一种气郁血热夹瘀证候模型的制备方法

摘要

本发明提供了一种气郁血热夹瘀证候模型的制备方法，属于中医证候模型技术领域。该气郁血热夹瘀证候模型是使用左甲状腺素钠、或其药学上可接受的盐进行造模。本发明利用左甲状腺素钠诱导构建了一种甲状腺毒症模型，该动物模型的证型为肝郁血热夹瘀，可作为一种具有复合证候特征的气郁血热夹瘀证候模型。本发明为中医研究提供了一种新的证候模型，为中药用药筛选提供了一种新的方法，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于中医证候模型技术领域，具体涉及一种气郁血热夹瘀证候模型的制备方法。

背景技术

证候是指疾病过程中一定阶段的病位、病因、病性、病势及机体抗病能力的强弱等本质有机联系的反应状态，表现为临床可被观察到的症状等。其中气郁证、血热证均为中医中常见的证候类型。

气郁证是指体内气机运行不畅，停留于某一部位所产生的病变。临床常见的有肝气郁结、脾胃气滞。气郁证是中医常见的一种证候，其主证以胸、胁、腹部胀痛为主，时轻时重，走窜不定，嗳气或矢气后痛减；肝气郁结可见情志不舒，两胁窜痛，或乳房胀疼、月脂不调等；脾胃气滞可见腹满胀痛，消化不良等症状。血热证是指脏腑火热炽盛，热迫血分，以出血、疮疖与实热症状为主要表现的证候。又称血分的热证。其临床表现为咳血、吐血、衄血、尿血、便血，血色鲜红，质地黏稠，女子月经先期量多，或局部疮疖红肿热痛，心烦口渴，身热，舌红降，脉滑数等。

近年来，随着中医的不断发展，构建中医证候动物模型成分中医研究中重要的工作。准确的动物模型构建可以获得足够样本数量、严格控制实验条件，为提高实验结果的可靠性、准确性提供保障。其中，气郁证动物模型近年来出现许多不同的造模方法，如采用艾叶煎液注射或肾上腺素皮下注射等药物注射方法造模，或者采用情志刺激法造模。

但是，中医治疗过程中往往存在多种证候的混合，如何制备一种多证候模型，是中医研究中的难点。目前，尚未见如果构建一种气郁血热夹瘀证候模型。

发明内容

本发明的目的是提供一种气郁血热夹瘀证候模型的构建方法。

本发明提供了一种气郁血热夹瘀证候模型的制备方法，它是使用左甲状腺素钠、或其药学上可接受的盐进行造模。

进一步地，所述的制备方法包括如下步骤：

使用左甲状腺素钠、或其药学上可接受的盐给造模动物连续灌胃给药14～28天；

优选地，所述灌胃给药为一日一次，每次给药剂量为1mg/kg。

进一步地，所述造模动物为雌性大鼠；

优选地，所述雌性大鼠连续两个动情周期均正常；

更优选地，所述大鼠为SD大鼠。

本发明还提供了一种筛选预防和/或治疗气郁血热夹瘀证候的药物的方法，它包括如下步骤：

(1)按照前述的制备方法，建立气郁血热夹瘀证候模型；

(2)将候选药物施用于气郁血热夹瘀证候模型；

(3)用气郁血热夹瘀证候模型评价潜在的预防和/或治疗气郁血热夹瘀证候的药物。

本发明还提供了一种甲状腺毒症模型的制备方法，它是使用左甲状腺素钠、或其药学上可接受的盐进行造模；

优选地，所述甲状腺毒症模型具有气郁血热夹瘀证候。

进一步地，前述的制备方法包括如下步骤：

使用左甲状腺素钠、或其药学上可接受的盐给造模动物连续灌胃给药14～28天；

优选地，所述灌胃给药为一日一次，每次给药剂量为1mg/kg。

进一步地，所述造模动物为雌性大鼠；

优选地，所述雌性大鼠连续两个动情周期均正常；

更优选地，所述大鼠为SD大鼠。

本发明还提供了一种筛选预防和/或治疗甲状腺毒症的药物的方法，它包括如下步骤：

(1)按照前述的制备方法，建立甲状腺毒症模型；

(2)将候选药物施用于甲状腺毒症模型；

(3)用甲状腺毒症模型评价潜在的预防和/或治疗甲状腺毒症的药物。

本发明还提供了左甲状腺素钠、或其药学上可接受的盐在制备甲状腺毒症模型和/或气郁血热夹瘀证候模型中的用途；

优选地，所述制备方法为使用左甲状腺素钠、或其药学上可接受的盐给造模动物连续灌胃给药14～28天；

更优选地，所述灌胃给药为一日一次，每次给药剂量为1mg/kg；

和/或，所述甲状腺毒症模型具有气郁血热夹瘀证候。

进一步地，所述造模动物为雌性大鼠；

优选地，所述雌性大鼠连续两个动情周期均正常；

更优选地，所述大鼠为SD大鼠。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明利用左甲状腺素钠诱导构建了一种甲状腺毒症模型，该动物模型的证型为肝郁血热夹瘀，可作为一种具有复合证候特征的气郁血热夹瘀证候模型。本发明为中医研究提供了一种新的证候模型，为中药用药筛选提供了一种新的方法，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为各组大鼠脱毛情况对比。

图2为各组大鼠腹腔子宫卵巢情况。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1、气郁血热夹瘀证候模型的构建

1、实验材料

1.1实验动物

雌性体成熟SD大鼠，SPF级，重量280-320g，12周龄，成都达硕科技有限公司提供，动物许可证号：SCXK(川)2020-066，动物饲料为普通固体饲料(成都达硕科技有限公司提供)。

1.2实验药物

左甲状腺素钠片(优甲乐)，Merck Serono公司生产，规格：50μg*100片/盒，产品批号：600Q98，600M0T。

2、实验方法

1.1药物配制

左甲状腺素钠片混悬液制备：确定造模左甲状腺素钠片给药浓度为1mg/kg。将规格50μg/片左甲状腺素钠片200片制成粉末(有效成分左甲状腺素共10mg)，蒸溜水定容至50ml，配成浓度为0.2mg/ml的混悬液。

1.2动物分组

大鼠架式分笼饲养，每笼7只，适应性喂养2周，室温保持22℃-25℃，相对湿度40％-45％，明暗周期12h：12h，保持良好的室内通风，普通饲料和蒸馏水自由摄食、饮水。纳入标准：阴道脱落细胞涂片，连续观察大鼠2个动情周期，均正常。将SD大鼠按照随机数字表法随机分为空白组14只，模型组21只(分别于造模14天、21天、28天开始处死分为14天模型组，21天模型组，28天模型组)。

1.3造模方法

每周称重1次，根据大鼠体重给予1mg/kg剂量左甲状腺素钠片混悬液，固定每日上午10：00，模型组进行灌胃给药，一日一次，灌胃液体量1.5毫升左右；空白组给予相同体积量的蒸馏水灌胃。

于造模第14天起，在空白组、模型组中发现处于动情前期，即阴道脱落细胞见多数胞浆呈粒状的上皮细胞，少量角化无核上皮细胞，未发现白细胞，或动情周期延长(连续动情周期观察处于同一周期连续5天以上)和动情周期紊乱的雌鼠，即刻称重进行麻醉取材，每组选取7只，组成空白组、14天模型组，取材间隔取不超过48h，取材期间停止造模。同时，并于造模第21天，28天开始分别完成21天模型组和28天模型组的取材。

1.4观察指标

(1)一般情况：观察大鼠精神状态、毛色、活动状态及排泄情况并详细记录实验过程中出现的异常情况。

(2)大鼠24h摄食量、饮水量及肛温、体重

根据适应性饲养期间的基础数据，每日水瓶内给予600ml蒸馏水，食盒内500g鼠粮，每日定时测量每笼大鼠饮水及摄食剩余量，计算实际饮水和摄食量。合计一周饮水总量及摄食总量后，计算每只大鼠平均每日饮水量和摄食量。自造模第一天起0、7、14、21、28天，固定上午8：00测静息肛温，肛温仪探头涂抹石蜡油缓慢插入大鼠直肠内，待肛温仪显示数据稳定10s以上记录数据，动作温和，以免大鼠情绪激动引起肛温变化，自造模第一天起0、7、14、21、28天，电子秤检测大鼠体重变化。

(3)动情周期监测

每日固定时间由专人进行阴道涂片的检测以监测动情周期，用左手提起雌鼠的尾部，观察并充分暴露外阴口，然后将浸有生理盐水的医用棉签插入阴道，轻轻旋转后抽出，将分泌物涂在载玻片上置于光学显微镜下，根据脱落细胞类型和数量比例，以确定动情周期并记录，动情周期紊乱或连续5天处于同一动情周期被认为动情周期异常。

(4)标本采集

造模第14天、21天、28天选取处于动情前期或动情周期异常的雌鼠，各亚组均为7只。按雌鼠每100g体重给予浓度为10％的水合氯醛溶液0.4ml，进行腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后，取腹主动脉血，无添加剂试管采血5ml以上；抗凝管采血2ml以上，充分摇匀。血液样本室温静置2h后，使用离心机3500r/min离心15min，移液枪取上清液，分离的血清及血浆置于标记好，保存至冻存管中，-80℃冰箱冷藏待检。使用已消毒的眼科镊分离腹腔脂肪及脏器，剥离附着在子宫和卵巢的筋膜和脂肪组织，剪下子宫与卵巢，左侧的子宫和卵巢生理盐水洗涤后，置于4％多聚甲醛固定待制作切片；右侧子宫和卵巢，除去残留血液，按质量体积比1：9加入PBS，使用匀浆器进行组织匀浆，匀浆液在5000×g条件下，离心10min，取上清液待测。

(5)样本检测

血清E2、FT3、FT4、TSH、VEGF、5-HT、AMH和子宫组织匀浆的ET-1含量测定采用elisa法检测，严格按试剂盒说明操作：试剂平衡至室温后加样，空白对照孔中加入终止液、显色剂A、B，标准品孔中加入50μL标准品后加入辣根过氧化物酶100μL；样品孔中加入血清或组织匀浆50μL及辣根过氧化物酶100μL，轻轻振荡混匀，于37℃温育60min。蒸馏水20倍稀释20倍的浓缩洗涤液洗涤5次，拍干，每孔先后加入底物A和液底物液B各50μL，震荡混匀于37℃避光显色15min。加终止液50μL后在15min内，用酶标仪在450nm波长依序测量吸光度值(OD)，浓度作为纵坐标，标准品的OD值作为横坐标，计算标本浓度标准品及样本OD值，扣除空白孔OD值，如设复孔，则应取其平均值计算，用标准物的浓度与绝对OD值计算出标准曲线的线性回归方程式，将样品的绝对OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

子宫组织匀浆NO采用比色法进行检测，严格按照试剂盒说明进行操作加入组织匀浆和R1、R2混合试剂，37℃水浴60分钟后加入R3、R4，抽提室温静置40分钟，3500～4000转/分，离心10分钟，取上清0.5ml，加入显色剂，静置10分钟，550nm波长，0.5cm光径，测定吸光度以计算NO含量。

固定卵巢和子宫组织经全自动脱水机脱水(脱水时长：75％酒精4h、85％酒精2h、95％酒精1h、100％酒精0.5h、100％酒精0.5h、100％酒精0.5h、100％酒精0.5h、二甲苯10min、二甲苯10min、石蜡1h、石蜡2h、石蜡3h)，包埋，切片，染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，等待镜检。卵巢组织使用数字切片扫描仪采集100倍和400倍图片，进行卵泡数量分类，计数原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦状卵泡、闭锁卵泡和黄体；子宫组织使用BA210Digital数码三目摄像显微摄像系统进行100倍和400倍图像采集，测量子宫内膜厚度，计数微血管数量。

(6)统计方法

用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行统计，空白组-模型组比较使用单因素ANOVA进行比较分析。事后多重比较：假定方差齐性选择“LSD”，未假定方差齐性选择“Tamhane’s T2”。

3、实验结果

(1)大鼠的一般情况比较

空白组大鼠精神状态良好，毛色光泽，性情温和。模型组第四天开始部分出现灌胃时大鼠情绪过激致使鼻部少量出血，第八天开始部分雌鼠出现软便，排泄物量多，排泄物异味重等情况，且下颌及胸部出现脱毛，毛色无光泽(见图1)。取材过程中观察大鼠腹腔及卵巢子宫情况，发现28天模型组的子宫及卵巢充血明显，部分出现轻度水肿(见图2)。

(2)大鼠平均体重增长变化

自造模第一天起，每隔7天进行体重测量，对比上一周体重，计算出该周雌鼠体重的增长情况。体重增长结果表明(见表1)：模型组体重增长幅度明显低于空白组，且于造模第二周下降最为明显(P＜0.01)，多数大鼠甚至出现了体重的负增长，说明左甲状腺素钠片灌胃减缓大鼠正常的体重增长，但随着造模时间持续延长至第四周，空白组体重增长幅度与模型组无明显差异(P＞0.05)。

表1.每7天各组大鼠体重增长情况(g)

注：a：空白组与模型组差异有统计学意义(P＜0.01)；b：空白与模型组差异无统计学意义(P＞0.05)。

(3)大鼠静息状态肛温变化

自造模第一天起0、7、14、21、28天，上午8：00测静息肛温，肛温变化结果表明(见表2)：模型组肛温明显高于空白组，且具有显著性差异(P＜0.01)，说明左甲状腺素钠片灌胃可引起大鼠肛温的升高；模型组肛温持续升高，并于造模21天大鼠肛温达到最高峰，随后造模28天较造模21天的甲状腺毒症雌鼠肛温出现明显降低，但仍高于空白组，均具有统计学差异(P＜0.05)，说明左甲状腺素钠片灌胃于第7天起即可引起大鼠肛温的持续升高至第21天，但随着造模时间持续延长至第28天，升高趋势渐缓。

表2.各组大鼠静息状态肛温(℃)

注：a：空白与模型组差异有统计学意义(P＜0.01)；b：空白与模型组差异有统计学意义(P＜0.05)；c：21天模型与28天模型差异有统计学意义(P＜0.05)。

(4)大鼠平均饮水量变化

空白组平均每只大鼠每日饮水量平稳，模型组明显高于空白组，以第二周、第三周的增加最为显著，第四周增加趋势减缓(见表3)。

表3.每只每日平均饮水量(ml/d只)

(5)大鼠平均摄食量变化

空白组平均每只大鼠每日摄食量平稳，模型组明显高于空白组，以第二及第三周增加最为显著，第四周增加趋势减缓(见表4)。

表4.平均每只每日平均摄食量(g/d只)

(6)血常规结果

血常规结果表明(见表5)：红细胞、白细胞、血红蛋白及血小板计数，空白组与14天、21天、28天模型组均无明显差异(P＞0.05)，但21天模型组的红细胞压积高于空白组(P＜0.05)。可见造模后大鼠出现短期红细胞压积升高，血液浓缩。

表5.各组血常规比较

注：a：空白组与模型组差异无统计学意义(P＞0.05)；b：空白组与模型组差异有统计学意义(P＜0.05)。

(7)甲状腺激素结果

甲状腺激素的结果表明(见表6)：与空白组相比，14天模型组大鼠血清中FT3浓度升高，差异显著(P<0.05)，FT4、TSH浓度差异不显著；21天模型组大鼠血清中FT3浓度明显升高，差异极显著(P<0.01)，TSH浓度降低，差异显著(P<0.05)，FT4浓度升高，差异显著(P<0.05)；28天模型组大鼠血清中FT3、FT4浓度明显升高，差异极显著(P<0.01)，TSH浓度明显降低，差异极显著(P<0.01)。说明左甲状腺素钠片灌胃21天，即可诱发雌鼠甲状腺毒症改变。

表6.各组FT3、FT4、TT、TSH比较

注：a：空白组与模型组差异有统计学意义(P＜0.01)；b：空白组与模型组差异有统计学意义(P＜0.05)。

(8)凝血功能结果

凝血指标结果表明(见表7)：相比于空白组，21天模型组PT时间缩短，说明左甲状腺素钠片诱导雌鼠外源性凝血系统出现暂时紊乱；28天模型组较于空白组，有缩短趋势，但无统计学差异(P＞0.05)；14天模型组较于空白组，TT时间缩短，且差异具有统计学意义(P＜0.05)；FIB各组间均无统计学差异。

表7.各组PT、APTT、TT、FIB比较

注：a：空白与模型组差异有统计学意义(P＜0.05)。

(9)血清VEGF、E2、5-HT、AMH水平

血清VEGF、E2、5-HT、AMH结果表明(见表8)：与空白组相比，14天模型组大鼠血清中5-HT、E2、VEGF、AMH浓度差异不显著，不具备统计学意义；21天模型组大鼠血清中E2浓度升高，差异显著(P<0.05)，5-HT浓度降低，差异显著(P<0.05)，VEGF、AMH浓度差异不显著，不具备统计学意义；28天模型组大鼠血清中E2浓度明显升高，差异极显著(P<0.01)，5-HT浓度明显降低，差异极显著(P<0.01)，VEGF浓度升高，差异显著(P<0.05)，AMH差异不显著。说明左甲状腺素钠片灌胃21天，可诱发雌鼠出现肝郁证候和E2的异常。

表8.各组血清VEGF、E2、5-HT、AMH比较

注：a：空白与模型组差异有统计学意义(P＜0.01)；b：空白与模型组差异有统计学意义(P＜0.05)。

(10)子宫组织匀浆NO，ET-1水平

子宫组织匀浆NO、ET-1、NO\ET-1结果表明(见表9)：给予左甲状腺素钠片灌胃雌鼠14天模型组、21天模型组与空白组比较子宫组织匀浆NO、ET-1、NO\ET-1均无统计学意义(P＞0.05)；28天模型组ET-1有上升趋势，但差异无统计学意义，NO含量及NO\ET-1比值显著升高(P＜0.05)，其中NO含量极显著(P＜0.01)。说明左甲状腺素钠片灌胃28天，可诱发雌鼠子宫血管舒张。

表9.各组子宫组织匀浆NO、ET-1含量比较

注：a：空白与模型组差异有统计学意义(P＜0.01)；b：空白与模型组差异有统计学意义(P＜0.05)。

(11)卵巢各级卵泡计数

卵巢各级卵泡计数结果表明(见表10)：各组各级卵泡计数差异均不显著，不具备统计学意义。说明左甲状腺素钠片混悬液灌胃28天对雌鼠卵泡无明显改变。

表10.各组卵巢各级卵泡计数比较

(12)子宫内膜厚度和微血管计数

子宫内膜厚度和微血管计数结果表明(见表11)：各组差异不显著，无统计学意义。

表11.各组子宫内膜厚度、微血管计数比较

上述实验结果可知：

本实验中给予SD雌鼠左甲状腺素钠片(1mg/kg剂量，连续灌胃21天)即可诱使血清FT3、FT4升高，TSH下降，并随着造模时间的延长而加重，说明左甲状腺素钠片诱发的甲状腺毒症模型造模成功。

实验中还发现模型雌鼠血清5-HT的含量明显低于空白组。5-HT作为神经调节系统的单胺类递质之一，是机体调控情绪、行为活动，精神状态的重要物质，参与记忆、食欲和性功能等多方面的调节。5-HT紊乱涉及肠易激综合征等消化系统疾病和焦虑症，抑郁症等精神类疾病。目前普遍认为抑郁症等精神疾病发生机制为5-HT水以及5-HT受体数量和功能降低有关，为气郁证模型的重要的客观化评价标准之一。肝郁所致心情抑郁、易怒善哭，多与现代医学抑郁、焦虑等情志刺激状态有关，可引起神经、内分泌、免疫、消化等系统的病理改变。且女子以肝为先天，肝主疏泄，生理上经，孕，产，乳均依赖肝血的充养，在情志上依赖肝气畅达情绪，有研究通过经典的慢性束缚应激造模成功的肝郁大鼠，不同于肝郁证雄鼠垂体下丘脑存在反馈性调节，甲状腺功能低下的情况，肝郁证型的雌鼠的甲状腺机能表现亢进，肝郁证的雌鼠模型导致TSH降低，FT3、FT4的升高。故在本实验中，血清5-HT在模型组显著降低说明该动物模型存在肝郁气滞的证候表现。

同时从大鼠的一般情况上分析，模型组相比于空白组出现了肛温显著升高，体质量的下降，饮水量摄食量的增加以及雌鼠情绪过激、好斗、毛须竖起等行为活动。根据热证临床表现中的一级诊断标准：发热、口渴欲饮、烦躁，舌红、苔黄燥少津、脉数以及《中药新药临床研究指导原则》、《实验动物学》，将肛温，体质量，行为活动，饮水量作为热证的体征指标，说明大鼠亦出现了明显的热症表现。故模型大鼠具有肝郁证候外同时兼有血热之象。

从凝血指标及血常规实验结果上分析，血常规中的红细胞计数，白细胞计数，血红蛋白，血小板数目均未发现显著异常，未出现甲亢后期常见贫血及血小板减少的并发症，但红细胞压积于第三周模型中出现暂时升高，且差异具有统计学意义。红细胞压积是指红细胞在血液中所占的容积比值，其升高见于大量呕吐、腹泻等体液丢失严重患者，是反映血液浓缩程度和影响血液黏度的重要指标，红细胞压积的短暂升高说明随着模型组血热病久后津液耗损导致血液浓缩。此外各组及组间对比凝血指标后发现，14天模型组出现暂时TT缩短，21天模型组出现短期PT时间缩短，28天模型组的APTT有缩短趋势，但无统计学差异，说明左甲状腺素钠片诱导雌鼠凝血系统出现暂时紊乱。

根据以上大鼠一般情况及血常规，凝血指标综合分析认为模型大鼠出现热入血分，煎灼津液导致血液浓缩，血液粘稠致瘀，形成瘀血的病理产物的证候属性演变过程。实验过程中还发现模型组大鼠较空白组脱毛明显，推测可能血热生风，风盛血燥，发失所养而脱落。

综上，左甲状腺素钠片诱导的甲状腺毒症早期证候以血热为主，火热之邪深入血分，耗伤阴血，炼血为瘀，瘀热交结阻于脉道，脉道失于滑利，致血行滞涩，而后形成瘀热交结的病机特征。本发明研究发现，利用左甲状腺素钠片可以做制备甲状腺毒症动物模型，该动物模型的证型为肝郁血热夹瘀，可作为一种具有复合证候特征的气郁血热夹瘀证候模型，为中医研究及中药用药筛选提供一种新的方法。

实施例2、用本发明气郁血热夹瘀证候模型筛选预防和/或治疗气郁血热夹瘀证候的药物

(1)按照实施例1的制备方法建立气郁血热夹瘀证候模型；

(2)将候选药物施用于气郁血热夹瘀证候模型；

(3)观察候选药物对各种指标的影响情况，评价潜在的预防和/或治疗气郁血热夹瘀证候的药物。

实施例3、用本发明甲状腺毒症候模型筛选预防和/或治疗甲状腺毒症的药物

(1)按照实施例1的制备方法建立甲状腺毒症模型；

(2)将候选药物施用于甲状腺毒症模型；

(3)观察候选药物对各种指标的影响情况，评价潜在的预防和/或治疗甲状腺毒症的药物。

综上，本发明利用左甲状腺素钠诱导构建了一种甲状腺毒症模型，该动物模型的证型为肝郁血热夹瘀，可作为一种具有复合证候特征的气郁血热夹瘀证候模型。本发明为中医研究提供了一种新的证候模型，为中药用药筛选提供了一种新的方法，具有良好的应用前景。