油莎草地上部分提取物及其对农药所致肝毒性的保护作用

摘要

本发明公开了油莎草地上部分提取物在抗农药残留所致肝毒性中的应用。本发明利用醇水提取油莎草，通过戊唑醇致斑马鱼肝发育障碍的模型证实油莎草提取物有显著的保肝活性，其主要活性成分为酚性化合物，包括原花青素类及绿原酸类物质等，同时具有显著的抗氧化活性。本发明公开的油莎草地上部分的新功能有助于提高其商业价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及油莎草地上部分的生物活性及用途。

背景技术

油莎草（Cyperus esculentus L.）是适应性很广的植物，可在半荒漠化地区生长，具有防风固沙作用。油莎草的块茎--油沙豆也叫虎坚果可用来榨油，制作饮料及加工食品等。油莎草地上部分常被用来饲喂家畜。挖掘油莎草地上部分对动物健康的影响和利用价值具有重要意义。

戊唑醇（Tebuconazole）是一种三唑类杀菌剂，可防治玉米大斑病菌、蔬菜白粉病等，广泛用于农业生产。然而，含有残留戊唑醇的植物进入人或动物体后，戊唑醇在体内蓄积，引起头晕、目眩甚至肝损伤。戊唑醇也有一定致癌性。本发明涉及油莎草地上部分对斑马鱼发育的影响及其对农药戊唑醇引起的肝发育障碍的缓解作用。

本发明公开了油莎草地上部分及其提取物的保肝作用新用途，实现其作为家禽畜和鱼类饲料的更高价值。

发明内容

本发明的目的是提供油莎草地上部分及其提取物的新用途和价值。

本发明采用下述技术方案：

制取油莎草地上部分的醇提取物： 油莎草地上部分用水-醇提取，过滤所得提取液减压浓缩得油莎草地上部分提取物（ECE9）。

油莎草提取物新用途的活性测定：将戊唑醇溶于二甲基亚砜（DMSO）成5 mg/mL溶液。实验分为对照组、戊唑醇模型组、戊唑醇 + ECE9组，与Tg（fabp10a:dsRed;ela3l:EGFP）转基因斑马鱼仔鱼培养，用倒置显微镜观察并拍摄鱼的红色荧光肝脏。用Image J软件测量肝脏大小。与模型组对照判断样品的保肝作用。

进一步的，油莎草地上部分提取物（ECE9）有显著的抗氧化活性。

本发明的优点及新发现为：

发现和公开了油莎草地上部分提取物及主要成分的抗氧化作用及对农药戊唑醇所致肝损伤的保护作用。

附图说明

图1是油莎草地上部分提取物（ECE9）对戊唑醇所致斑马鱼形态变化的改善作用，包括心包水肿（PE）、卵黄囊吸收情况（YSE）、脊柱变形（SD）、颌骨大小改变（JS）、心率（次/分钟）改变；

图2是油莎草地上部分提取物（ECE9）对戊唑醇所致Tg（fabp10a:dsRed;ela3l:EGFP）斑马鱼肝脏发育障碍的缓解作用（以红色荧光的肝脏大小表示）；

图3是油莎草地上部分提取物（ECE9）对戊唑醇所致斑马鱼体内谷胱甘肽水平降低的缓解作用（以GSH-NEM色谱峰面积表示）；

具体实施方式

下面对本发明的油莎草地上部分提取物的制备，抗氧化活性及保肝作用进行进一步详细说明。

实施例1：油莎草地上部分提取物的制备及其主要成分

将2020年9月采自于内蒙古农牧科学院试验区的油莎草地上部分在室温阴凉处风干，剪成小段，称取250 mg用70% HPLC级甲醇（5 ml）超声提取30分钟后，通过0.22 μm的微型过滤器，滤液减压浓缩至干得32.6 mg油莎草地上部分提取物（ECE9）。

在负电离ESI模式下，用UPLC-MS对油莎草地上部分的70%甲醇提取物ECE9进行定量，其中主要成分的含量如表1所示。

表1 油莎草地上部分提取物中主要成分的含量

实施例2：油莎草地上部分提取物的抗氧化能力

DPPH•清除能力：将ECE9溶液（10 μl）与190 μl新制备的0.1 mM DPPH乙醇溶液混合在96孔板上，在22℃黑暗处孵育20 min，后，用微型读板仪测定517 nm的吸光度。与不含样品的对照孔相比，吸光度降低的百分比为DPPH•清除率。测定结果得出ECE9清除50%DPPH•所需浓度EC

ABTS•+清除能力：将ECE9溶液（10 μl）与ABTS工作液（170 μl）和氧化剂溶液（20 μl）在96孔板中混合，于22℃黑暗中放置6 min，测定734 nm处的吸光度。用水溶性维生素E(Trolox)（0∼0.8 mM）作为标准。使用标准曲线计算测定结果，结果以每克ECE9的Troloxmmol当量表示，得出ECE9的 ABTS•+清除能力为23.08 mmol/g。

铁还原/抗氧化能力（FRAP）：在96孔板上，将ECE9溶液（5 μl）与FRAP工作液（180 μl）混合，在37℃黑暗中反应5 min，测定593 nm处的吸光度。以硫酸亚铁（0.4∼2.0 mM）为标准用标准曲线计算。测定结果以每克ECE9的Fe

实施例3：油莎草地上部分提取物（ECE9）对戊唑醇所引起肝损伤的保护作用

采用购自中国斑马鱼资源中心的AB品系野生型斑马鱼和gz15Tg/+(AB)转基因系Tg（fabp10a:dsRed;ela3l:EGFP）肝特异性表达dsRed-RFP的斑马鱼。于2020年11-12月在内蒙古呼和浩特市的自然光/暗环境，27±1℃条件下分缸饲养雄雌鱼，每天喂丰年虾2次，固体饲料2-3次。实验前一天下午17-18点，将一只雌性斑马鱼和一只雄性斑马鱼放在同一产箱，早上8点到10点产出鱼卵。下午2-3点将鱼卵收集到含E3培养基（5 mM NaCl、0.17 mMKCl、0.33 mM CaCl

将72 hpf 的Tg（fabp10a:dsRed;ela3l:EGFP）转基因斑马鱼幼鱼置于6孔板（10只仔鱼/孔）中，对照组为5 ml的0.1%DMSO-E3。模型组为5 ml的0.1%DMSO-E3液含10 μg/ml戊唑醇；样品组为0.1%DMSO-E3液含10 μg/ml戊唑醇+20、20或80 μg/ml的油莎草地上部分提取物（ECE9）。培养至120 hpf使时，用Olympus IX53倒置显微镜观察并拍摄鱼的红色荧光肝脏。用Image J软件测量肝脏大小，通过对比样品处理组与空白对照组的肝脏大小计算对肝脏发育的影响。

与空白对照组相比， 48小时后，10 μg/ml的戊唑醇在心包水肿（PE）、卵黄囊水肿（YSE）、脊柱变形（SD）和颌骨大小改变（JS）方面引起了明显的致畸效应和心脏毒性。ECE9可降低这些变化，并且有浓度依赖性效果（图1）。对肝脏中有红色荧光的Tg（fabp10a:dsRed）斑马鱼进行肝脏发育检查。戊唑醇延缓了斑马鱼肝脏的发育，当暴露于20~80μg/mL的ECE9时，肝脏逐渐增大（

研究报道，戊唑醇在鱼类（Li, S.Y., Jiang, Y., Sun, Q.Q, Coffin, S.,Chen, L.L. Qiao K., Gui, W.J., Zhu, G.N. (2020). Tebuconazole inducedoxidative stress related hepatotoxicity in adult and larval zebrafish (

实施例4：油莎草地上部分提取物（ECE9）对戊唑醇所致斑马鱼体内谷胱甘肽水平降低的恢复作用

谷胱甘肽（GSH）水平的测定：由于GSH接触空气后迅速氧化为GSSG，因此将斑马鱼置于

以UPLC-MS中GSH-NEM的色谱峰面积所示，戊唑醇组的GSH水平显著降低，ECE9处理组的GSH水平以浓度依赖的方式增加（图3）。ECE9对戊唑醇诱导的肝损伤具有保护作用，这可能归因于其抗氧化活性和体内提升谷胱甘肽水平的能力。

油莎草地上部分具有抗氧化活性，可以对抗自由基。因此，油莎草地上部分保护肝脏免受戊唑醇损伤的作用，可能与其抗氧化酚类成分有关，就含量和抗氧化活性而言，没食子儿茶素、原花青素B1和绿原酸对油莎草地上部分的生物活性贡献最大。

综上，本发明公开了油莎草地上部分抗氧化活性组分（ECE9）的制备、抗氧化活性及对戊唑醇引起的肝发育毒性的保护作用。

上述实例仅列举了本发明较佳的实施例，本发明的保护范围不应受到其限制，熟悉本领域技术人员在本发明的技术范围内，以简单替换或变化所得技术方案均落入本发明的保护范围。