红细胞膜包封PLGA载磷酸特地唑胺纳米载药系统及其制备方法和用途

摘要

本发明提供一种红细胞膜包封PLGA载磷酸特地唑胺纳米载药系统及其制备方法和用途，所述系统内含有红细胞膜包封PLGA载磷酸特地唑胺纳米粒，所述纳米粒包括PLGA和磷酸特地唑胺，所述PLGA与磷酸特地唑胺形成复合体，所述红细胞膜包封于复合体外部。本发明采用生物材料红细胞膜以及脂溶性材料PLGA包载磷酸特地唑胺，制得的红细胞膜包封PLGA载磷酸特地唑胺纳米粒。其粒径分布均匀，与游离的药物相比，具有体外缓释以及细菌毒素清除的效果。对于MRSA感染的伤口模型，该制剂具有相比于游离磷酸特地唑胺更显著的抑菌效果，更快促进伤口愈合，同时具备高度生物安全性。该制剂对治疗细菌感染(包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌，MRSA)引起的感染具有积极的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种药物制剂，特别是涉及一种红细胞膜包封PLGA载磷酸特地唑胺纳米载药系统及其制备方法和用途。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)作为常见致病菌种，其耐药性随着抗生素的不规范使用逐渐严重，目前成为重大卫生问题(Arias CA,MurrayBE.N Engl J Med,2009,360(5):439-443.)。临床治疗所常用的抗生素如：异烟肼、阿卡米星、左氧氟沙星、万古霉素、利奈唑胺等都已出现一定的耐药性。而新药利奈唑胺也由于其不可避免的毒副作用，运用受限。磷酸特地唑胺(Tedizolid phosphate,TR-701)，是一种噁唑烷酮类的新型抗生素，属于利奈唑胺的衍生物。TR-701是作为特地唑胺(TR-700)活性前药，在水解后针对金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林菌株、甲氧西林敏感菌株)和各种链球菌属和粪肠球菌在内的制定细菌具有高效的抑菌能力。TR-701被验证在体内外对于多种革兰氏阳性菌具有很好的杀灭效果。

作为抗生素药物，磷酸特地唑胺在使用过程中可能产生耐药性，从而导致和万古霉素相似的产生严重的耐药性产生的后果。而制剂开发可以有效降低抗生素耐药性产生的可能性，通过制剂优势，帮助抗生素高效递送于感染部位，实现靶向释放的同时降低药物对于其他部位的毒性。而目前，针对磷酸特地唑胺的剂型的研究极少。红细胞膜(Red bloodcell menbrance，RBCM)包裹纳米粒的递送药物体系就在抗生素递送上颇有前景(P.A.Oldenborg,A.Zheleznyak,Y.F.Fang,C.F.Lagenaur,H.D.Gresham,F.P.Lindberg,Science(New York,N.Y.)288(2000)2051–2054.)。红细胞被报道具有吸附细菌外毒素的特质，可以达到响应性释放，同时红细胞纳米粒子系统可以帮助把纳米粒达到免疫逃逸的效果，延长药物在体内的循环，达到长效的效果。Li-Li Li(Li L L,Xu J H,Qi G B,etal.Journal of Controlled Release,2015,213(5):71-71)等人制备了表面由RBCM修饰的超分子明胶包裹万古霉素纳米粒。RBCM赋予制剂生物仿生性，给予纳米载体免疫逃逸的功能，并在存在细菌毒素的情况下吸附毒素，可以特异性杀死革兰氏阳性和明胶酶阳性细菌。

现代研究表明，纳米粒载药红细胞体系可以帮助药物实现长效循环，降低药物毒副作用。而针对抗菌药来说，该体系可以帮助药物在细菌感染部位快速释放并且吸附细菌释放的外毒素，达到双重抗菌药效。同时，由于红细胞包裹纳米粒载药体系的特质，可以实现药物的缓慢释放。

发明内容

鉴于以上所述现有研究的空缺，本发明的目的在于提供一种红细胞膜包封PLGA载磷酸特地唑胺纳米载药系统及其制备方法和用途，为新型抗菌药TR-701提供更多剂型选择，更好地服务患者和临床应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供了一种红细胞膜包封PLGA载磷酸特地唑胺纳米载药系统，所述系统内含有红细胞膜包封PLGA载磷酸特地唑胺纳米粒，所述纳米粒包括PLGA以及磷酸特地唑胺，所述PLGA与磷酸特地唑胺形成复合体，所述复合体包载于红细胞膜内。

优选地，所述纳米粒的粒径为160-180nm，PDI小于0.2。

本发明的另一方面提供了上述载药系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将PLGA溶液、表面活性剂与磷酸特地唑胺溶液混合，搅拌，获得PLGA包载磷酸特地唑胺的纳米复合物；

(2)PLGA包载磷酸特地唑胺的纳米复合物中加入红细胞囊泡，利用挤出仪挤出，即可。

进一步地，所述步骤(1)中含有表面活性剂的磷酸特地唑胺的溶液的制备方法为：将磷酸特地唑胺溶液加入含有表面活性剂的缓冲液中并持续搅拌。更进一步的，所述磷酸特地唑胺溶液与含有表面活性剂的缓冲液的体积比例为1：9；所述磷酸特地唑胺溶液的制备方法为：磷酸特地唑胺溶解并与碳酸氢钠水溶液反应溶解，获得磷酸特地唑胺溶液浓度为20mg/mL-40mg/mL的溶液。

进一步地，所述表面活性剂选自非离子表面活性剂。例如泊洛沙姆188，吐温80。更进一步地，例如若所述PLGA溶液体积为1mL则浓度可为8mg/mL-20mg/mL；同时表面活性剂最终浓度为1％则体积为10mL。

例如可以使用泊洛沙姆188最终浓度为1％；缓冲液采用PBS，PBS体积为9mL；磷酸特地唑胺浓度为30mg/mL，体积为1mL；PLGA浓度为15mg/mL，体积为1mL。

更进一步地，当0.5mL RBCM对应0.5mL全血时，所述红细胞囊泡与PLGA包载磷酸特地唑胺的纳米复合物体积比为1:20。

进一步地，所述步骤(1)中的搅拌采用磁力搅拌，转速400-500rpm，时间为3h-4h。

进一步地，所述红细胞囊泡的制备方法为：利用超声仪处理红细胞膜。更进一步地，所述超声条件为100w，3min。

更进一步地，所述红细胞膜的制备方法为：取血，离心去除血浆和白细胞，破壁，离心、清洗。更具体可以是：大鼠腹主动脉取血，低温低速离心去除血浆和白细胞，低渗EDTA溶液破壁多次，离心、清洗后即得所述红细胞膜。

本发明的另一方面提供了上述红细胞膜包PLGA载磷酸特地唑胺纳米载药系统在制备治疗革兰氏阳性菌感染中的用途。所述药物可以是静脉注射用制剂。

进一步地，所述革兰氏阳性菌可以是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，其在临床上具有强力毒性。对于包括对β-内酰胺类抗生素、喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素等耐受。可引起包括化脓性皮肤软组织感染、肺炎、菌血症、骨髓炎等疾病。

如上所述，本发明的红细胞膜包封PLGA载磷酸特地唑胺纳米载药系统，具有以下有益效果：

1)RBCM包裹PLGA载磷酸特地唑胺纳米粒用可用于静脉给药的脂溶性材料PLGA包载，制得的RPTR-701Ns分布均匀，平均粒径180-200nm，PDI稳定在0.2以下，与游离药物相比具有显著的体外缓释作用。

2)本发明的递药系统没有溶血作用，可用于静脉注射，连续给药体内后无明显的系统毒性。

3)本发明的递药系统在体内外有与游离药物有可相比的安全性。

4)本发明的递药系统在体内抗革兰氏阳性菌(包括MRSA)引起的感染方面，有比游离药物更高的药效。

附图说明

图1为PTR-701Ns和RPTR-701Ns的表征图：PTR-701Ns和RPTR-701Ns粒径(A)，PDI(B)，7天内的粒径(C)以及PDI(D)；

图2为PTR-701Ns(A)和RPTR-701Ns(B)在透射电镜下的形态图；

图3为TR-701、PTR-701Ns和RPTR-701Ns体外释放曲线；

图4为RPTR-701Ns孵育3h(A)和24h(B)后的体外溶血实验结果图；

图5为通过293细胞验证空白载体PNs和RPNs(A)及PTR-701Ns和RPTR-701Ns(B)的体外毒性实验结果图；

图6为Raw 264.7细胞摄取PTR-701Ns和RPTR-701Ns的共聚焦显微镜图(A)和流式细胞图(B)，均值荧光强度(C)，中值荧光强度(D)；

图7为TR-701、PTR-701Ns和RPTR-701Ns对MRSA USA300(A)、MRSA ATCC 43300(B)及NTCT 8325(C)的抑制作用结果图；

图8为TR-701、PTR-701Ns和RPTR-701Ns对MRSA USA300外毒素吸附效果图(A),给予RPTR-701Ns前后效果区别(B)以及定量图(C)；

图9a体内药效试验连续7天给药后小鼠体重变化(A)，内脏系数(B)以及小鼠组织HE染色图(C)；

图10体内药效试验造模示意图(A)内脏系数(B)伤口愈合图(C)，伤口愈合率(D)，皮肤细菌逆培养(E)，以及伤口皮肤HE染色图(F)。

具体实施例

本申请将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)与磷酸特地唑胺相结合，制得获得PLGA载磷酸特地唑胺纳米粒PTR-701Ns。将生物相容性良好的RBCM包封于PTR-701Ns之外，制备获得有具有缓释作用的RBCM包裹载药纳米粒RPTR-701Ns，并对纳米粒粒径、PDI、包封率、载药量和形态进行表征。同时，体外释放实验、体外细胞摄取实验结果表明该载药系统可实现缓释及安全无毒的目的。进一步，通过体外安全性实验验证，将游离TR-701制备成为RPTR-701Ns后，在一定浓度下无静脉注射毒性且对于人胚胎肾293细胞安全无毒。体内实验证明了对于MRSA伤口感染的小鼠，RPTR-701Ns的治疗能达到更高的抑菌效果以及促进伤口愈合效果，并且RPTR-701Ns对于内脏以及血液没有系统性毒性。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

在下中文缩写及其含义：

RBCM：红细胞膜

TR-701：磷酸特地唑胺

PLGA：聚乳酸-羟基乙酸共聚物

PTR-701Ns：PLGA包载磷酸特地唑胺纳米粒

RPTR-701Ns：红细胞膜包封PLGA包载磷酸特地唑胺纳米系统

MRSA：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

MSSA：甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌

实施例1 PTR-701Ns的制备

1.1mL 30mg/mL的TR-701与9mL含有0.1g泊洛沙姆188的PBS溶液混合后搅拌形成含药水相；加入1mL 8mg/mL PLGA的丙酮溶液，持续搅3h，得到PLGA钠载药纳米粒；

2.1mL 30mg/mL的TR-701与9mL含有0.1g泊洛沙姆188的PBS溶液混合后搅拌形成含药水相；加入1mL 10mg/mL PLGA的丙酮溶液，持续搅3h，得到PLGA钠载药纳米粒。

3.1mL 30mg/mL的TR-701与9mL含有0.1g泊洛沙姆188的PBS溶液混合后搅拌形成含药水相；加入1mL 15mg/mL PLGA的丙酮溶液，持续搅3h，得到PLGA钠载药纳米粒。

4.1mL 30mg/mL的TR-701与9mL含有0.1g泊洛沙姆188的PBS溶液混合后搅拌形成含药水相；加入1mL 20mg/mL PLGA的丙酮溶液，持续搅3h，得到PLGA钠载药纳米粒。

表1

由表1可知，纳米粒的粒径随着PLGA浓度的增大而增大，但总体粒径均小于200nm，处于150nm-190nm之间；PDI均不大于0.15，说明纳米粒分散均匀。

实施例2包封率和载药量的测定

取实施例1制备好PTR-701Ns，取3mL纳米混悬液于提前处理好的透析袋中，扎紧两端后置于50mL透析外液(1×PBS)中，37℃、磁力搅拌下透析3h。取1mL透析液，经0.22μm微孔滤膜过滤使用高效液相色谱法(HPLC)测定TR-701的浓度。通过以下公式计算包封率和载药量：

其中HPLC检测条件为：

色谱柱：Agilent

表2

表3

由表2可知，在PLGA浓度为8mg/mL-15mg/mL时候，包封率和载药量随着PLGA浓度增大而增大，于PLGA浓度为15mg/mL时达到最高，而PLGA的量继续增长则无法载上更多的药物。说明15mg/mL PLGA对于30mg的投药量可以达到最佳的包载效果。当PLGA浓度为15mg/mL时，该纳米粒包封率和载药量分别为36.63％和24.42％。因此，实例1-3作为最佳制备方法，制备PTR-701Ns以及后续RPTR-701Ns。

实施例3红细胞膜的制备

取健康大鼠，称体重，按照100g/0.7mL腹腔注射10％的水合氯醛麻醉。腹主动脉取血，将血液分装至含有50μL 5mg/mL肝素钠的EP管中，每管0.5mL，离心(2000rpm，5min，4℃)去掉上清和白细胞层，加入PBS溶液混匀，重复清洗三次。加入0.9mL EDTA溶液(0.2mM)混匀，使红细胞在低渗介质中裂解，释放血红蛋白，然后再加入0.1mL 10倍浓度PBS混匀，离心(13200r/min，10min，4℃)清洗，去掉上清液，保留底部红细胞膜，重复此过程三遍以上，直至上清液无色。去上清后用EDTA溶液定容至0.5mL，-80℃保存。

实施例4 RBCM使用前准备

取按照实施例3制备好的红细胞膜，在37℃水浴中解冻后,离心(13200r/min，10min，4℃)清洗，去掉上清液，加入PBS定容至0.5mL，待用。

实施例5 RPTR-701Ns的制备

取按照实施例4制备好的RVs溶液与实施例1-3制备好的PTR-701Ns纳米溶液适量，按照RBCM溶液与PTR-701Ns纳米粒溶液的体积比为1：20进行混合，在100W,40kHZ下超声3min，得到RPTR-701Ns。按照上述方法平行制备样品各三组，用马尔文激光粒度仪测定其粒径及PDI电位。

其中样品3(对应实施例1中样品3)制备得P3TR-701N以及RP3TR-701Ns，简称为PTR-701Ns以及RPTR-701Ns。以PTR-701Ns与RPTR-701Ns为例，由图1(A)可以看出，PTR-701Ns平均粒径为177.90nm，当体积比为1:20时，RPTR-701Ns平均粒径为192.63nm，粒径相差约15nm，与两侧红细胞膜的厚度相符，证明了红细胞膜的包封；由图1(B)可见，PTR-701Ns和RPTR-701Ns的PDI平均值分别为0.0084和0.13，均小于0.2，说明纳米粒大小均一。实例1-1、实例1-2制备出效果类似，命名为RP

以下都以3号样品为例，进行实验。

实施例6 RPTR-701Ns的稳定性考察

按照实施例5的方法制备的样品按照RBCM溶液与PTR-701Ns溶液的体积比为1:20制备三个批次的RPTR-701Ns。将PTR-701Ns与RPTR-701Ns样品于常温下放置，连续7天测量样品粒径、多分散系数，考察其稳定性。

由图1(C)结果可见，PTR-701Ns粒径172-182nm之间略有波动，RPTR-701Ns粒径保持在200nm以下，第七天时粒径略有增加但总体保持稳定。由图1(D)结果可见，PTR-701Ns的PDI保在0.1以下，RPTR-701Ns的PDI保在0.2以下，二者在实验中均未观察到纳米乳液出现沉淀或团聚等现象，说明PTR-701Ns和在7天内性状和分布能基本保持稳定。

实施例7纳米粒的形态观察

在培养皿中放入一张滤纸，取两片普通碳膜支持铜网于滤纸上。各吸取10μL PTR-701Ns和RPTR-701Ns样品滴到支持铜网上，在通风橱内自然风干后。滴加10μL纯水清洗，用滤纸从铜片边缘轻轻吸走多余样品后继续风干。滴加10μL 2％的磷钨酸对样品染色，在通风处内自然风干后，置于TEM下观察。

由图2电镜图可知，PTR-701Ns呈现出完整的球状结构，且分布均匀，表面光滑完整，表示PTR-701Ns的成功制备。而RTR-701Ns呈核-壳球形结构，结构完整。说明表明RBCM成功包裹在PTR-701Ns表面。两者粒径均约在50-100nm之间。

实施例8纳米粒的体外释放实验

分别取3mL TR-701溶液、PTR-701Ns溶液与RPTR-701Ns(RBCM溶液与PTR-701Ns溶液的体积比为1:20)，各于透析袋(MW 3500)中，将透析袋的两端用系紧并固定。将其放在50mL 1×PBS水溶液中。在37℃，100rpm恒温，恒速震摇过程中，进行药物体外释放。分别于0.5、1、2、4、8、12、36、48h，从中取出1mL透析液，并补1mL新鲜PBS回透析体系中。于24h时，以50mL新鲜1×PBS替换全部释放液。将所得透析液经过0.22μm滤膜过滤后，使用HPLC检测各个时间点透析液的浓度，计算TR-701累计释放量，并将其绘制成折线图。各设置三个平行组。

由图3结果可知，游离的TR-701体外释放最快，在8h内快速释放97.27％，并于12h基本完全释放。而PTR-701Ns和RPTR-701Ns则显示出了一定的缓释效果，且RPTR-701Ns缓释效果优于PTR-701Ns。在0h-4h内，PTR-701Ns和RPTR-701Ns释放较快，其原因是在制备纳米粒时，未被成功包载进纳米粒以及红细胞膜内的药物优先释放。4h时，PTR-701Ns的累计释放率为69.61％,而RPTR-701Ns的累计释放率为58.55％，4h后，PTR-701Ns和RPTR-701Ns的释放开始减慢并持续释放至48h。PTR-701Ns与12h累计释放量为91.48％，并与48h释放96.67％。而RTR-701Ns于12h累计释放量为85.11％，于48h释放93.37％。总而言之，相比与游离的TR-701和PTR-701Ns，RPTR-701Ns的均显示出良好的体外缓释效果。推测原因可能是RBCM的包封形成的物理屏障进一步减缓了药物快速渗漏。

实施例9体外溶血与凝聚试验

SD大鼠眼眶取血1mL，离心(2000rpm，4℃，4min)分离血浆血细胞，吸走上层血浆后，加入500μL生理盐水，混合均匀后继续离心洗涤2-3次，直至上清液显示无色澄清。最后一次离心吸除上清液，收集压积红细胞。加入一定量的生理盐水，制备2％(v/v)的红细胞悬液。取7支试管，按照所示配比量，依次将生理盐水，蒸馏水，不同量的RPTR-701Ns制剂，以及红细胞悬液加入试管中并混匀。设置1-5号试管为从低到高的RPTR-701Ns浓度的样品组，6号试管为阴性对照组，7号试管为阳性对照组。将以上试管置于37℃恒温箱中孵育3h和24h后观察记录，进一步在倒置显微镜下观察红细胞聚集情况。收集上清液，用紫外线分光光度计在540nm波长下测定紫外吸收，计算溶血率，计算公式如下：

其中A(540)n代表1-5号试管的吸光度，A(540)6和A(540)7分别是阴性对照和阳性对照。

表4体外溶血试验分组

由图4可以看出，在给药孵育3h和24h后，阳性对照(7号试管)红细胞全部溶血，呈澄清的红色均一溶液状态，底部无聚集红细胞，显示红细胞完全溶血破裂。阴性对照(6号试管)红细胞状态良好，上清液呈现为透明状态。而所有样品组(1-5号试管)与均阴性对照相似：上清液澄清。进一步于倒置显微镜下观察，无红细胞聚集。通过紫外分光光度计测量分别计量3h和24h后个样品组上清液吸光度。通过计算得到，所有不同浓度的RPTR-701Ns的溶血率均小于1.5％，意味着RPTR-701Ns在各浓度范围均不会引起细胞溶血或者聚集现象，可以用于静脉注射给药。

实施例10激光共聚焦观察Raw264.7细胞对纳米粒的摄取

1.Raw 264.7细胞培养：Raw 264.7细胞使用DMEM完全培养基，于37℃，5％CO2条件下培养。

2.DiO标记的PLGA制备：称取一定量的PLGA，加入适量丙酮溶解后得到15mg/mL的PLGA溶液。向1mL浓度15mg/mL的PLGA溶液的溶液中加入30μL DiO工作液，避光孵育20min。

3.荧光标记的PTR-701Ns制备：根据实例1，使用DiO标记PLGA制备DiO标记的PTR-701Ns。

4.荧光标记的RPTR-701Ns制备：取制备好的荧光标记的PTR-701Ns以及未经荧光标记的RVs，按第三章3.2项下方法制得荧光标记的PTR-701Ns。

5.细胞给药：向12孔细胞培养板的2个孔中放入2片细胞爬片(φ＝14mm)，分为PTR-701Ns组PTR-701Ns组。每孔加入1mL细胞悬液(2×105个/mL)，在恒温培养箱中培养24h后，移除旧培养基，PBS清洗3次。各孔中加入不含血清的DMEM基本培养基1mL，饥饿1h后，移除旧培养基。实验组分别加入1mL含有PTR-701Ns和RPTR-701Ns(PLGA浓度均为30μg/mL)的完全培养基，在培养箱中孵育2h后取出。后续样品处理注意避光进行：

(1)吸弃旧培养基，PBS浸泡润洗3次；

(2)加入0.5mL 4％多聚甲醛固定细胞15min；

(3)吸弃固定液，PBS浸泡润洗3次；

(4)载玻片中心滴加10μL抗荧光淬灭封片液，使其铺上载玻片上。用镊子轻轻将爬片取出，倒扣于载玻片上

(5)10min后用无色指甲油封片将爬片四周固定，注意避免产生气泡；

如图5(A)所示，绿色荧光代表被染色的纳米粒材料，附着在明场细胞内，表明纳米粒和保密纳米粒被局势细胞所吞噬。与PTR-701Ns组相比，RPTR-701Ns组的荧光强度明显减弱表明经过红细胞包裹的纳米粒可以有效逃离巨噬细胞吞噬。

实施例11流式细胞仪观察Raw 264.7细胞对纳米粒的摄取

流式细胞仪定量检测细胞对纳米粒的摄取时，对于荧光标记的PTR-701Ns溶液的制备同实施例10，PTR-701Ns的制备使用不含荧光标记的RBCM溶液和荧光标记的PTR-701Ns溶液制得。取12孔细胞培养板，分为空白组、PTR-701Ns、RPTR-701Ns共3个组，每组设置3个复孔。每孔加入1mL细胞悬液(2×10

(1)吸弃旧培养基，PBS浸泡润洗3次；

(2)每孔加入130μL胰酶孵育3min消化细胞后加入260μL完全培养基中值消化，轻轻吹打后收集细胞，离心(1000rpm，3min，4℃)弃上清；

(3)加入500μL PBS清洗3次后，重悬于500μL PBS中；

(4)使用流式细胞仪FITC通道检测荧光强度，确定细胞摄取情况。

由图5(B，C，D)可见，Raw 264.7细胞摄取PTR-701Ns和RPTR-701Ns后平均荧光强度分别为87.1和78.53，中值荧光强度分别为70.53和62.43，表明对RPTR-701Ns摄取显著低于PTR-701Ns(P<0.05)，与LSCM结果一致。这说明RBCM包裹后可以帮助纳米粒躲避巨噬细胞摄取，这可能与红细胞膜表面存在的特殊蛋白如CD47等有关。通过体外实验结果可以推测RPTR-701Ns能实现一定程度上的免疫逃离，避免被巨噬细胞清除，从而输送足量的药物至治疗部位以发挥药效。

实施例12体外细胞毒性实验

采用CCK-8法考察纳米粒的细胞毒性。取生长稳定的细胞，计数后向96孔板各孔中接种100μL细胞液(2×10

如图6(A)所示，PLGA浓度在0.5-40μg/mL的范围时，各组HEK 293细胞存活率均高于95％,且各浓度PNs与RPNs的细胞存活率无显著性差异(P>0.05)。这表明载体PLAG纳米粒以及红细胞膜包裹的PLGA纳米粒对正常细胞均无明显毒性，安全性良好。图6(B)，含TR-701的各组制剂(游离TR-701、PTR-701Ns、RPTR-701Ns)对HEK293细胞的抑制作用大致均呈现剂量依赖性。在低浓(1～20μg/mL)时，各组细胞存活率均达到100％，说明无论是药物还是纳米粒以及包膜纳米粒组均不会对细胞造成损伤；而高浓度组(40～80μg/mL)则显示出一定的毒性，HEK 293细胞存活率大致为RPTR-701Ns＞TR-701>PTR-701Ns。为由于PLGA纳米粒以及RBCM本身对细胞没有损伤，因此推测毒性是由于药物引起的，将药物包膜后可以适当降低毒性，由此可以预测PTR-701Ns、RPTR-701Ns制剂安全。

实施例13体外抑菌实验

本实验通过测定了TR-701、PTR-701Ns以及RPTR-701Ns的对不同金黄色葡萄球菌,MRSA USA300、MRSA ATCC 43300,MSSA NTCT 8325的抑制情况。使用二倍稀释法，在96孔酶标板中，用LB培养基(含10％牛血清蛋白)将TR-701,PTR-701Ns,RPTR-701Ns稀释至TR-701浓度分别为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL各100μL，然后向每孔加入100μL MRSA细菌接种物(1×10

如图7可见，对于不同金黄色葡萄球菌菌种，RPTR-701Ns均可达到与TR-701一致的抑菌效果。表明，RPTR-701Ns在PLGA以及红细胞膜存在的情况下，依旧可以很好地释放药物，达到杀灭细菌的效果。对于MRSA USA 300，三组制剂的抑菌浓度为4μg/mL。对于MRSA43300，三组制剂的抑菌浓度为4μg/mL。对于NTCT 8325，三组制剂的抑菌浓度为2μg/mL。可见，TR-701对于敏感菌治疗效果更好。对于耐药金黄色葡萄球菌也达到了很好地疗效，可以有效治疗耐药菌，在低剂量达到很好地抑菌效果。

实施例14 RPTR-701Ns对MRSA外毒素吸附实验

将MRSA USA 300细菌离心(OD600＝0.5，5000rpm，4℃，10min)获取细菌上清液。通过0.22μm微孔滤膜过滤除去可能残留的细菌，获得含有细菌外毒素的上清液培养基。

分别设置TR-701、PTR-701Ns、RPTR-701Ns以及阴性对照组、阳性对照组。500μL细菌上清液后，分别加入200μL TR-701、PTR-701Ns、RPTR-701Ns(150μg/mL)200μL，37℃培养箱中下孵育解毒2h。各组中加入25μL全血，与细菌培养基或经RPTR-701Ns处理的细菌培养基的上清液在37℃下继续温育2小时。离心(3000rpm，4℃，10min)获取上清液，于酶标仪测定OD540来定量释放的血红蛋白以确定红细胞裂解的程度，以此表征制剂的解毒功能。其中阴性对照为LB培养基，阳性对照为含有1％(v/v)Trixton的LB培养基。

由图8可见，在给予RPTR-701Ns制剂后，红细胞溶血率降低。从82.94％降低到65.81％，而对应的TR-701、PTR-701Ns则溶血率没有改善，说明红细胞膜纳米粒制剂有很好的吸附细菌毒素的效果，从而保护红细胞。另外，从图6-2的B可见，未给予RPTR-701Ns的对照组，底层红细胞呈现黑色，表明红细胞形态及活性发生变化，细菌毒素对于红细胞造成严重损伤。而给予RPTR-701Ns的制剂底层未裂解的红细胞呈正常红色，进一步表明RPTR-701Ns对红细胞有保护作用。

实施例15体内抗感染效评价

本实验通过建立小鼠伤口感染模型，用过尾静脉给药治疗，观察给药安全性以及治疗药效。取健康雄心Balb/C小鼠(20g左右)30只，随机分为5组，分别为模型组、TR-701组、PTR-701Ns组和RPTR-701Ns组，每组6只。常规饲养一周后，使用剃毛器以及脱毛膏于背部脱毛。次日，使用生理盐水清洗脱毛处、干燥、消毒，腹腔注射麻醉进行麻醉(4％水合氯醛，10μL/g)后，使用手术剪，在背部剪开直径为8mm圆形伤口，深达横纹肌。随机，均匀涂布50μLMRSA USA 300菌液(浓度约为10

由图9和可见，在给药以及观察期间，各组小鼠体重均随着时间缓步增长，各组之间体重无显著性差异；脏器系数正常，无显著性差异；切片染色未见病变；说明造模及连续7日的尾静脉给药对于小鼠没有明显全身性毒性，治疗方案安全性高。

图10表明，对MRSA USA 300伤口感染后小鼠采用尾静脉注射TR-701，PTR-701Ns组和RPTR-701Ns连续7次治疗。自给药第一天起至观察期结束，给予药物治疗组的伤口愈合率均高于相比于对照组(PBS组)，其中RPTR-701Ns愈合率与对照组相以及TR-701组具有显著性差异(P<0.05)显著性差异。说明，RPTR-701Ns相比于TR-701有更好的促进伤口愈合效果。进一步，将患处皮肤取下逆向培养细菌以计算伤口处残存的菌量。RPTR-701Ns组相比于对照组，TR-701，PTR-701Ns组均有显著性优势。感染处皮肤组织分析显示：对照组的皮肤大范围表皮坏死，大量的中性粒细胞浸润大量炎性坏死物，增生的成纤维细胞和毛细管排列紊乱，但是而三个给药组则展现愈合情况：具体表现为成熟的肉芽组织修复，新生表皮较厚，少数炎症细胞，其中RPTR-701Ns组恢复最佳。由此结果可以推断，将TR-701包载于纳米粒中，RBCM的包裹一方面帮助纳米粒药物避免被快速清除，实现相对的长效的同时，协同起到体内毒素吸收的作用，与TR-701本身起到共同抗感染的疗效。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。