核酸多色荧光探针及制备与在实时原位观察P53介导的细胞凋亡通路顺序激活中的应用

摘要

本发明公开了核酸多色荧光探针及制备与在实时原位观察P53介导的细胞凋亡通路顺序激活中的应用。在S‑AuNSs@SiO

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料和生命科学技术领域，尤其涉及核酸多色荧光探针及制备与在实时原位观察P53介导的细胞凋亡通路顺序激活中的应用。

背景技术

哺乳动物细胞中有两种不同但最终会聚的凋亡途径：Bcl-2调节(也称为内在、线粒体或应激)途径和死亡受体(也称为外在)途径。在Bcl-2调节途径中，P53、Bax和细胞色素C(Cyt c)处于密切的上游和下游关系，被确定为监测细胞凋亡的有吸引力的目标。P53蛋白是一种肿瘤抑制因子，是DNA损伤反应的关键因素。P53对细胞凋亡的激活涉及固有的凋亡途径，以消除含有DNA损伤的应激细胞。Bax是Bcl-2家族的成员，是细胞凋亡内在途径的核心调节因子。凋亡刺激后，它们被激活并在线粒体外膜处寡聚化以介导其通透性，从而引起Cyt c从膜间空间向细胞质的移位，随后激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)的级联反应。实时检测P53、Bax和Cyt c的顺序激活以及阐明这些caspase的上下游关系对于了解细胞凋亡过程和评估癌症的治疗效果至关重要治疗。

目前广泛使用的分析信号通路中基因和蛋白的方法是基于传统的技术，如Northern印迹杂交、实时逆转录-PCR(RT-PCR)、微阵列杂交、蛋白质印迹和免疫组织化学。然而，这些方法需要大量的时间、繁琐的步骤以及大量的细胞样本。此外，这些方法中使用的细胞裂解或固定化过程使得研究这些分子的动态变化和自然状态变得不可能。因此，开发一种无创方法来检测信号通路中的多个分子十分重要。而荧光成像分析在细胞内监测中的快速、高分辨率和直接可视化的优点，使其在同时监测参与活细胞信号通路的基因和蛋白并提供有关细胞信号转导通路的有用信息方面具有巨大潜力。

然而，基于金纳米材料的探针中，Au-S键很容易被生物硫醇裂解，包括谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸，它们以相对较高的浓度存在，不可避免地会导致假阳性结果。酰胺键(-CO-NH-)作为肽的骨架，广泛存在于整个生理系统中，在人类生活中发挥着至关重要的作用。由于惰性化学性质，酰胺键被认为是最稳定的化学基团之一。重要的是，酰胺键很容易通过氨基基团(-NH

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种核酸多色荧光探针S-AuNSs@SiO

本发明的第一个目的在于提供一种核酸多色荧光探针S-AuNSs@SiO

其中，所述二氧化硅包覆的对称金纳米星(S-AuNSs@SiO

所述P53固定链、Bax固定链或Cyt c固定链标记有羧基基团，所述P53识别链、Bax识别链或Cyt c适体链标记有不同的荧光基团。

在本发明的一个实施例中，所述不同的荧光基团选自FAM、TAMRA和Cy5中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，所述P53固定链序列：5’-COOH-AAAAAGCTTTGAGGTGC-3’；

Bax固定链：5’-COOH-AAAAAAGAGGCGGGGG-3’；

Cyt c固定链：5’-COOH-AAAAAGCAACAACGTAC-3’；

P53识别链：5’-GCACAAACACGCACCTCAAAGC-荧光基团-3’；

Bax识别链：5’-CTCAGAGCTGGTGGGCCCCCCGCCTCT-荧光基团-3’；

Cyt c适体链：5’-CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGC-荧光基团-3’。

在本发明的一个实施例中，所述二氧化硅包覆的对称金纳米星通过以下方法制备得到：

S1：将PVP溶液加热至回流，加入HAuCl

S2：向PVP溶液中加入DMA溶液和盐酸溶液搅拌混合均匀，加入S1中所得I-AuNPs溶液，然后加入HAuCl

S3：将CTAC加入S2中所得对称金纳米星的水溶液并搅拌，加入NaOH溶液，并将TEOS至少分三次加入，反应得到所述二氧化硅包覆的对称金纳米星。

在本发明的一个实施例中，步骤S1中，所述PVP与HAuCl

在本发明的一个实施例中，步骤S2中，所述PVP与DMA的质量体积比为0.5-1.5g：60-140μL。

本发明的第二个目的在于提供所述的核酸多色荧光探针S-AuNSs@SiO

(1)将二氧化硅包覆的对称金纳米星(S-AuNSs@SiO

(2)取靶标固定链，并加入EDC和NHS并孵育，加入氨基官能化的二氧化硅包覆的对称金纳米星进行反应，得到cDNA修饰的S-AuNSs@SiO

(3)将靶标识别链与步骤(2)所得cDNA修饰的S-AuNSs@SiO

在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述EDC、NHS与S-AuNSs@SiO

在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述靶标识别链与cDNA修饰的S-AuNSs@SiO

本发明的第三个目的在于提供所述的核酸多色荧光探针S-AuNSs@SiO

本发明的第四个目的在于提供所述的核酸多色荧光探针S-AuNSs@SiO

在本发明的一个实施例中，检测方法：将含有S-AuNSs@SiO

在本发明的一个实施例中，培养基中纳米S-AuNSs@SiO

在本发明的一个实施例中，所述S-AuNSs@SiO

在本发明的一个实施例中，所述细胞包括人宫颈癌细胞Hela、人结直肠腺癌细胞Caco-2、人肝癌细胞HepG2和人乳腺癌细胞中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，所述毒素选自T-2毒素、黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素中的一种或多种。

所述的基于DNA链解旋的核酸多色荧光探针，是基于结合亲和力差异。由于具有20个对称“热点”，S-AuNSs可以产生更强的局部电场。通过在其表面包裹稳定的硅壳并涂覆大量氨基(-NH

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

(1)与传统检测方法相比，本发明提出的S-AuNSs@SiO

(2)由于具有较强的酰胺键和高度稳定的硅壳，S-AuNSs@SiO

(3)S-AuNSs@SiO

(4)S-AuNSs@SiO

(5)纳米S-AuNSs@SiO

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为本发明实施例1制备的对称金种的TEM电镜图、紫外-可见吸收光谱图；

图2为本发明实施例1制备的S-AuNSs的TEM电镜图、紫外-可见吸收光谱图；

图3为本发明实施例1制备的S-AuNSs@SiO

图4为本发明NanoMeasurer软件对实施例1制备的S-AuNSs、S-AuNSs@SiO

图5为本发明实施例2中羧基DNA与S-AuNSs@SiO

图6为本发明实施例2中双链在S-AuNSs@SiO

图7为本发明实施例2中荧光链浓度优化；

图8为本发明实施例3中S-AuNSs@SiO

图9为本发明实施例3中S-AuNSs@SiO

图10为本发明实施例4中S-AuNSs@SiO

图11为本发明实施例4中S-AuNSs@SiO

图12为本发明实施例4中S-AuNSs@SiO

图13为本发明实施例5中不同浓度的T-2毒素侵染Hela细胞结果；

图14为本发明实施例6中不同浓度S-AuNSs@SiO

图15为本发明实施例8中以ICP-MS对S-AuNSs@SiO

图16为本发明实施例9中T-2毒素侵染Hela细胞不同时间后用试剂盒测定活细胞凋亡时P53 mRNA、BaxmRNA和Cyt c含量；

图17为本发明实施例10中核酸多色荧光探针S-AuNSs@SiO

图18为本发明实施例10中共聚焦荧光强度与T-2毒素孵育时间的关系；

图19为本发明实施例11中S-AuNSs@SiO

图20为本发明所设计的核酸多色荧光探针S-AuNSs@SiO

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1二氧化硅包覆对称金纳米星(S-AuNSs@SiO

首先合成二十面体金种子(I-AuNPs)。将0.05-0.2g PVP溶解25mLDEG溶液中，在烧瓶中加热至沸腾回流。5min后，快速注入2mL含有10-30mg HAuCl

在DMA存在下合成对称金纳米星(S-AuNSs)。将0.5-1.5g PVP溶解在15mLDMF中。然后加入60-140μL40％DMA和120-200μL 2.5M HCl溶液。随后，加入1mLI-AuNPs溶液，然后加入10-30μL 0.5M HAuCl

对S-AuNSs进行硅壳包覆。将2.0mM的CTAC(10-40μL)加入2.5mL S-AuNFs溶液中搅拌过夜，然后加入15-20μLNaOH(0.1M)。随后，以30min的间隔加入5-10μL用甲醇制备的20％TEOS三次。24h后，将产物以8000rpm离心5min，并使用乙醇洗三次。最后，将获得的S-AuNSs@SiO

由图1可见，二十面体金种子(I-AuNPs)分散良好且外观均匀，在570nm处附近显示出等离子体共振峰，平均粒径为97nm。

由图2可见，合成的所有的S-AuNSs都是高度对称的，具有十个相同臂的投影轮廓和显著单分散性。同时，S-AuNSs拥有较宽的等离子体共振散射峰，与多数荧光基团的吸收峰匹配良好，因此可以发生荧光共振能量转移过程，导致荧光基团的共振淬灭。

图3可见，二氧化硅对S-AuNSs的成功包覆(S-AuNSs@SiO

图4可见，S-AuNSs的平均粒径为204nm，S-AuNSs@SiO

实施例2 S-AuNSs@SiO

首先，将10-15μL氨水(25％)和2.5mL S-AuNSs@SiO

最后，产物以8000rpm离心5min，洗涤3次，再分散于10mLPBS中。然后将荧光基团标记的DNA(P53-rDNA、Bax-rDNA、Cyt c-apt)添加到上述溶液中，并在37℃下孵育3h。通过反复离心去除多余的DNA，并将沉淀物重新悬浮在PBS缓冲液中以获得纳米多色S-AuNSs@SiO

为了获得最大的负载量，更改荧光链溶液浓度以便进行优化，以荧光链在S-AuNSs@SiO

如图5所见，在与S-AuNSs@SiO

如图6所见，荧光(FAM、TAMRA、Cy5)标记DNA和S-AuNSs@SiO

使用荧光信号对荧光链浓度进行了优化(如图7所示)。杂交前后系统中荧光强度的降低间接反映了成功杂交的荧光链的数量。随着三条荧光链浓度的增加，该值先增加后保持不变。推测三条链杂交已饱和，因此分别选择1μM作为最佳浓度。

实施例3核酸多色荧光探针S-AuNSs@SiO

最后，收集S-AuNSs@SiO

(1)紫外可见光谱表征S-AuNSs@SiO

将制得的S-AuNSs@SiO

(2)荧光实验评估S-AuNSs@SiO

将三组纳米S-AuNSs@SiO

(3)S-AuNSs@SiO

将S-AuNSs@SiO

(4)拉曼实验评估S-AuNSs@SiO

将S-AuNSs@SiO

(5)拉曼光谱表征双模纳米S-AuNSs@SiO

收集S-AuNSs@SiO

由图8所示，即使NaCl浓度高达400mM(远高于细胞内离子强度)，S-AuNSs@SiO

胞内存在一定量的核酸酶，因此高核酸酶抗性对于细胞内传感系统至关重要。DNase I和RnaseA被用作模型酶来研究探针的稳定性。图9A-C发现S-AuNSs@SiO

细胞凋亡可导致细胞内酸化，pH值在5-9范围内对S-AuNSs@SiO

如图9G-I所示，随时间改变，作为溶剂，培养基、胎牛血清对S-AuNSs@SiO

如图9J-L所示，不同荧光基团对应的SERS峰强度的相对标准偏差(RSD)均为5％左右，这说明所提出的纳米S-AuNSs@SiO

实施例4 S-AuNSs@SiO

S-AuNSs@SiO

为了确定S-AuNSs@SiO

如图10、11所示，随着靶标浓度的增加，荧光强度逐渐增加(图10)。FAM的荧光发射与P53 mRNA浓度之间存在良好的线性关系(图11A)。回归方程为y＝2286.15·X-463.12，线性系数R

如图12所示，在相同的条件下，用核酸错配链、生物蛋白以及其他生物活性物质处理S-AuNSs@SiO

实施例5 T-2毒素工作浓度的确定：

采用CCK-8法确定T-2毒素与细胞共培养的最佳浓度。将T-2毒素母液用细胞培养基稀释成不同浓度。将Hela细胞以每孔5000个的密度接种100μL细胞悬液于96孔板中。将培养板放在培养箱培养24h(37℃，5％CO

细胞相对存活率＝(实验组吸光值-空白组吸光值)/(对照组实验值-空白组吸光值)×100％。通过Origin软件拟合T-2毒素对Hela细胞的IC

如图13所示，随着T-2毒素浓度增加，Hela细胞活力也依次降低。通过Origin软件拟合得到T-2毒素的IC

实施例6 CCK-F法评测S-AuNSs@SiO

Hela细胞以每孔5000个的密度接种于96孔荧光板中。在37℃，5％CO

由图14可知，甚至100pnM的S-AuNSs@SiO

实施例7 ICP-MS对S-AuNSs@SiO

为了进一步验证细胞中确实己经吞入S-AuNSs@SiO

由图15可知，Hela细胞对S-AuNSs@SiO

实施例8试剂盒测定活细胞凋亡时P53 mRNA、Bax mRNA和Cyt c含量：

根据指定的方案，使用总RNA抽提试剂盒从T-2毒素处理过的细胞中提取总细胞RNA，然后使用HiScript试剂盒的逆转录(RT)反应制备cDNA样品。使用qPCR试剂盒进行cDNA的qPCR分析。20μL反应溶液包含2μL cDNA样品、10μL SYBR qPCR Master Mix、2μL引物混合物和6μL无酶水。PCR条件如下：初始95℃30s，然后是95℃10s和60℃30s的40个循环。以GAPDH为内参并使用2

由图16发现，在HeLa细胞中，细胞中的P53 mRNA、Bax mRNA和Cyt c呈毒素孵育时间依赖性增加。

实施例9核酸多色荧光探针S-AuNSs@SiO

首先，Hela细胞在共聚焦培养皿中预培养24h至80％覆盖后，将S-AuNSs@SiO

如图17、18所示，在用T-2毒素刺激之前，在细胞中没有观察到背景中的荧光。孵育30min后，Hela细胞中FAM(绿色，P53 mRNA)的荧光首先出现，并随着细胞凋亡的进展逐渐增强。随着孵育时间的流逝，在孵育60min后观察到TAMRA荧光(黄色，Bax mRNA)。Cy5与Cyt c激活相关的时间依赖性荧光信号直到T-2毒素处理90min才检测到，然后随着细胞凋亡的进展信号逐渐增强。

实施例10 S-AuNSs@SiO

选择人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7和人结直肠腺癌细胞Caco-2来确定S-AuNSs@SiO

由图19所示，T-2毒素孵育前，细胞内荧光信号较弱。孵育2.5h后，可以看出细胞内三个通道的荧光信号增强。可以得出结论，所提出的核酸多色荧光探针具有出色的通用性，可以实现各种人类细胞系中凋亡通路的监测。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。