一种用于嗜肺巴斯德杆菌的冻干保护剂、冻干粉及其制备方法

摘要

本发明属于菌种保护剂的技术领域，具体涉及一种用于嗜肺巴斯德杆菌的冻干保护剂、冻干粉及其制备方法。所述冻干保护剂的组成包括胎牛血清、蔗糖、羧甲基纤维钠、脱脂奶粉以及甘油；所述嗜肺巴斯德杆菌为ATCC标准菌株中的ATCC35149嗜肺巴斯德杆菌；用于嗜肺巴斯德杆菌冻干保护剂具有体积小、含菌量高、稳定性高、保存时间长、便于保藏、运输，使用方便等优点，所述嗜肺巴斯德杆菌冻干保护剂能改善目前嗜肺巴斯德杆菌能力验证样品活菌率不高、不稳定等难题，促进嗜肺巴斯德杆菌能力验证计划开展，具有重要的意义和应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于菌种保护剂的技术领域，具体涉及一种用于嗜肺巴斯德杆菌的冻干保护剂、冻干粉及其制备方法。

背景技术

嗜肺巴斯德杆菌(Pasteurella pneumotropica)属于巴斯德菌科巴斯德菌属，为革兰阴性短杆或球杆菌，是一种条件致病菌，会导致免疫缺陷小鼠严重及致命的感染，在动物免疫机制受到抑制和应激因子的作用下，容易发生呼吸道疾病，还可与仙台病毒、肺支原体等呼吸道病原微生物合并感染影响实验动物质量及对实验结果产生严重干扰，也是人类污染的潜在来源。该疾病的临床表现包括皮下脓肿、呼吸道定植和全身感染。国家标准GB14922.2-2011《实验动物微生物等级及监测》将其列为无特定病原体级大小鼠、豚鼠、兔等实验动物必须排除的特定病原体之一。

目前在病原检测能力验证计划中，多选择此类发病率高，对动物危害大的病原进行能力验证评价，以便评价质量检测实验室对病原检测的能力。

但嗜肺巴斯德杆菌对温度敏感，低温或常温不易保存，很容易失活，给能力验证样品制备和运输带来极大不便，制约了嗜肺巴斯德杆菌能力验证样品制备及嗜肺巴斯德杆菌检测能力验证计划的开展，因此，本发明提供了一种冻干保护剂，用于改善目前嗜肺巴斯德杆菌能力验证样品活菌率不高、不稳定等难题。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于嗜肺巴斯德杆菌的冻干保护剂、冻干粉及其制备方法，所述冻干保护剂，能改善目前嗜肺巴斯德杆菌能力验证样品活菌率不高、不稳定等难题，促进嗜肺巴斯德杆菌能力验证计划开展，具有重要的意义和应用价值。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种用于嗜肺巴斯德杆菌的冻干保护剂，所述冻干保护剂的组成包括胎牛血清、蔗糖、羧甲基纤维钠、脱脂奶粉以及甘油；

所述嗜肺巴斯德杆菌为ATCC标准菌株中的ATCC35149嗜肺巴斯德杆菌；

按质量分数计，所述胎牛血清占5～10％、蔗糖占5～8％、羧甲基纤维钠占0～1％、脱脂奶粉占0～20％、甘油占0～1％，生理盐水补足至100％；

所述羧甲基纤维钠、脱脂奶粉以及甘油的用量均不为0；

优选地，所述冻干保护剂中，所述胎牛血清占10％、蔗糖占8％、羧甲基纤维钠占1％、脱脂奶粉占20％、甘油占1％；

所述胎牛血清为Gibco低内毒素水平胎牛血清FBS；

所述脱脂奶粉为BD Difco TM skim Milk脱脂奶粉，其具有极佳溶解性、酪蛋白含量适中、脱脂效果彻底的特点；

所述冻干保护剂的悬浮基质为生理盐水。

本发明还提供了一种嗜肺巴斯德杆菌冻干粉，其为将嗜肺巴斯德杆菌菌液与上述冻干保护剂混合，进行冻干得到。

本发明还提供了一种嗜肺巴斯德杆菌冻干粉的制备方法，包括如下步骤：

1)制备冻干保护剂：将胎牛血清、蔗糖、羧甲基纤维钠、脱脂奶粉、甘油以及生理盐水按照配方混合，搅拌均匀，即为冻干保护剂；

2)将嗜肺巴斯德杆菌与之混合分装至冻存管中，-80℃预冷1h后放置于真空冷冻干燥机，-60℃真空冻干15h，即为嗜肺巴斯德杆菌冻干粉。

本发明的有益效果如下：

本发明的用于嗜肺巴斯德杆菌冻干保护剂以及冻干粉，具有体积小、含菌量高、稳定性高、保存时间长、便于保藏、运输，使用方便等优点，所述嗜肺巴斯德杆菌冻干保护剂能改善目前嗜肺巴斯德杆菌能力验证样品活菌率不高、不稳定等难题，促进嗜肺巴斯德杆菌能力验证计划开展，具有重要的意义和应用价值。

本发明的冷冻干燥保护剂制备的嗜肺巴斯德杆菌干粉的常温保存1周活菌存活率可达到99.5％以上。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例1

一种用于嗜肺巴斯德杆菌的冻干保护剂：

胎牛血清6％、蔗糖5％、羧甲基纤维钠0.2％、脱脂奶粉10％、甘油0.5％，生理盐水78.3％；

所述胎牛血清为Gibco低内毒素水平胎牛血清FBS；

所述脱脂奶粉为BD Difco TM skim Milk脱脂奶粉。

实施例2

一种用于嗜肺巴斯德杆菌的冻干保护剂：

胎牛血清8％、蔗糖6％、羧甲基纤维钠0.5％、脱脂奶粉5％、甘油0.2％，生理盐水80.3％。

实施例3

一种用于嗜肺巴斯德杆菌的冻干保护剂：

胎牛血清5％、蔗糖8％、羧甲基纤维钠1％、脱脂奶粉15％、甘油0.8％，生理盐水70.2％。

实施例4

一种用于嗜肺巴斯德杆菌的冻干保护剂：

胎牛血清8％、蔗糖7％、羧甲基纤维钠0.5％、脱脂奶粉10％、甘油1％，生理盐水73.5％。

实施例5

一种用于嗜肺巴斯德杆菌的冻干保护剂：

胎牛血清5％、蔗糖10％、羧甲基纤维钠1％、脱脂奶粉20％、甘油1％，生理盐水63％。

实施例6

一种用于嗜肺巴斯德杆菌的冻干保护剂：

胎牛血清10％、蔗糖6％、羧甲基纤维钠0.6％、脱脂奶粉5％、甘油0.8％，生理盐水77.6％。

实施例7

一种用于嗜肺巴斯德杆菌的冻干保护剂：

胎牛血清10％、蔗糖6％、羧甲基纤维钠0.5％、脱脂奶粉5％、甘油1％，生理盐水77.5％。

实施例8

一种用于嗜肺巴斯德杆菌的冻干保护剂：

胎牛血清5％、蔗糖8％、羧甲基纤维钠0.8％、脱脂奶粉15％、甘油0.5％，生理盐水70.7％。

嗜肺巴斯德杆菌的复苏活化培养：将嗜肺巴斯德杆菌ATCC35149用接种环在血琼脂培养基平板中划线，(36±1)℃恒温培养18～20h。再用接菌针挑取平板上长出的单个菌接种至血琼脂培养基平板中划线，(36±1)℃恒温培养18～20h，完成嗜肺巴斯德杆菌的活化；

嗜肺巴斯德杆菌的种子液制备：将活化好的嗜肺巴斯德杆菌，用无菌接种针挑取平板上长出的单菌落接种至装有1mL生理盐水的灭菌离心管中，再用100uL移液枪吸取菌液涂抹至血琼脂培养基平板中，(36±1)℃恒温培养18～20h；

培养嗜肺巴斯德杆菌所用的血琼脂培养基平板配方如下：

蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂10～20g，蒸馏水1000ml，煮沸至充分溶解，经121℃高温高压灭菌15～20min待冷却至50℃左右时加入50ml抗凝羊血(除去纤维)或兔血。

对比例

设置7组对比例，与实施例5的冻干保护剂进行对照，成分以及比例如下所示。

表1对比例与实施例5的冻干保护剂对比

将以上培养得到的嗜肺巴斯德杆菌菌液分别与实施例5、对比例1～7所制备的冻干保护剂混合(菌液初始浓度均为4×10

将以上制备好的嗜肺巴斯德杆菌冻干粉分别放置在37℃、25℃和4℃下进行存活菌量检测和统计，测试不同配方组合对嗜肺巴斯德杆菌ATCC35149冷冻干燥保护的效果比较：

表2 37℃下嗜肺巴斯德杆菌的存活菌量(CFU/mL)

由表2可见，在37℃较高温的条件下，相比对比例，在不同稀释倍数以及随着时间的延长，本发明实施例配方更有助于嗜肺巴斯德杆菌的存活。

表3 25℃下嗜肺巴斯德杆菌的存活菌量(CFU/mL)

由表3可见，在25℃的常温条件下，相比对比例，在不同稀释倍数以及随着时间的延长，本发明实施例配方更有助于嗜肺巴斯德杆菌的存活。

表4 4℃下嗜肺巴斯德杆菌的存活菌量(CFU/mL)

由表4可见，在4℃的低温条件下，相比对比例1～7，在不同稀释倍数以及随着时间的延长，通过本发明实施例所制备的冻干保护剂，除了有助于嗜肺巴斯德杆菌的长期保存，还提高了其存活率。