一种湖羊LPL基因SNP的检测方法及其在肉质性状早期筛选中的应用

摘要

本发明公开了一种湖羊LPL基因SNP的检测方法及其在肉质性状早期筛选中的应用。本发明通过湖羊组织DNA的提取、iMLDR技术进行分型、等位基因频率与基因型频率计算，以及将湖羊背最长肌脂肪酸百分比与LPL基因突变位点g.23413C>T进行关联分析，揭示了该位点的多态性及所存在的与有益脂肪酸百分比显著相关的分子标记，为通过标记辅助选择选育优异肉品质的绵羊新品系提供依据。

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学检测及育种领域，涉及利用DNA混池测序检测出的湖羊LPL基因单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点，并结合荧光多重酶连接反应(Improved multiplex ligation detection reaction,iMLDR)技术对该位点进行基因分型及利用分型结果与脂肪酸百分比进行关联性分析。

背景技术

分子标记被广泛应用于动物育种中，例如通过标记辅助选择对动物进行选育。SNP广泛存在于基因组中，大约每300bp的序列长度就会出现一个SNP。SNP检测技术用于扫描新的多态性位点，并确定目标序列中已知多态性的等位基因。iMLDR技术是一种新型高通量SNP基因分型技术，该技术具有分型准确率高、成本低、速度快、可同时检测多个SNP位点等优势。

肉类是人们日常生活中食用的基本食物之一，它含有大量容易消化的蛋白质、维生素、微量元素以及脂肪，是人体内许多代谢过程正常运作所必需的。肉品质是一种复杂的性状，可以通过不同的属性来定义，其中脂肪酸是影响肉品质的重要属性之一，其含量和组成决定了脂肪的质地特性以及肌肉的氧化稳定性，影响肉的风味、嫩度、保质期、营养价值等，同时脂肪酸是机体的主要能量来源。脂肪酸的含量和组成受品种、年龄、性别、饲养方式、饲料种类等的影响。脂肪酸按照碳链饱和程度分为饱和脂肪酸(Saturated fattyacid,SFA)、单不饱和脂肪酸(Monounsaturated fatty acids,MUFA)、多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFA)。SFA中的C6、C8、C10可致使羊肉产生膻味，且SFA能增加人体患心血管疾病的风险；MUFA与肉香味和整体可接受程度呈正相关关系，MUFA还具有降低血糖、血脂、胆固醇水平等功能；PUFA中的n-6PUFA和n-3PUFA是人体的必须脂肪酸，且人体自身不能合成，只能从食物中获取，PUFA对炎症、高血压、缺血性中风、外周动脉疾病和动脉粥样硬化具有有利影响。

脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase,LPL)是脂肪酸分解过程中的关键酶，LPL介导的脂蛋白脂解使脂肪酸释放，并通过血液运输到心脏，是心脏所需脂肪酸的关键来源。Wei等研究发现，LPL基因表达量与杜洛克×山猪背最长肌中的C16:1、C18:1n9c及MUFA呈显著正相关，与C16:0、C18:0及SFA呈显著负相关。Oh等对LPL基因中的SNPs与韩国牛背最长肌组织中脂肪酸百分比之间的相关性进行研究，结果发现LPL基因c.322G>A中AA基因型个体的C18:1n9c、C18:3n3、MUFA百分比显著高于GG基因型，AA基因型个体中C14:0、C16:0、SFA的百分比显著低于GG基因型；c.329A>T中AA基因型个体的C18:1n9c、C18:3n3、MUFA的百分比显著高于TT基因型，C16:0、SFA的百分比显著低于TT基因型，c.322G>A和c.329A>T均对C18:1n9c、SFA和MUFA具有累加效应。除了存在可作为提高杜洛克×山猪、韩国牛肉质量的有效分子标记，高鸿蒙等研究发现，LPL基因中的A384T位点对乌珠穆沁羊背最长肌中的C16:0、C18:0、C14:1具有显著影响，其中TT基因型的C16:0、C18:0和C14:1均显著低于TA和AA基因型。

尽管LPL基因是调节脂肪酸组成的功能候选基因，但目前尚无有关LPL基因SNP与湖羊脂肪酸表型的相关性研究，且对绵羊有益脂肪酸表型缺乏有效的分子标记。

发明内容

本发明的目的在于提供一种湖羊LPL基因SNP的检测方法及其在肉质性状早期筛选中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种检测湖羊LPL基因单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：

以提取的湖羊基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物包含的单核苷酸多态性位点进行基因分型，所述单核苷酸多态性位点为位于LPL基因上的突变位点g.23413C>T(参考序列为NC_056055.1)。

优选的，所述PCR扩增的引物为：

上游引物：5’-TGTTCTGAACTTCTGGTTGACT-3’

下游引物：5’-CCAATGGCAAGAGGAGAGTAAT-3’。

优选的，所述PCR扩增采用的反应体系包括30ng/μL模板1μL以及10pmol/μL上游引物和10pmol/μL下游引物各0.5μL；PCR扩增采用的反应程序为：95℃预变性4min；94℃变性30s，63.8℃退火60s，72℃延伸90s，共34个循环；72℃再延伸9min。

优选的，所述基因分型采用iMLDR技术。

优选的，所述基因组DNA采用酚-氯仿法提取自睾丸组织。

优选的，所述突变位点是通过DNA混池测序确定的。

一种检测湖羊LPL基因单核苷酸多态性的试剂盒，该试剂盒包括用于扩增LPL基因单核苷酸多态性位点的引物(例如上述上游引物和下游引物)，所述单核苷酸多态性位点为位于LPL基因上的突变位点g.23413C>T(参考序列为NC_056055.1)。

上述检测湖羊LPL基因单核苷酸多态性的方法在绵羊标记辅助选择育种中的应用。

绵羊LPL基因突变位点g.23413C>T(参考序列为NC_056055.1)及其检测试剂在绵羊标记辅助选择育种中的应用。

优选的，具有TT基因型的个体在肉质性状上较优(例如TT基因型的个体C18:2n6c、n-6PUFA、C18:3n6、PUFA的百分比，及P/S均高于CT、CC基因型的个体)。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过对湖羊LPL基因上一个新的SNP位点(位于基因突变位点g.23413C>T)进行基因分型，以及根据关联性分析所揭示的该位点与脂肪酸百分比的显著相关性，发现了LPL基因上这一多态性位点中可以作为影响脂肪酸组成及含量的分子标记(SNP标记)，为提高绵羊(例如湖羊)肉品质(例如与营养价值等相关的有益脂肪酸)的分子育种和肉质改良提供重要的科学依据，从而加快优异肉品质的绵羊新品系的选育。

进一步的，本发明通过PCR高温(94℃)变性、低温(63.8℃)退火，使提取自湖羊睾丸组织的基因组DNA双链解开，同时有利于延伸；而采取34次循环，能扩增出足够数量的DNA，以便用于DNA混池测序。

附图说明

图1为湖羊LPL基因突变位点g.23413C>T附近区域的PCR扩增产物的电泳图。

图2为湖羊LPL基因突变位点g.23413C>T的测序峰图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明的保护范围的限制。

1、利用DNA混池测序检测获得湖羊LPL基因SNP位点

S1样品选取

于2018年8月至2021年8月共采集来自民勤德福农业科技有限公司(甘肃省武威市民勤县)相同饲养条件下的1029只(5批次)6月龄健康湖羊的睾丸组织及背最长肌组织，并测定背最长肌组织的脂肪酸组成及含量。

S2构建DNA混池

a)使用酚-氯仿法提取1029只湖羊个体睾丸组织基因组DNA，具体步骤如下：

Ⅰ)取10mg研磨好的睾丸组织粉末于2mL离心管中；

Ⅱ)分别加入750μL组织裂解液和10μL的10mg/mL蛋白酶K，颠倒混匀，在55℃水浴锅中孵育15个小时；

Ⅲ)孵育完成后冷却至室温，加入800μL的Tris饱和酚，冰上摇动15min，12000r/min离心10min，转移800μL上清液至新的2mL离心管中；

Ⅳ)分别加入500μL的Tris饱和酚和500μL的氯仿，冰上摇动15min，12000r/min离心10min，将上清液转移至新的2mL离心管中；

Ⅴ)加入1mL的氯仿，冰上摇动15min，12000r/min离心10min，将上清液转移至新的1.5mL离心管中；

Ⅵ)加入1mL在-20℃冰箱预冷的无水乙醇，轻轻晃动至沉淀析出，在-20℃冰箱放置30min，12000r/min离心10min，弃上清；

Ⅶ)加入1mL的70％乙醇，轻轻晃动10min，12000r/min离心10min，弃上清；

Ⅷ)重复操作步骤Ⅶ，将离心管打开，放在超净工作台干燥至乙醇挥发完，加入200μL的灭菌水，在4℃冰箱过夜溶解DNA。

Ⅸ)通过

b)1029个DNA样本经质检合格后，随机选择165个DNA样本，统一稀释至30ng/μL，每15个DNA样本构建1个混池，共构建11个DNA混池。

S3 PCR扩增

根据NCBI公布的绵羊LPL基因组序列(NC_056055.1)作为参考，利用Primer-Blast在线软件设计能够扩增LPL基因外显子10区域及其两侧部分内含子区域的PCR特异性引物，引物序列如下：

上游引物LPL-F：5’-TGTTCTGAACTTCTGGTTGACT-3’

下游引物LPL-R：5’-CCAATGGCAAGAGGAGAGTAAT-3’

反应体系(25μL)：12.5μL Mix、10.5μL ddH

反应程序：95℃预变性4min；94℃变性30s，63.8℃退火60s，72℃延伸90s，共34个循环；72℃再延伸9min。

将PCR产物进行电泳，结果如图1所示，可见除Marker泳道，其右侧各DNA混池泳道均扩增出目标片段(大小为624bp)。

S4 PCR产物测序与突变位点基因分型

将S3中由DNA混池扩增出的PCR产物进行双向测序，根据如图2所示的测序峰图发现了一个位于LPL基因上的突变位点g.23413C>T(参考序列为NC_056055.1)；

将质量检测合格后的1029个DNA样本(统一稀释至30ng/μL)，分装至200μL的离心管中，并提供待定SNP位点(即g.23413C>T)在基因组序列上的位置信息，由公司用iMLDR技术对1029个DNA样本进行基因分型。

S5 LPL基因分型位点的频率统计。

等位基因频率计算公式如下：

PF＝(2NFF+NFf1+NFf2+NFf3+NFf4+……+NFfn)/2N

式中，PF表示等位基因F频率，NFF表示群体中具有FF基因型的个体数量，NFfi表示群体中具有Ffi基因型个体数量，f1、f2、…、fn分别为等位基因F的n个互不相同的复等位基因；

基因型频率计算公式如下：

PFF＝NFF/N

式中，PFF代表某一位点的FF基因型频率，NFF表示群体中具有FF基因型的个体数，N为检测群体的总个体数量；

1029个体的等位基因和基因型频率计算结果如表1所示：

表1.湖羊LPL基因突变位点g.23413C>T频率统计结果

注：HWB为哈代温伯格平衡；He为期望杂合度；Ho为观察杂合度；PIC为多态信息含量。

从表1可以看出，C为突变位点g.23413C>T的优势等位基因，等位基因频率为75.61％。且结合遗传学指标可以确定该突变位点为SNP位点。

2、湖羊LPL基因SNP位点与脂肪酸百分比的关联分析

基因型数据：以上采用iMLDR技术获得的分型结果

肉质性状数据：湖羊背最长肌脂肪酸百分比(脂肪酸百分比是指某种脂肪酸占总脂肪酸含量的百分比)

采用R-4.0.5软件分析基因位点与脂肪酸百分比的相关性，分析模型如下：

Y＝μ+G+T+e

式中，Y是脂肪酸百分比；μ是总体平均值；G是对应于SNP的固定效应；T是批次效应；e是随机误差。

通过分析数据确定LPL基因的SNP位点对脂肪酸百分比的影响，寻找影响脂肪酸百分比的潜在分子标记，结果如表2所示：

表2.湖羊LPL基因g.23413C>T与背最长肌脂肪酸百分比(Mean±SD)的关联分析

注：同一行中不同的大写字母表示差异显著(P<0.05)，同一行中不同的小写字母表示差异极显著(P<0.01)。

结果表明，g.23413C>T位点对C18:2n6c、C20:1、n-6PUFA具有极显著影响，其中TT基因型个体的C18:2n6c、C20:1、n-6PUFA百分比极显著高于CT基因型个体；g.23413C>T位点对C18:3n6、PUFA及P/S具有显著影响，其中TT基因型个体的C18:3n6、PUFA百分比及P/S显著高于CT基因型个体。

由于TT基因型个体的有益脂肪酸(C18:2n6c、n-6PUFA、C18:3n6、PUFA)及P/S均显著高于CT基因型，而PUFA及n-6PUFA具有调节血压、血脂、预防心血管疾病等功效，P/S越接近或超过0.4则羊肉营养价值越高。因此可以通过选择建立基因型为TT(作为分子标记)的群体，对湖羊肉质性状(脂肪酸组成及含量)进行早期筛选，加快选育优异肉品质的绵羊新品系。

<110> 甘肃润牧生物工程有限责任公司

<120> 一种湖羊LPL基因SNP的检测方法及其在肉质性状早期筛选中的应用

<160> 2

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> LPL-F

<400> 1

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<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> LPL-R

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