小麦产量相关基因直接应用到小麦育种中，小麦粒形、粒重基因的克隆一直是人们研究的重点，因此，研究小麦粒形对提高小麦的产量具有重要意义。通过对模式植物水稻和拟南芥的研究，已经挖掘到很多调控粒形、粒重的基因，主要通过下面几个途径调控籽粒大小：IKU(HAIKU)通路(如 SHB1、IKU1、IKU2和MINI3)、泛素-蛋白酶体通路(DA1、GW2)、G(guanosine triphosphate)蛋白信号通路(GS3)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路(SMG 1)、植物激素(BRs、IAA、CTK等)和一些转录调节因子，它们通过调节种子细胞大小或数目调控种子的大小。目前小麦中通过同源克隆的方式已经找到一些调控小麦粒形、粒重的基因，如TaGS5、TaGW2等，最近研究者利用EMS突变体从四倍体小麦中克隆到一个控制粒重的基因KAT-2B，揭示了茉莉酸调控小麦粒重的分子机制。因此，克隆调控小麦粒形粒重的新基因并解析其作用机理对提高小麦产量有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供TaDRS1蛋白或TaDRS1突变蛋白或与其相关的生物材料的新用途。

本发明提供了TaDRS1蛋白或TaDRS1突变蛋白或与其相关的生物材料在如下M1) -M12)中任一种中的应用：

M1)调控小麦株高；

M2)调控小麦籽粒大小和/或形状；

M3)调控小麦穗部长度；

M4)调控小麦小穗数；

M5)调控小麦穗粒数；

M6)调控小麦千粒重；

M7)调控小麦产量；

M8)调控小麦分蘖数；

M9)调控小麦茎秆细胞和/或叶细胞的大小和/或形状和/或数目和/或排列方式；

M10)调控小麦细胞中的微丝数量和/或微丝单体的聚合；

M11)培育粒形和/或粒重改变的转基因小麦；

M12)小麦育种。

所述TaDRS1蛋白是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

b)在序列3所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列3所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；

所述TaDRS1突变蛋白是如下e)或f)或g)或h)的蛋白质：

e)氨基酸序列是序列6所示的蛋白质；

f)在序列6所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

g)将序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

h)与序列6所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；

所述生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：

A1)编码TaDRS1蛋白或TaDRS1突变蛋白的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。

进一步的，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：

1)其编码序列是序列1或序列3所示的cDNA分子；

2)其编码序列是序列2或序列4所示的基因组DNA分子；

3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码TaDRS1蛋白或TaDRS1突变蛋白的基因组DNA分子或cDNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的核苷酸序列杂交，且编码TaDRS1蛋白或TaDRS1突变蛋白的基因组DNA分子或cDNA分子。

本发明的第二个目的是提供如下x1或x2所示的物质在如下N1)-N10)中任一种中的应用：

N1)降低小麦株高；

N2)使小麦籽粒变小和/或变圆；

N3)减少小麦穗部长度；

N4)减少小麦小穗数；

N5)减少小麦穗粒数；

N6)降低小麦千粒重；

N7)降低小麦产量；

N8)减少小麦分蘖数；

N9)使小麦茎秆细胞和/或叶细胞的大小不均一和/或形状不规则和/或数目异常和 /或排列方式无序；

N10)减少小麦细胞中的微丝数量和/或微丝单体的聚合；

x1、抑制或降低小麦中TaDRS1蛋白活性或者含量的物质；

x2、抑制或降低小麦中TaDRS1蛋白编码核酸表达的物质或敲除小麦中TaDRS1蛋白编码核酸的物质或突变小麦中TaDRS1蛋白编码核酸的物质。

本发明的第三个目的是提供一种培育粒形和/或粒重改变的转基因小麦的方法。

本发明提供的培育粒形和/或粒重改变的转基因小麦的方法包括如下步骤：降低受体小麦中TaDRS1蛋白的表达量和/或活性，得到转基因小麦；与受体小麦相比，所述转基因小麦的株高降低和/或籽粒变小和/或变圆和/或穗部长度减少和/或小穗数减少和/或穗粒数减少和/或千粒重降低和/或产量降低和/或分蘖数减少。

进一步的，所述降低受体小麦中TaDRS1蛋白的表达量和/或活性的方法通过对所述受体小麦中TaDRS1蛋白的编码基因进行突变或敲除或抑制或沉默来实现。

更进一步的，所述TaDRS1蛋白的编码基因为序列1或序列2所示的DNA分子。

本发明的最后一个目的是提供一种培育粒形和/或粒重改变的转基因小麦的方法。

本发明提供的培育粒形和/或粒重改变的转基因小麦的方法包括如下步骤：提高受体小麦中TaDRS1突变蛋白的表达量和/或活性，得到转基因小麦；与受体小麦相比，所述转基因小麦的株高降低和/或籽粒变小和/或变圆和/或穗部长度减少和/或小穗数减少和/或穗粒数减少和/或千粒重降低和/或产量降低和/或分蘖数减少。

进一步的，所述提高受体小麦中TaDRS1突变蛋白的表达量和/或活性的方法为在受体小麦中过表达TaDRS1突变蛋白。

所述过表达的方法为将TaDRS1突变蛋白的编码基因导入受体小麦中。

更进一步的，所述TaDRS1突变蛋白的编码基因为序列4或序列5所示的DNA分子。

上述任一所述应用或方法中，所述小麦品种可为偃展1号或Fielder。

本发明经EMS(甲基磺酸乙酯)诱变，获得TaDRS1基因突变的drs1突变体，并对drs1突变体的表型、细胞学和农艺性状进行了分析和研究，进一步的，本发明又在野生型小麦中过表达TaDRS1突变基因，获得转TaDRS1突变基因小麦，并对转TaDRS1 突变基因小麦表型进行了分析。结果表明：与野生型小麦相比，drs1突变体株高降低、籽粒变小且变圆、穗部长度减少、小穗数减少、穗粒数减少、千粒重降低、产量降低、分蘖数减少，转TaDRS1突变基因小麦株高变矮、籽粒变小且变圆。以上结果证明： TaDRS1基因或TaDRS1突变基因可调控小麦的株高、籽粒性状、穗部性状和产量。本发明对改良小麦产量、培育高产量小麦品种具有重要价值。

附图说明

图1为野生型偃展1号以及突变体drs1表型观察。

图2为野生型偃展1号以及突变体drs1不同器官及生育期表型观察。A为灌浆期偃展 1号与突变体drs1植株；B为成熟后偃展1号与突变体drs1茎节；C为挑旗期偃展1号与突变体drs1旗叶；D为二叶期偃展1号与突变体drs1根部；E为开花期偃展1号与突变体drs1 颖壳；F为开花期偃展1号与突变体drs1雌雄蕊；G为成熟期偃展1号与突变体drs1籽粒。

图3为野生型偃展1号以及突变体drs1细胞结构分析。A为偃展1号穗下茎横切图；B为突变体drs1穗下茎横切图；C为偃展1号穗下茎纵切图；D为突变体drs1穗下茎纵切图。

图4为F

图5为TaDRS1基因的遗传作图。

图6为TaDRS1基因的图位克隆。

图7为野生型偃展1号与突变体drs1根部微丝染色。

图8为转基因植株表型鉴定。A为灌浆期转空载小麦和转TaDRS1突变基因小麦表型(左边一株转空载小麦，右边三株转TaDRS1突变基因小麦)，其中Bar＝5cm；B为转空载小麦和转TaDRS1突变基因小麦茎秆(左边为转空载小麦，右边为转TaDRS1突变基因小麦)，其中Bar＝3cm；C为转空载小麦和转TaDRS1突变基因小麦籽粒，其中 Bar＝1cm。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的小麦品种偃展1号(YZ1)记载于文献：王广勇，孙国华，冯会琴，“偃展1号”特征特性及其栽培技术，上海农业科技，2000年06期：85-98中；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的小麦品种Fielder(TriticumaestivumL.)记载于文献：YujiIshida,Masako Tsunashima,YukohHiei,Toshihiko Komari；Wheat (TriticumaestivumL.)transformation using immature embryos.；Methods in Molecular Biology,Volume1223,2015,pp 189-198；Editors:Kan Wang；Publisher: Springer,New York；doi:10.1007/978-1-4939-1695-5_15中；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pUbi-CAMBIA3301载体记载于文献：彭昊(2005)博士论文，利用T-DNA插入突变和RNA干扰技术研究水稻基因功能，中国农业科学院博士学位论文 P43-44.2005中；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的In-Fusion酶是宝日医生物技术有限公司(takara中国)的产品，产品目录号为639648。

下述实施例中的载体pEASY-Blunt Zero Cloning Kit是全式金生物科技有限公司的产品，产品目录号为CB501。

下述实施例中的KOD-FX-Neo是TOYOBO的产品，该试剂含KOD酶，产品目录号为KFX-101。

下述实施例中的中间载体TOPO

下述实施例中的大肠杆菌TOP10感受态细胞是北京庄盟生物技术有限公司的产品。

下述实施例中的Axyprep质粒提取试剂盒是Axygen公司的产品，产品目录号为AP-GX-50。

下述实施例中的培养基配方如下：

一筛培养基：一筛培养基由NB基本培养基、2,4-D、潮霉素、噻孢霉素和Phytgel 组成，pH5.8；各成分的浓度如下：2.0mg/l 2,4-D，50mg/l潮霉素，0.5g/l噻孢霉素，2.5g/1Phytgel。

二筛培养基：二筛培养基由NB基本培养基、脱落酸(ABA)、6-苄氨基嘌呤(BA)、α-萘乙酸(NAA)、潮霉素、噻孢霉素和phytgel组成，pH5.8；各成分的浓度如下：5.0 mg/l脱落酸(ABA)，2.0mg/1 6-苄氨基嘌呤(BA)，l.0mg/lα-萘乙酸(NAA)，50mg/l 潮霉素，0.5g/l噻孢霉素，2.5g/1phytgel，pH5.8。

三筛培养基：三筛培养基由MS培养基(含大量元素，微量元素和有机成分)、蔗糖和琼脂组成，pH5.8；各成分的浓度如下：30g/l蔗糖，15g/l琼脂。

实施例1、矮秆圆粒突变体drs1及TaDRS1基因的获得

野生型小麦偃展1号经EMS(甲基磺酸乙酯)诱变产生矮秆圆粒突变体dwarf andround seed 1，并将该突变体记作drs1。通过连续多年多点种植突变体drs1，发现突变体drs1遗传性状稳定，其整个生育期植株均明显矮于野生型，籽粒近圆形。通过配制不同的杂交组合，利用图位克隆的方式，同时结合660K芯片、RNA-Seq等方法克隆到该基因，并将其命名为TaDRS1。具体步骤如下：

一、矮秆圆粒突变体drs1的获得及鉴定

1、矮秆圆粒突变体drs1的获得

野生型小麦偃展1号经EMS(甲基磺酸乙酯)诱变产生矮秆圆粒突变体，并将该突变体命名为矮秆圆粒突变体dwarf and round seed 1(drs1)。具体诱变步骤如下：

1)配制溶液

pH7.0磷酸缓冲液配制：取60ml溶液A和40ml溶液B混合，即pH7.0磷酸缓冲液。溶液A：磷酸氢二钠9.456克，加水至1000ml；溶液B：磷酸二氢钾9.07克，加水至1000ml。

0.6％EMS处理液配制：取24ml甲基磺酸乙酯，溶于4L pH7.0磷酸缓冲液。

0.8％EMS处理液配制：取32ml甲基磺酸乙酯，溶于4L pH7.0磷酸缓冲液。

2)EMS诱变

采用的种子为河南省主栽小麦品种偃展1号。

A、取种子，用水室温浸泡12小时。

B、完成步骤1后，将种子分为三组，第一组的7200粒种子用0.6％EMS处理液室温浸泡16小时(3月8日19：00至3月9日11:00)，第二组的4300粒种子用0.8％ EMS处理液室温浸泡16小时(3月8日19：00至3月9日11:00)，第三组的700粒种子用pH7.0磷酸缓冲液室温浸泡16小时(3月8日19：00至3月9日11:00)。

C、完成步骤2后，取种子，用水洗涤16小时。

D、完成步骤3后，播种，并于播种30天后进行出苗率统计。

E、对第一代种子进行收获。

F、第二代种子播种出苗后，在田间发现一株植株明显矮化，叶片皱缩，拔节抽穗后明显矮于野生型，穗子变短，籽粒明显缩短呈近圆形。

2、矮秆圆粒突变体drs1的鉴定

1)表型鉴定

与野生型小麦偃展1号相比，突变体drs1的株高明显降低，只有野生型的 1/3-1/2，穗长也变短，小穗数略有减少，穗粒数减少，千粒重明显降低，并可以稳定遗传。

2)分子鉴定

以野生型小麦偃展1号和突变体drs1的总DNA为模板，用F1和R1为引物进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F：5’-TGGCGTCGGTCATCGTTA-3’；

R：5’-CGGAGCGTTTCGTGGAGA-3’。

PCR体系(20.0μl)：ddH

PCR程序：94℃5min；98℃30sec(变性)、62℃30sec(退火)、68℃1min (延伸)，32个循环；68℃5min。

PCR扩增得到长度为1978bp的PCR产物，测序分析结果表明：突变体drs1在序列2所示的TaDRS1基因组序列的第1164位存在一个碱基突变，以偃展1号总DNA为模板扩增的产物该位点为G，以突变体drs1总DNA为模板扩增的产物该位点为A。

二、矮秆圆粒突变体drs1的性状分析

1、野生型偃展1号以及突变体drs1的表型观察

对野生型小麦偃展1号以及突变体drs1的表型进行观察。

结果如图1所示(YZ1为野生型小麦偃展1号、YZ1×drs1为TaDRS1基因杂合突变体，drs1为TaDRS1基因纯合突变体)。从图中可以看出，和野生型小麦偃展1号 (WT)相比，突变体drs1的株高明显降低，小麦籽粒的粒型明显变小且呈近圆形。

2、野生型偃展1号以及突变体drs1不同器官及生育期的表型观察

对野生型偃展1号以及突变体drs1的不同器官及生育期(一叶期、二叶期、三叶期、拔节期、孕穗期、灌浆期)的表型进行观察。

结果如图2所示。从图中可以看出：突变体drs1的株高、穗形、粒形与野生型有明显差异，和野生型偃展1号相比，突变体drs1的株高明显降低，株高降低是由突变体drs1每个节间的缩短造成，突变体穗部变短、粒形小而圆主要由种子长度的缩短造成。

3、野生型偃展1号以及突变体drs1的细胞学分析

取开花期的野生型偃展1号以及突变体drs1穗下茎茎秆基部1cm左右，利用扫描电镜观察野生型偃展1号以及突变体drs1茎秆和叶片的细胞结构。具体步骤如下：将所取小麦样品在田间用蒸馏水多次冲洗，然后将样品修成3～4mm

结果如图3所示。和野生型偃展1号相比，突变体drs1茎和叶细胞的大小、形状、数目、排列均异常：野生型茎秆和叶片的细胞，可见明显的分层，每一层的细胞大小均一，形状规则，排列整齐；突变体茎细胞大小不均一，形状不规，排列杂乱无序；叶片细胞排列不平整，大小不均一且明显缩短。

4、野生型偃展1号以及突变体drs1的农艺性状分析

对野生型偃展1号与突变体drs1植株农艺性状进行调查。调查结果如表1所示。调查结果显示：突变体drs1与野生型偃展1号(YZ1)相比，除抽穗期没有明显差异，在粒形、株高、分蘖、穗长、小穗数、穗粒数、粒重等性状上均有显著差异，和野生型偃展1号相比，突变体drs1突变体的株高明显降低，只有野生型的1/3-1/2，穗长也变短，小穗数略有减少，穗粒数减少，千粒重明显降低。

表1、野生型YZ1与突变体drs1农艺性状调查与分析

三、TaDRS1的获得

1、遗传分析表明株高及粒形性状紧密连锁

配制F

2、TaDRS1定位在小麦1DS染色体上

利用小麦各条染色体的遗传图谱，每隔10cM选择一个SSR分子标记进行drs1和10th12亲本多态性的筛选，用有多态性的标记扩增圆粒混合池和长粒混合池，利用多态性的标记在1544株F

3、TaDRS1基因的克隆

矮杆圆粒突变体drs1与内乡188杂交与自交产生由17065个单株组成F

野生型偃展1号中的TaDRS1基因的cDNA序列如序列表中序列1所示(在中国春小麦参考基因组中序列号为TraesCS1D02G020000)，TaDRS1基因的基因组序列如序列表中序列2所示，TaDRS1基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列3所示。

突变体drs1中的TaDRS1基因的cDNA序列如序列表中序列4所示，TaDRS1基因的基因组序列如序列表中序列5所示，TaDRS1基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列6 所示。将突变体drs1中的TaDRS1基因命名为TaDRS1突变基因，突变体TaDRS1蛋白命名为TaDRS1突变蛋白。

与野生型偃展1号相比，突变体drs1为将野生型偃展1号中的序列1所示的 TaDRS1cDNA序列第959位由G突变为A后，且保持其他序列不变后得到的突变体。

4、TaDRS1蛋白的功能分析

对野生型偃展1号以及突变体drs1的根部进行微丝染色分析，具体步骤参照文献“VLN2 Regulates Plant Architecture by Affecting Microfilament Dynamics andPolar Auxin Transport in Rice(doi:10.1105/tpc.15.00581)”中的方法。

结果如图7所示。与野生型偃展1号相比，突变体drs1微丝明显减少。说明TaDRS1蛋白参与微丝单体的聚合，但由于该蛋白三维结构的改变导致聚合成的微丝网络的空间结构和功能也发生了改变，而微丝为细胞形状提供必要的机械支撑，微丝的变化导致细胞结构发生改变，最终引起小麦出现株高矮化，叶片皱缩，籽粒变圆等性状。

实施例2、转TaDRS1突变基因小麦的获得及TaDRS1突变基因功能分析

一、利用Infution技术构建TaDRS1基因过表达载体

用限制性内切酶PmlI和BamHI HF切开pUbi-CAMBIA3301载体，得到线性化的载体骨架片段；利用In-Fusion酶将带接头的目标片段连入载体骨架片段，所得到的重组载体即为TaDRS1突变基因过表达载体。具体步骤如下：

1、提取突变体drs1的总DNA。

2、以步骤1得到的总DNA为模板，用F1和R1为引物进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物。

F1：5’-AGAGTCTGACGGGATGAATA-3’；

R1：5’-GCAGTGCACACATAGTGGAGGGTTT-3’。

PCR体系(20.0μl)：KOD酶进行扩增，20.0ul扩增体系包括ddH

PCR程序：94℃5min；98℃30sec(变性)、62℃30sec(退火)、68℃3min30s (延伸)，32个循环；68℃5min。

3、连接转化

配制连接体系：步骤2得到的PCR扩增产物100ng、4ul ddH

将上述连接体系轻轻吹打混匀，室温下静止15min，置于冰上放置；向连接反应体系中加入100ul刚解冻的TOP10感受态细胞，放置冰上冰浴30min；42℃水浴锅中热击90s，放置冰上90s，加入500ul无抗性的LB复苏液；37℃，220rpm，复苏1h；均匀的涂在含有卡拉霉素或氨苄的抗性培养基上，待晾干后，在37℃培养箱中倒置过夜培养；挑选白色的单菌落置于TB培养基中，37℃，220rpm摇床上培养20h左右，可用于下一步质粒的提取。

4、质粒提取

用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒进行质粒的提取，参考下述步骤：

(1)取1.5ml在TB培养基中过夜培养的菌，用2.0ml的离心管在离心机上12000 g离心1min，然后弃上清；

(2)加入250μl Buffer S1，悬浮细菌沉淀，使其充分悬浮，直至管底无菌斑；

(3)向离心管中再加入250μl Buffer S2，温和的上下颠倒混匀4-6次，使细菌充分的裂解，此时的溶液应该是清澈透亮；

(4)加入350μl Buffer S3，温和的上下颠倒混匀4-6次，12000g离心10min；

(5)将离心的上清液转移到制备管中，12000g离心1min，弃废液；

(6)将制备管放回到离心管中，并加入450μl Buffer W1，12000g离心1min，弃废液；

(7)将制备管放回到离心管中，并加入500μl Buffer W2，12000g离心1min，弃废液，以同样的方法再洗涤一次；

(8)将制备管放置离心管中，12000g离心2min；

(9)将制备管放置在1.5ml新的离心管中，在制备管膜中央加入50μl ddH

5、Infution引物设计

设计并合成如下引物，并在上游引物(F1)和下游引物(R1)的5'端分别加入Inf1和Inf2接头序列(下划线所示序列为inf接头序列)。

Inf-F1：5’-

Inf-R1：5’-

6、加接头扩增目的片段

利用步骤5合成的引物扩增步骤4提取的质粒。

PCR体系(20.0μl)：KOD酶进行扩增，20.0ul扩增体系包括ddH

PCR程序：94℃5min；98℃30sec(变性)、62℃30sec(退火)、68℃3.5min (延伸)，35个循环；68℃5min。

7、质粒酶切

用限制性内切酶PmlI和BamHI HF切开pUbi-CAMBIA3301载体，得到线性化的载体骨架片段；利用In-Fusion酶将步骤6扩增的带接头的目标片段连入载体骨架片段，具体的方法为

8、重组质粒转化，同步骤3中转化方法。

9、将步骤8得到的入门克隆提取质粒进行双向测序验证，测序验证所用引物序列如下：

3301-Ubi-F：5’-CCTGCCTTCATACGCTATTT-3’；

TaDRS1-加测1：TCTTGTGCATCTTCGGTTTC；

TaDRS1-加测2：AGGGAATGATTTCTGTGGA；

TaDRS1-加测3：TCTGTTTTCTTCATTTGCTT；

TaDRS1-加测4：GCAAGTGAGTGCCTTTGA；

TaDRS1-加测5：CACCACCACCACCACCTT；

TaDRS1-加测6：TGTTATTTCCTGTCGGTTCA；

TaDRS1-加测7：CTGTAGGAAATGGCTGACG；

TaDRS1-加测8：GCCGTGCTTTCCCTCTAT；

TaDRS1-加测9：GTAAGGGACATCAAGGAGAA；

TaDRS1-加测10：CCCTTCATTCAAATCAACAT；

TaDRS1-加测11：TGCTTCAGTTACTTTGATGTT；

3301-Nos-R：5’-AAGAAACTTTATTGCCAAATGT-3’。

经测序验证正确的重组质粒命名为目标质粒。该目标质粒是将序列7所示的带接头的目标片段连入pUbi-CAMBIA3301载体后得到的载体。其中，序列7第3415-4976 位为TaDRS1突变基因编码区序列。

二、重组农杆菌的构建

将步骤一得到的目标质粒转化农杆菌EHA105，得到重组菌；将重组菌提质粒，送测序，结果证明重组菌构建正确。

同时将空载体pUbi-CAMBIA3301转化农杆菌EHA105，得到对照重组菌。

三、转TaDRS1突变基因小麦的获得

1、取小麦Fielder的种子去壳灭菌，平铺到愈伤诱导培养基诱导两周，挑出愈伤继代培养两周至长出直径2mm左右的愈伤颗粒。

2、将步骤二得到的重组菌用LB液体培养基(含利福平50mg/L+潮霉素50mg/L) 培养过夜使OD

3、取3mL步骤2获得的菌液4000rpm离心3分钟，去上清，将菌液重悬于20mL 含100μmol/L乙酰丁香酮的AMM液体培养基中。28℃，150rpm摇两个小时，得到目的菌液。

4、将步骤1得到的愈伤颗粒在步骤3获得的目的菌液中浸泡20分钟，再放到有一层滤纸的共培养基上。三天以后将愈伤用灭菌蒸馏水洗三次，每次20分钟左右，再用含500mg/L羧苄的灭菌水洗两次，每次30分钟，可重复多次直到洗液很清亮，将愈伤放在无菌滤纸上晾干，再将其放到一筛培养基上。两周后将愈伤转到二筛培养基上，再两周后转到三筛培养基，得到抗性愈伤。

5、将抗性愈伤转到分化培养基上，等待分化小苗。

6、将分化的小苗在1/2MS培养基上生根，然后转到温室和大田种植，得到T

同时将步骤二得到的对照重组菌进行上述实验得到对照组的T

四、转基因植物的分子鉴定

分别取实验组和对照组的T

提取实验组和对照组的T

F2：5’-ATGGCTGACGGTGAGGA-3’；

R2：5’-ACAGGAAGTGCTTCTGA-3’。

PCR鉴定为阳性的植株即为转TaDRS1突变基因植株。对于某一T

经过上述鉴定实验，得到T

对照组的T

五、转TaDRS1突变基因小麦的表型鉴定

为了明确TaDRS1突变基因对小麦发育过程中表型的影响，在北京分别种植T

结果如图8所示。结果显示：和转空载体小麦(DRS1/DRS1)相比，转TaDRS1突变基因小麦呈现植株矮化(株高为转空载体小麦的1/2)，籽粒变小且变圆。野生型小麦Fielder的表型与转空载体小麦(DRS1/DRS1)无显著性差异。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>TaDRS1蛋白及其编码基因在调控小麦株高及粒形中的应用

<160>7

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1562

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

atggctgacg gtgaggacat ccagcccctt gtctgcgaca atggaaccgg aatggtcaag 60

gtcagaaact ttcccctaaa ctgttacaca tgtcatctcc tgcatctgtt aacacatgtc 120

attttcttgt ggtttattat cgtctaggct ggtttcgctg gagatgatgc gccaagggct 180

gttttcccta gcatagttgg tcgccctcgg cacactggtg tcatggtagg gatggggcag 240

aaggatgcct atgtcggtga tgaggcgcag tccaagagag gtatcctcac cctcaagtac 300

cccatcgagc acggtatcgt gagcaactgg gatgacatgg agaaaatctg gcatcacacc 360

ttctacaatg agctccgtgt ggcacctgag gagcaccctg tgttgctcac tgaggctcct 420

ttgaacccaa aagccaacag agagaagatg acccagatta tgtttgagac tttcaatgtt 480

cctgccatgt acgtcgcaat tcaggccgtg ctttccctct atgcaagtgg tcgtactacc 540

ggtatggact gttccacctt ttagttcggt gatgctttgc ctagttaaac tacctttatg 600

gttctgttat gctgccctct tcaaccttcc attgtctagc tatgattatg cttaatgtgg 660

cttgtgtaat ttggatgtac tgcagtagtg attgctgctt atttcttact gccctattgc 720

attggggaaa acaattgcaa ctaatatatc gaaaagttgt tgtggctgaa aattttctct 780

gtttgcaggt atcgttctcg actctggtga tggtgtcagc cacactgtgc ccatttacga 840

aggatacgcg cttcctcatg ccattcttcg tttggatctt gctggccgtg atctcacgga 900

ctcccttatg aagatcctca ccgagagagg ttactccttc acaacctcag ccgagcggga 960

aattgtaagg gacatcaagg agaaacttgc gtatgttgcc cttgattatg aacaggagct 1020

ggagactgcc aagaacagct cctcagttga gaagagctac gagcttcctg atggtcaggt 1080

gatcacgatt ggcgcagaga ggttcaggtg ccctgaggtc ctcttccagc catccatgat 1140

cggcatggag tcttctggaa tccatgagac aacctacaac tccatcatga agtgtgacgt 1200

ggatatcagg aaggacttgt atggcaacat tgtgctcagt ggtggcacaa ctatgttccc 1260

aggtatcgct gaccgtatga gcaaggagat cacagccctt gctccgagca gcatgaagat 1320

caaggtcgtc gctccacctg agaggaagta cagtgtctgg atcggagggt ccatcttagc 1380

ctcactcagc actttccaac aggtacacct cttgttcagc tttaccttct gtaactcatc 1440

ttacccttca ttcaaatcaa catctgaatc atattatgtg tgactggttg taccagatgt 1500

ggatatccaa ggatgagtac gacgagtctg gcccggcgat cgtccacagg aagtgcttct 1560

ga 1562

<210>2

<211>2068

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>2

gaaaagggta ggaatttctg cttgtggctc cgcgtcagca ggccgacagc agtgtgtgtg 60

cgtctgcgag cgagatccag tccagagcgg cagcagttat agccagcgcc tcccccacca 120

ccaccaccac cttccccctc ctcctcctcc gatcgcatct cctctcctcc gtcctcccct 180

cccgtcgccc gtctcagcct cctccgagct cgctcgctcg ctcgctcgcc acggtaacca 240

acctctctct ctctctcttt ctcttggtac cttgctggat cttgctgtgc gcccgcctcc 300

ggccggcccg agatccggcc ccgcggcgcc ggatctgggc gtgccgggcg gagatccggc 360

gggaactcgg gcgcttcacc gtcttcttgg ggcccgcctt cttggagttg ctgccgcttc 420

ttggctggac ctccaccggc tccgcccgcg ctggcccccg cgtagatccg cggcggctgg 480

gcgtgttgct gcttgctggc cggcgactgc tcccggtttc cgcagacatt ctgtaggaaa 540

tggctgacgg tgaggacatc cagccccttg tctgcgacaa tggaaccgga atggtcaagg 600

ctggtttcgc tggagatgat gcgccaaggg ctgttttccc tagcatagtt ggtcgccctc 660

ggcacactgg tgtcatggta gggatggggc agaaggatgc ctatgtcggt gatgaggcgc 720

agtccaagag aggtatcctc accctcaagt accccatcga gcacggtatc gtgagcaact 780

gggatgacat ggagaaaatc tggcatcaca ccttctacaa tgagctccgt gtggcacctg 840

aggagcaccc tgtgttgctc actgaggctc ctttgaaccc aaaagccaac agagagaaga 900

tgacccagat tatgtttgag actttcaatg ttcctgccat gtacgtcgca attcaggccg 960

tgctttccct ctatgcaagt ggtcgtacta ccggtatcgt tctcgactct ggtgatggtg 1020

tcagccacac tgtgcccatt tacgaaggat acgcgcttcc tcatgccatt cttcgtttgg 1080

atcttgctgg ccgtgatctc acggactccc ttatgaagat cctcaccgag agaggttact 1140

ccttcacaac ctcagccgag cgggaaattg taagggacat caaggagaaa cttgcgtatg 1200

ttgcccttga ttatgaacag gagctggaga ctgccaagaa cagctcctca gttgagaaga 1260

gctacgagct tcctgatggt caggtgatca cgattggcgc agagaggttc aggtgccctg 1320

aggtcctctt ccagccatcc atgatcggca tggagtcttc tggaatccat gagacaacct 1380

acaactccat catgaagtgt gacgtggata tcaggaagga cttgtatggc aacattgtgc 1440

tcagtggtgg cacaactatg ttcccaggta tcgctgaccg tatgagcaag gagatcacag 1500

cccttgctcc gagcagcatg aagatcaagg tcgtcgctcc acctgagagg aagtacagtg 1560

tctggatcgg agggtccatc ttagcctcac tcagcacttt ccaacagatg tggatatcca 1620

aggatgagta cgacgagtct ggcccggcga tcgtccacag gaagtgcttc tgatctccac 1680

gaaacgctcc gccgccgtta tcatctagtc tcgggttatg tttggttcat tcttctagaa 1740

atgtattgcg tatttgcaag ctatgttttt tttccagacg tgacgtgagt actctcggga 1800

tatgccacct atatacgtgg cggctccatg gtgcaagtgc aagtacacta tatctatgtt 1860

tgtgcattgt cacagtgtgt ttgtgagatc agttgtcaaa cttgggttgg cttgatttgt 1920

tgttggagtt gtctgtaata gctcatggtt tttgctatgt atttttatat cttattattg 1980

ctctaagggg agaatcatgg taaattatgg atttttttaa gctctcaaag cgttatacag 2040

tggtcatcca tggaccattt tccatgtg 2068

<210>3

<211>377

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>3

Met Ala Asp Gly Glu Asp Ile Gln Pro Leu Val Cys Asp Asn Gly Thr

1 5 10 15

Gly Met Val Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val

20 25 30

Phe Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Thr Gly Val Met Val Gly

35 40 45

Met Gly Gln Lys Asp Ala Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gln Ser Lys Arg

50 55 60

Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile Val Ser Asn

65 70 75 80

Trp Asp Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu

85 90 95

Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu

100 105 110

Asn Pro Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr Gln Ile Met Phe Glu Thr

115 120 125

Phe Asn Val Pro Ala Met Tyr Val Ala Ile Gln Ala Val Leu Ser Leu

130 135 140

Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly

145 150 155 160

Val Ser His Thr Val Pro Ile Tyr Glu Gly Tyr Ala Leu Pro His Ala

165 170 175

Ile Leu Arg Leu Asp Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Ser Leu Met

180 185 190

Lys Ile Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Ser Ala Glu Arg

195 200 205

Glu Ile Val Arg Asp Ile Lys Glu Lys Leu Ala Tyr Val Ala Leu Asp

210 215 220

Tyr Glu Gln Glu Leu Glu Thr Ala Lys Asn Ser Ser Ser Val Glu Lys

225 230 235 240

Ser Tyr Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly Ala Glu Arg

245 250 255

Phe Arg Cys Pro Glu Val Leu Phe Gln Pro Ser Met Ile Gly Met Glu

260 265 270

Ser Ser Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp

275 280 285

Val Asp Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Gly Asn Ile Val Leu Ser Gly Gly

290 295 300

Thr Thr Met Phe Pro Gly Ile Ala Asp Arg Met Ser Lys Glu Ile Thr

305 310 315 320

Ala Leu Ala Pro Ser Ser Met Lys Ile Lys Val Val Ala Pro Pro Glu

325 330 335

Arg Lys Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser

340 345 350

Thr Phe Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Asp Glu Tyr Asp Glu Ser Gly

355 360 365

Pro Ala Ile Val His Arg Lys Cys Phe

370 375

<210>4

<211>1562

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>4

atggctgacg gtgaggacat ccagcccctt gtctgcgaca atggaaccgg aatggtcaag 60

gtcagaaact ttcccctaaa ctgttacaca tgtcatctcc tgcatctgtt aacacatgtc 120

attttcttgt ggtttattat cgtctaggct ggtttcgctg gagatgatgc gccaagggct 180

gttttcccta gcatagttgg tcgccctcgg cacactggtg tcatggtagg gatggggcag 240

aaggatgcct atgtcggtga tgaggcgcag tccaagagag gtatcctcac cctcaagtac 300

cccatcgagc acggtatcgt gagcaactgg gatgacatgg agaaaatctg gcatcacacc 360

ttctacaatg agctccgtgt ggcacctgag gagcaccctg tgttgctcac tgaggctcct 420

ttgaacccaa aagccaacag agagaagatg acccagatta tgtttgagac tttcaatgtt 480

cctgccatgt acgtcgcaat tcaggccgtg ctttccctct atgcaagtgg tcgtactacc 540

ggtatggact gttccacctt ttagttcggt gatgctttgc ctagttaaac tacctttatg 600

gttctgttat gctgccctct tcaaccttcc attgtctagc tatgattatg cttaatgtgg 660

cttgtgtaat ttggatgtac tgcagtagtg attgctgctt atttcttact gccctattgc 720

attggggaaa acaattgcaa ctaatatatc gaaaagttgt tgtggctgaa aattttctct 780

gtttgcaggt atcgttctcg actctggtga tggtgtcagc cacactgtgc ccatttacga 840

aggatacgcg cttcctcatg ccattcttcg tttggatctt gctggccgtg atctcacgga 900

ctcccttatg aagatcctca ccgagagagg ttactccttc acaacctcag ccgagcggaa 960

aattgtaagg gacatcaagg agaaacttgc gtatgttgcc cttgattatg aacaggagct 1020

ggagactgcc aagaacagct cctcagttga gaagagctac gagcttcctg atggtcaggt 1080

gatcacgatt ggcgcagaga ggttcaggtg ccctgaggtc ctcttccagc catccatgat 1140

cggcatggag tcttctggaa tccatgagac aacctacaac tccatcatga agtgtgacgt 1200

ggatatcagg aaggacttgt atggcaacat tgtgctcagt ggtggcacaa ctatgttccc 1260

aggtatcgct gaccgtatga gcaaggagat cacagccctt gctccgagca gcatgaagat 1320

caaggtcgtc gctccacctg agaggaagta cagtgtctgg atcggagggt ccatcttagc 1380

ctcactcagc actttccaac aggtacacct cttgttcagc tttaccttct gtaactcatc 1440

ttacccttca ttcaaatcaa catctgaatc atattatgtg tgactggttg taccagatgt 1500

ggatatccaa ggatgagtac gacgagtctg gcccggcgat cgtccacagg aagtgcttct 1560

ga 1562

<210>5

<211>2068

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>5

gaaaagggta ggaatttctg cttgtggctc cgcgtcagca ggccgacagc agtgtgtgtg 60

cgtctgcgag cgagatccag tccagagcgg cagcagttat agccagcgcc tcccccacca 120

ccaccaccac cttccccctc ctcctcctcc gatcgcatct cctctcctcc gtcctcccct 180

cccgtcgccc gtctcagcct cctccgagct cgctcgctcg ctcgctcgcc acggtaacca 240

acctctctct ctctctcttt ctcttggtac cttgctggat cttgctgtgc gcccgcctcc 300

ggccggcccg agatccggcc ccgcggcgcc ggatctgggc gtgccgggcg gagatccggc 360

gggaactcgg gcgcttcacc gtcttcttgg ggcccgcctt cttggagttg ctgccgcttc 420

ttggctggac ctccaccggc tccgcccgcg ctggcccccg cgtagatccg cggcggctgg 480

gcgtgttgct gcttgctggc cggcgactgc tcccggtttc cgcagacatt ctgtaggaaa 540

tggctgacgg tgaggacatc cagccccttg tctgcgacaa tggaaccgga atggtcaagg 600

ctggtttcgc tggagatgat gcgccaaggg ctgttttccc tagcatagtt ggtcgccctc 660

ggcacactgg tgtcatggta gggatggggc agaaggatgc ctatgtcggt gatgaggcgc 720

agtccaagag aggtatcctc accctcaagt accccatcga gcacggtatc gtgagcaact 780

gggatgacat ggagaaaatc tggcatcaca ccttctacaa tgagctccgt gtggcacctg 840

aggagcaccc tgtgttgctc actgaggctc ctttgaaccc aaaagccaac agagagaaga 900

tgacccagat tatgtttgag actttcaatg ttcctgccat gtacgtcgca attcaggccg 960

tgctttccct ctatgcaagt ggtcgtacta ccggtatcgt tctcgactct ggtgatggtg 1020

tcagccacac tgtgcccatt tacgaaggat acgcgcttcc tcatgccatt cttcgtttgg 1080

atcttgctgg ccgtgatctc acggactccc ttatgaagat cctcaccgag agaggttact 1140

ccttcacaac ctcagccgag cggaaaattg taagggacat caaggagaaa cttgcgtatg 1200

ttgcccttga ttatgaacag gagctggaga ctgccaagaa cagctcctca gttgagaaga 1260

gctacgagct tcctgatggt caggtgatca cgattggcgc agagaggttc aggtgccctg 1320

aggtcctctt ccagccatcc atgatcggca tggagtcttc tggaatccat gagacaacct 1380

acaactccat catgaagtgt gacgtggata tcaggaagga cttgtatggc aacattgtgc 1440

tcagtggtgg cacaactatg ttcccaggta tcgctgaccg tatgagcaag gagatcacag 1500

cccttgctcc gagcagcatg aagatcaagg tcgtcgctcc acctgagagg aagtacagtg 1560

tctggatcgg agggtccatc ttagcctcac tcagcacttt ccaacagatg tggatatcca 1620

aggatgagta cgacgagtct ggcccggcga tcgtccacag gaagtgcttc tgatctccac 1680

gaaacgctcc gccgccgtta tcatctagtc tcgggttatg tttggttcat tcttctagaa 1740

atgtattgcg tatttgcaag ctatgttttt tttccagacg tgacgtgagt actctcggga 1800

tatgccacct atatacgtgg cggctccatg gtgcaagtgc aagtacacta tatctatgtt 1860

tgtgcattgt cacagtgtgt ttgtgagatc agttgtcaaa cttgggttgg cttgatttgt 1920

tgttggagtt gtctgtaata gctcatggtt tttgctatgt atttttatat cttattattg 1980

ctctaagggg agaatcatgg taaattatgg atttttttaa gctctcaaag cgttatacag 2040

tggtcatcca tggaccattt tccatgtg 2068

<210>6

<211>377

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>6

Met Ala Asp Gly Glu Asp Ile Gln Pro Leu Val Cys Asp Asn Gly Thr

1 5 10 15

Gly Met Val Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val

20 25 30

Phe Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Thr Gly Val Met Val Gly

35 40 45

Met Gly Gln Lys Asp Ala Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gln Ser Lys Arg

50 55 60

Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile Val Ser Asn

65 70 75 80

Trp Asp Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu

85 90 95

Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu

100 105 110

Asn Pro Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr Gln Ile Met Phe Glu Thr

115 120 125

Phe Asn Val Pro Ala Met Tyr Val Ala Ile Gln Ala Val Leu Ser Leu

130 135 140

Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly

145 150 155 160

Val Ser His Thr Val Pro Ile Tyr Glu Gly Tyr Ala Leu Pro His Ala

165 170 175

Ile Leu Arg Leu Asp Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Ser Leu Met

180 185 190

Lys Ile Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Ser Ala Glu Arg

195 200 205

Lys Ile Val Arg Asp Ile Lys Glu Lys Leu Ala Tyr Val Ala Leu Asp

210 215 220

Tyr Glu Gln Glu Leu Glu Thr Ala Lys Asn Ser Ser Ser Val Glu Lys

225 230 235 240

Ser Tyr Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly Ala Glu Arg

245 250 255

Phe Arg Cys Pro Glu Val Leu Phe Gln Pro Ser Met Ile Gly Met Glu

260 265 270

Ser Ser Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp

275 280 285

Val Asp Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Gly Asn Ile Val Leu Ser Gly Gly

290 295 300

Thr Thr Met Phe Pro Gly Ile Ala Asp Arg Met Ser Lys Glu Ile Thr

305 310 315 320

Ala Leu Ala Pro Ser Ser Met Lys Ile Lys Val Val Ala Pro Pro Glu

325 330 335

Arg Lys Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser

340 345 350

Thr Phe Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Asp Glu Tyr Asp Glu Ser Gly

355 360 365

Pro Ala Ile Val His Arg Lys Cys Phe

370 375

<210>7

<211>5859

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>7

agagtctgac gggatgaata ctttgacgct gagagttaaa ccggagcatg acctcgttgg 60

aattgaactg ctgaatgttc catttgagga gttcttctag tttttcaatc aaaaggccct 120

cgataaatca acgatcactt gctactgtct gtaagtagta ctacttctgt cattaagtct 180

ctctatatag gtcagctctt tcattgcatg tatttataat tatcctcact atattatgca 240

gattgaagat cgccgaattg aagaaaagac aaatcggtga tattgggttc attaacacaa 300

atctcataga tgcatatacg gttgaaaaac atgccaaaga agccgaggcc aacttgctac 360

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tgttactgtc ttgtgcatct tcggtttccc ttattagtcc aggttatggt aatgtaattg 480

atgacttatg catgcatgcg cagcttccac tatattctcc tagagattaa gcttgagcag 540

ggagtactaa ccgtcttaga ctcgagatga aaagatcccc aggactatgc gaacatgact 600

caaatgctcg agaagtaagt taaatcgatc attatccacc atatcagcaa ctttgttcat 660

ttcctgatat caagtaattg ttttctttgt ctggcagggt ttggagaaaa ttcaccacaa 720

aagctccggg actgccgaag aagctgcaat ttagacaccc gaaagtaagt actatagtag 780

catgttccgc acatctccta gtgattcaag cgctagtttc atcaatacca tttagcatgc 840

ttgcttatca gttagattga cctctatttc ttgtaaagtg gttgtggcag gaacaaggga 900

atgatttctg tggatactac gtttgcgagt ctatccgccc cacgacctgt gagcggggct 960

actctgacga acaatatgaa gtgcgtaagc aataatattc acaattttat tttattacca 1020

tcatttgtgt cgagtttcat ttattcatat atatatgtat tgaccccctt cttcaaatta 1080

gatctttcgg atgcgtgatg aactcctagc accagatcgt atgcgagcaa ttcaagagga 1140

attggcggca ttcttccttg accacgtgat cgctgaaaac ggagaatact atgtggaccc 1200

tgtgttctta caatttaatt aggagattat attgtaagag ataattatgg tatatatgta 1260

gccggtagtg tcagatagat atacgagaac ttgttgttcg accaatctct cggagaagga 1320

gaggtggtca atatcacttc tctctgtatg catatgttca tgacgatctt ctgttttctt 1380

catttgctta ctagctagcg tgtctagtcc tctctatacg tatatagtac gtagcgtcga 1440

ccaaacacgg agataagaga ggacacttct ctctattaat tagctagcta acacaatata 1500

tgaaacacct aaattaacct cccaaaaccc ccaacctccc cccctttaaa aaaaaacaaa 1560

aaccccagcc cctgaaatgc tgacgcgtgg atggcaaaag gccctgccta ttggtcccgg 1620

ttggtgtcac caaccgggac caaaggcccc ctacctgggc tggcagcagc gaccacgtga 1680

aggaccttct gtcccggttc gtgtaagaac cgggactaaa gggttagggc gttagtaacg 1740

accctttagt cccggttcga aaaccgggac aaaaggactt taccaaccga ggtaaagccc 1800

ctttttctac tagtgcatta agaatgtccc cctccccttg cttggaatct gaagccacca 1860

gaaaattctc caggtgtagg tcttacacca acgataaggc ctccctgcaa gcctgcaagt 1920

gagtgccttt gacgttgccg ggtcatggat gccgtagata agcatgtagg tttccctggt 1980

cgtcgcgaca gaccaccgct gccgtaccac ctctggatgc cctcgacaca cctgcatcca 2040

cgtgtatttt cttttgaggg tactgataca tcaatttttt tcttctccca tgagcattct 2100

gacttgacaa aaaaagaagg gctttcctat gtgcagtcca tcgttgggcc gggctggatg 2160

cacgcgggct gttccttggc gagcccagtc cagtccagtc cagtgtgggg agagggagtg 2220

cgcgttgaaa tttcaaagaa tggatggatg gggagaggaa aagggtagga atttctgctt 2280

gtggctccgc gtcagcaggc cgacagcagt gtgtgtgcgt ctgcgagcga gatccagtcc 2340

agagcggcag cagttatagc cagcgcctcc cccaccacca ccaccacctt ccccctcctc 2400

ctcctccgat cgcatctcct ctcctccgtc ctcccctccc gtcgcccgtc tcagcctcct 2460

ccgagctcgc tcgctcgctc gctcgccacg gtaaccaacc tctctctctc tctctttctc 2520

ttggtacctt gctggatctt gctgtgcgcc cgcctccggc cggcccgaga tccggccccg 2580

cggcgccgga tctgggcgtg ccgggcggag atccggcggg aactcgggcg cttcaccgtc 2640

ttcttggggc ccgccttctt ggagttgctg ccgcttcttg gctggacctc caccggctcc 2700

gcccgcgctg gcccccgcgt agatccgcgg cggctgggcg tgttgctgct tgctggccgg 2760

cgactgctcc cggtttccgc aggcaatcac ttgcgtgcca tccagcgcgt ccattcccct 2820

gctgtgtttg tccggccatt gcgcctccac gctagctcct aggcatgcag tttgttattt 2880

cctgtcggtt cattgaggat cacttccctt gtgcaaaaac cagcagagag gaaaactatg 2940

cttttataag tattttcatt tcaatttcgt aatagtcctt gtcaagctgg cctgagctga 3000

tgtggtgctc acgccatggc gtcggtcatc gttatgtacc tttgtgtgaa atcctagttt 3060

tacgccatgc ttcaagtcag caccaccaac catcacacgt ttattgtttt gttataaaaa 3120

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ccgtgaaaaa ataaaagttg caacaagcca tgtgtttctc tgtattaggg tgacagtatt 3360

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cctagcatag ttggtcgccc tcggcacact ggtgtcatgg tagggatggg gcagaaggat 3660

gcctatgtcg gtgatgaggc gcagtccaag agaggtatcc tcaccctcaa gtaccccatc 3720

gagcacggta tcgtgagcaa ctgggatgac atggagaaaa tctggcatca caccttctac 3780

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taatttggat gtactgcagt agtgattgct gcttatttct tactgcccta ttgcattggg 4140

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cagtggtcat ccatggacca ttttccatgt gattatcaac tgttcatcac tggttcataa 5400

ggcctttaat ctgaaagtgc ttcagttact ttgatgttca ggttcagctg cctgatgtta 5460

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gagtatttga atagtaagcc aaaagcagga catgtgcatt acaaatgtat ttcatcaaag 5700

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accttgaaat aatttgagtt ctcgttcaaa atttgtatat attacatgaa tgcttcctac 5820

tagttcaaag caacaaaccc tccactatgt gtgcactgc 5859