一株降低血清支链氨基酸水平的罗伊氏乳杆菌菌株LN0214及其衍生产品和应用

摘要

本发明提供了一株降低血清支链氨基酸水平的罗伊氏乳杆菌菌株LN0214及其衍生产品和应用，属于微生物技术领域。本发明研究无菌动物血清中，支链氨基酸水平明显增加，使用罗伊氏乳杆菌LN0214联合抗生素处理小鼠和无菌小鼠中定植后使血清中支链氨基酸水平有效降低。同时体外研究表明，罗伊氏乳杆菌LN0214有效上调支链氨基酸代谢相关酶基因表达和代谢产物含量升高。鉴于LN0214降低支链氨基酸水平，因此罗伊氏乳杆菌LN0214可用于制备糖尿病和胰岛素抵抗的药物，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株降低血清支链氨基酸水平的罗伊氏乳杆菌菌株LN0214及其衍生产品和应用。

背景技术

支链氨基酸(BCAA)，包括亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸，是人类和动物所需的必需氨基酸。BCAA不仅在蛋白质代谢中发挥重要作用，并且具有多种生理代谢功能，例如，BCAA能刺激胰岛素和胰高血糖素分泌，肥胖和2型糖尿病患者血液循环中BCAA水平显著升高，而且，血液循环中高水平的BCAA可导致胰岛素抵抗或者2型糖尿病

近年来，大量研究表明胰岛素抵抗和糖尿病与肠道微生物密切相关，肠道微生物群失调是胰岛素抵抗和糖尿病快速发展的一个重要因素。在胰岛素抵抗个体中，许多微生物合成BCAA的潜力增加，普雷沃氏菌和普通拟杆菌是微生物合成BCAA主要的驱动者。

而罗伊氏乳杆菌存在于所有哺乳动物和脊椎动物肠道内，是国际上公认的新型益生乳酸菌。目前研究发现，罗伊氏乳杆菌能缓解代谢综合征、降低脂多糖浓度等方面。但迄今为止，罗伊氏乳杆菌对血清BCAA水平以及 BCAA代谢的影响未见报道。

参考文献：

[1]Lynch CJ,Adams SH.Branched-chain amino acids in metabolicsignalling and insulin resistance.Nat Rev Endocrinol(2014)10(12):723–36. doi:10.1038/nrendo.2014.171

[2]Zhou M,Shao J,Wu C-Y,Le Shu,Dong W,Liu Y,et al.Targeting BCAACatabolism to Treat Obesity-Associated Insulin Resistance.Diabetes (2019)68(9):1730–46.doi:10.2337/db18-0927

[3]Nilsen MS,Jersin

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株降低血清支链氨基酸水平的罗伊氏乳杆菌菌株LN0214及其衍生产品和应用，对血清BCAA降低和BCAA代谢增强对胰岛素抵抗和糖尿病的改善作用。

本发明提供了一株降低血清支链氨基酸水平的罗伊氏乳杆菌(Lactobacilusreuteri)菌株LN0214，所述罗伊氏乳杆菌菌株LN0214的保藏编号为CGMCCNo.24586。

本发明提供了一种降低血清支链氨基酸水平的菌剂，活性成分包括所述罗伊氏乳杆菌菌株LN0214。

优选的，所述罗伊氏乳杆菌菌株LN0214的活菌浓度为1×10

本发明提供了所述罗伊氏乳杆菌菌株LN0214或所述菌剂在制备降低血清支链氨基酸水平或提高血清支链氨基酸代谢中的应用。

优选的，所述支链氨基酸包括以下一种或几种：亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸。

优选的，所述提高血清支链氨基酸代谢包括增加支链氨基酸代谢产物含量和提高支链氨基酸代谢通路相关基因的表达量。

优选的，所述支链氨基酸代谢产物包括乙酰COA和/或琥珀酰COA含量；

支链氨基酸代谢通路相关基因包括以下一种或几种基因：BCAT1、 BCAT2、BCKDHA、BCKDHB和PPM1K。

本发明提供了所述罗伊氏乳杆菌菌株LN0214或所述菌剂在制备防治糖尿病和/或胰岛素抵抗的药物中的应用。

优选的，所述药物利用罗伊氏乳杆菌菌株LN0214降低支链氨基酸水平，促进支链氨基酸的代谢，实现防治糖尿病和/或胰岛素抵抗。

优选的，所述药物包括口服剂。

本发明提供了一株降低血清支链氨基酸水平的罗伊氏乳杆菌(Lactobacilusreuteri)菌株LN0214，保藏编号为CGMCC No.24586。本发明通过分析无菌猪和无菌鼠与对照组中血清氨基酸水平，得到支链氨基酸呈显著性。通过抗生素清除小鼠肠道微生物，筛选得到支链氨基酸呈显著变化的微生物，经过微生物丰度与支链氨基酸水平相关性分析，筛选得到罗伊氏乳杆菌菌株LN0214。经过罗伊氏乳杆菌菌株LN0214定植实验表明，罗伊氏乳杆菌菌株LN0214降低了血清中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸三种BCAA 水平。同时罗伊氏乳杆菌LN0214对支链氨基酸代谢有促进作用，提高了支链氨基酸代谢途径基因表达量，提高支链氨基酸代谢终产物乙酰COA和琥珀酰COA的含量。

附图说明

图1为无菌猪血清BCAA水平；

图2为无菌小鼠血清BCAA水平；

图3为五种抗生素处理小鼠血清BCAA水平；

图4为氨苄青霉素和粘菌素处理小鼠16SrDNA结果与血清BCAA水平相关性分析。

图5为联合抗生素处理小鼠定植罗伊氏乳杆菌LN0214血清BCAA水平；

图6为无菌小鼠定植罗伊氏乳杆菌LN0214血清BCAA水平；

图7为IPEC-J2细胞BCAT1，BCAT2，BCKDHA，BCKDHB，PPMIK基因表达量；

图8为IPEC-J2细胞内BCAA含量；

图9为IPEC-J2细胞内BCAA代谢物乙酰COA和琥珀酰COA含量。

生物材料保藏存活信息

罗伊氏乳杆菌(Lactobacilusreuteri)，本发明所述的罗伊氏乳杆菌菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为 2022.3.24。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC No.24586。

具体实施方式

本发明提供了一株降低血清支链氨基酸水平的罗伊氏乳杆菌(Lactobacilusreuteri)菌株LN0214，所述罗伊氏乳杆菌菌株LN0214的保藏编号为CGMCCNo.24586。

在本发明中，罗伊氏乳杆菌菌株LN0214的繁殖方法，优选包括以下步骤：⑴菌种复苏：-80℃取出菌种复温溶解，37℃恒温厌氧条件下，在MRS 培养基中培养繁殖，约18h达到稳定；⑵传代：取适量步骤⑴中MRS与菌株混合液，加入MRS培养基中，37℃培养繁殖。

本发明提供了一种降低血清支链氨基酸水平的菌剂，活性成分包括所述罗伊氏乳杆菌菌株LN0214。

在本发明中，所述罗伊氏乳杆菌菌株LN0214的活菌浓度优选为1× 10

本发明对所述菌剂的制备方法，优选包括以下步骤：

罗伊氏乳杆菌LN0214在37℃恒温厌氧条件下培养至对数生长期(约 16h)，3000rpm，5min离心5min，收集菌体，PBS重悬菌体，使菌浓度达到 1×10

本发明提供了所述罗伊氏乳杆菌菌株LN0214或所述菌剂在制备降低血清支链氨基酸水平或提高血清支链氨基酸代谢中的应用。

在本发明中，所述支链氨基酸优选包括以下一种或几种：亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。

在本发明中，通过所述罗伊氏乳杆菌菌株LN0214在动物肠道中定植，与对照组相比，能够显著降低血清支链氨基酸水平。经过细胞实验表明，所述罗伊氏乳杆菌菌株LN0214能够显著提高血清支链氨基酸代谢优选包括增加支链氨基酸代谢产物含量和提高支链氨基酸代谢通路相关基因的表达量。所述支链氨基酸代谢产物优选包括乙酰COA和/或琥珀酰COA含量。所述支链氨基酸代谢通路相关基因包括以下一种或几种基因：BCAT1，BCAT2，BCKDHA，BCKDHB和PPM1K。

本发明提供了所述罗伊氏乳杆菌菌株LN0214或权利要求2或3所述菌剂在制备防治糖尿病和/或胰岛素抵抗的药物中的应用。

鉴于BCAA被认为是糖尿病风险预测因子，所述药物优选利用罗伊氏乳杆菌菌株LN0214降低支链氨基酸水平，促进支链氨基酸的代谢，实现防治糖尿病和/或胰岛素抵抗。所述药物优选包括口服剂。本发明对所述口服剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知涉及微生物的口服剂药物的制备方法即可。所述罗伊氏乳杆菌菌株LN0214的有效浓度为1×10

下面结合实施例对本发明提供的一株降低血清支链氨基酸水平的罗伊氏乳杆菌菌株LN0214及其衍生产品和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本实施例选用11头无特定病原体的无菌新生仔猪(重庆国家现代畜牧业示范区实验用猪工程中心)，其中5头始终保持无菌状态下饲养(GF组)，另外6头在7日龄进行粪菌移植(猪源粪菌，1mL/d)，连续3天，作为对照组。所有动物均始终保持在无菌隔离器内饲养，42日龄时采集血清，代谢组检测BCAA含量。

代谢组前处理如下：

200μL血清样品中加入800μL蛋白沉淀剂甲醇-乙腈混合液(甲醇：乙腈＝1:1)，涡旋振荡2min，冰水浴超声10min。

离心10min(14500rpm，4℃)，取上清，抽真空离心机中抽真空至挥发干。

200μL甲醇水(甲醇：水＝1:1，体积比)复溶沉淀，涡旋振荡溶解，冰浴超声10min，离心10min(14500rpm，4℃)，取上清装入带有支脚内衬管的LC-MS进样小瓶，-20℃保存至上机分析。

代谢组分析条件:

使用Thermo Fisher Scientific UPLC系统，主要参数为：流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为100％乙腈，流速0.2mL/min，柱温35℃，进样量2μL；流动相B初始比例是5％，然后依次增加到7％，13％和50％，分别用时3 分钟，2分钟和10分钟，最后，流动相B比例快速下降到5％，用时1分钟，并且在5％的比例维持2分钟。

结果见图1，与对照组相比，GF组血清仅亮氨酸含量显著增加、缬氨酸和异亮氨酸均未呈显著性差异。

实施例2

无菌鼠血清中BCAA水平变化

考虑到不同物种的差异，用无菌小鼠重复了实施例1实验，使用无特定病原体的SPF小鼠和无菌(GF)小鼠均是来自于第三军医大学(中国重庆) 实验动物中心的KM小鼠，4周龄，每组雌雄各10只小鼠，SPF组作为对照组。GF组与SPF组统一饲喂无菌饲粮，8周龄时采集血清。代谢组检测BCAA 含量，代谢组前处理同实施例1。

结果见图2，与SPF组相比，GF组血清亮氨酸和缬氨酸含量显著增加，而异亮氨酸未呈显著性差异。

实施例3

不同抗生素处理小鼠

实施例1和2证明无菌动物血清中BCAA含量增加。为了探明引起这一变化的原因，使用了五种抗生素(新霉素、氨苄青霉素、粘菌素、甲硝唑， 1mg/mL，万古霉素，0.5mg/mL)分别处理小鼠。本实施例所用小鼠为ICR 雌鼠(6周龄，辽宁长生生物技术股份有限公司)，分为6个组，每个组12 个重复，五种抗生素饮水添加，添加周期为2个周，8周龄时收集粪便和血清。

血清代谢组检测

血清样使用代谢组检测其BCAA含量，代谢组前处理同实施例1。

结果见图3，与对照组相比，氨苄青霉素和粘菌素处理小鼠组，其血清三种BCAA水平显著增加，而新霉素处理小鼠组血清中BCAA水平均无显著变化，甲硝唑和万古霉素处理小鼠血清中亮氨酸和异亮氨酸水平无显著变化，缬氨酸水平显著增加。证明与氨苄青霉素和粘菌素关联的微生物与血清BCAA水平变化有关。

16SrDNA测序

对照组、粘菌素组和氨苄青霉素组粪便样送北京诺和致源公司进行 16SrDNA测序，测序结果与血清BCAA水平进行相关性分析。

结果见图4，与对照组相比，粘菌素处理组鼠乳杆菌、约氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌丰度显著降低，其中，鼠乳杆菌与血清BCAA水平呈显著负相关。氨苄青霉素处理组，鼠乳杆菌、约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和肠乳杆菌丰度显著降低，并且均与血清BCAA水平显著负相关。

实施例4

罗伊氏乳杆菌LN0214菌株的分离方法

收集普通ICR小鼠粪便，每100mg粪便中加入1ml PBS制成粪菌悬液；

粪菌悬液稀释为1×10

挑取单菌落，在MRS固体培养基平板上划线纯化，重复三次后进行菌种鉴定(擎科生物)；

重复以上步骤，对筛选的菌株进行16S鉴定，得到罗伊氏乳杆菌LN0214 菌株(SEQID NO:13)。

实施例5

联合抗生素处理小鼠定植鼠乳杆菌和罗伊氏乳杆菌

基于实施例3，我们选用鼠乳杆菌F5和罗伊氏乳杆菌LN0214进行定植。本实施例所使用的小鼠为6周龄ICR公鼠，连续5天饮水添加联合抗生素(新霉素、氨苄青霉素、链霉素、甲硝唑，1mg/mL，万古霉素，0.5mg/mL)，停药2天，处理组分别灌喂鼠乳杆菌F5和罗伊氏乳杆菌LN0214(1×10

结果见图5，定植罗伊氏乳杆菌LN0214后，血清缬氨酸水平显著降低。

实施例6

无菌小鼠定植鼠乳杆菌F5和罗伊氏乳杆菌LN0214

基于实施例5，用无菌小鼠进一步验证。本实施例采用6周龄无菌小鼠，来自于华中农业大学(中国武汉)实验动物中心的KM小鼠(每组雌雄各6 只)。在实验开始的第一天和第三天，处理组分别灌喂鼠乳杆菌F5和罗伊氏乳杆菌LN0214(1×10

结果见图6，定植鼠乳杆菌F5和罗伊氏乳杆菌LN0214后，血清中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸三种BCAA水平显著降低，综合实施例5与本实施例可知，选择罗伊氏乳杆菌LN0214用于后续实施例。

实施例7

罗伊氏乳杆菌LN0214对BCAA代谢的影响

基于实施例5和6，罗伊氏乳杆菌LN0214降低了小鼠血清BCAA水平，在本实施例，我们进行探究罗伊氏乳杆菌LN0214对BCAA代谢的影响。本实施例使用猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)，罗伊氏乳杆菌LN0214以及10％的罗伊氏乳杆菌LN0214 24h培养上清与IPEC-J2细胞共培养4h，收集细胞提取RNA检测BCAA代谢相关酶基因表达。罗伊氏乳杆菌LN021424h培养上清与IPEC-J2细胞共培养4h，收集细胞，代谢组检测胞内BCAA水平变化。罗伊氏乳杆菌LN021424h培养上清与IPEC-J2细胞共培养4h，收集细胞检测ELISA(乙酰COA和琥珀酰COA)。

RT-PCR分析：

收集细胞样品，按照总RNA提取试剂盒(EZBioscience)说明书提取细胞RNA，参照EZBioscience反转录试剂盒说明书制备并反转录cDNA，大致过程如下：

去除基因组DNA反应：

取1μg总的RNA，加入2μL gDNA Remover充分混匀，使用离心管机短暂离心到管底，室温静置反应5分钟，反应结束后置于冰上。

反转录反应：

上述步骤反应结束后，按照以下体系配制逆转录反应体系，即向上述gDNARemover处理过的总RNA中加入5μL 4×RTMasterMix，然后加入 ddH2O补足至20μL：

反应程序为37℃15min，95℃5s，4℃保存。

qRT-PCR检测

qRT-PCR的过程参照前期研究进行，β-肌动蛋白被用作参考基因以标准化靶基因的转录水平。特异性引物序列如表1所示。基因的相对表达水平参照公式2

表1引物序列

细胞代谢组检测

收集细胞后，生理盐水重悬细胞并通过反复冻融使细胞破碎，2000×g 离心10分钟，取上清进行代谢组前处理。代谢组前处理和代谢组分析条件同实施例1。

酶联免疫吸附测定(ELISA)：

ELISA样品为细胞样，样品制备方法如下：细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；收集的细胞用冷的 PBS洗涤3次。每1×10

1)琥珀酰辅酶A(SCoA)定量检测

检测方法参考睿信生物(福建泉州)猪琥珀酰辅酶A(SCoA)定量检测试剂盒说明书，具体操作如下：

试剂准备

使用前，所有的组分都要至少复温60min，确保充分复温到室温。

浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按1:20稀释，即1 份的浓缩洗涤液，添加19份的蒸馏水。

底物：底物液A和B，在使用前，按1:1体积充分混合，混合后15分钟内使用。

操作程序

所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。

1、按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。

2、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。设置标准品孔、0值孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL，0值孔加样本稀释液50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本50μL。

3、除空白孔外，标准品孔、0值孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶(HRP) 标记的检测抗体100μL。

4、用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置20S，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。

6、将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37恒温箱温育15min。

7、所有孔加入终止液50μL，在酶标仪450nm读取各孔吸光度(OD值)。

结果计算

以标准品浓度做为纵坐标6个标准品孔(校准品浓度依次为：

160、80、40、20、10、5ng/mL)，加1个0值孔，共7个浓度点)，对应的吸光度(OD值)作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic 曲线拟合(4pl))，创建标准曲线方程，通过样本的吸光度(OD值)，利用方程计算样品的浓度值。

乙酰辅酶A(ACA)定量检测

检测方法参考睿信生物(福建泉州)猪乙酰辅酶A(ACA)定量检测试剂盒说明书，具体操作如下：

试剂准备

1、使用前，所有的组分都要至少复温60min，确保充分复温到室温。

2、浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按1:20稀释，即 1份的浓缩洗涤液，添加19份的蒸馏水。

3、底物：底物液A和B，在使用前，按1:1体积充分混合，混合后15 分钟内使用。

操作程序

所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。

1、按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。

2、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。设置标准品孔、0值孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL，0值孔加样本稀释液50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本50μL。

3、除空白孔外，标准品孔、0值孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶(HRP) 标记的检测抗体100μL。

4、用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置20S，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。

6、将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37恒温箱温育15min。

7、所有孔加入终止液50μL，在酶标仪450nm读取各孔吸光度(OD值)。

结果计算

以标准品浓度做为纵坐标6个标准品孔(校准品浓度依次为：40、20、 10、5、2.5、1.25ng/ml)，加1个0值孔，共7个浓度点)，对应的吸光度(OD 值)作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合(4pl))，创建标准曲线方程，通过样本的吸光度(OD值)，利用方程计算样品的浓度值。

结果见图7～图9，罗伊氏乳杆菌LN021424h培养基上清与IPEC-J2细胞共培养4h，显著提高了BCAA代谢相关酶的基因表达，并且并且胞内BCAA 含量显著降低，另外增加了细胞内BCAA代谢终产物乙酰COA和琥珀酰 COA的含量。由此可见，罗伊氏乳杆菌LN0214提高了BCAA代谢。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株降低血清支链氨基酸水平的罗伊氏乳杆菌菌株LN0214及其衍生产品和应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gactgcaaga tgggagggaa t 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aatgatgcca tctagcgggg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctcgtgggct tttgttccgt 20

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<212> DNA

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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