一种植物核心种质的抽样新策略

摘要

本发明涉及一种以分子标记为手段的植物核心种质的抽样新策略，属于生命科学领域。包括：(1)确定全部种质资源特有多态位点的种类；(2)找出含有特有多态位点的个体并计算拥有多态位点的频率；(3)根据核心种质的数量来确定候选者；(4)依据候选者在群体结构分析软件中的分类以及亲缘关系聚类图去除冗余个体。依据种质资源种群遗传结构分类结果、亲缘关系聚类结果和特有多态位点及其比例为取样策略获得核心种质样本。本发明提供的以分子标记为手段的植物核心种质的抽样新策略比目前国内外大多使用的随机抽样方法更科学、种质资源的遗传多样性能够最大化的得到保存并且冗余最低，本发明设计科学、简单、快捷，适合应用于各种植物核心种质资源的保存，对其他物种的核心种质资源保存亦有重要的参考价值。

说明书

技术领域

本发明属于生命科学领域，具体涉及植物种质资源保存中核心种质抽样的新策略。

背景技术

生物种质资源是进行品种选育和遗传改良的物质基础，在遗传改良和生产发展中起着重要作用，对种质资源的收集、保护和利用，受到世界各国的高度重视(魏志刚，2009)。据不完全统计，目前全球植物资源保存已超过740万份(李洪果，2019)。为了集中有限的科研资源力量对优势种质资源进行评价和深入的研究，提高种质资源库的管理和利用水平，Frankel(1984)提出了“核心种质”概念，后来经科学家不断完善和发展(Brown 1989；Basigalup，1995；Casler，1995)，最终核心种质库被定义为能够最大程度代表种质库遗传多样性的种质子集(van Hintum，1999；Adifaizet al，2020；张欢，2019)。核心种质(corecollection)构建是指用一定方法从整个种质资源库中选出的一部分样本，能够以最小的种质资源数量和最少的重复，最大限度的代表整个遗传资源的多样性，以便在育种中能够目标明确地，更好的实现功能基因聚合(Frankel，1984；Brown，1989；吴涛，2020；Guardo，2019)。

核心种质构建方法有多种，以构建的物质基础(遗传多样性标记)分，可以分为：利用表型性状构建初级核心种质(向青，2012)、利用表型性状构建核心种质(艾叶，2019)、利用分子标记构建核心种质(燕丽萍，2019)、利用表型性状和分子标记相结合构建核心种质(鲁敏，2017)。

迄今为止，众多的研究并没有提供一个合理的取样比例和合适的核心种质规模。在国内外不同植物核心种质构建中，核心种质的比例为该物种全部收集品的5％-30％，一般为10％左右。构建核心种质时过高的抽样比率核心库可能仍会包含较高的冗余，反之则会导致重要核心种质多样性的丧失。核心库的抽样比率或大小与整个资源库的大小和遗传多样性有关。如果基础群体较小，但遗传多样性较高，则需采用较高的取样比率；反之则需采用较低的取样比率。根据中性多态位点的抽样理论，从一个有效群体中用10％的抽样比率抽取的子集能以95％的确性度保存原群体至少70％的多态位点。

对于上述抽样，目前国内外大多采用随机抽样策略，但是明显存在的一个问题即随机抽样会造成遗传漂变，那些特有多态位点会因此丢失而没有得到保存。

如何采取更科学的策略和方法来进行核心种质的抽样是摆在科学家面前的一个重要科学问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种以分子标记为手段的植物核心种质的抽样新策略，能够最大化保存遗传多样性以及最低的冗余。

本发明提供了一种以分子标记为手段的植物核心种质的抽样新策略，包括以下步骤：

1)确定全部种质资源特有多态位点的种类；

2)找出含有特有多态位点的个体并计算拥有多态位点的频率；

3)根据核心种质的数量来确定候选者；

4)依据候选者在群体结构分析软件中的分类以及亲缘关系聚类图去除冗余个体。

优选的，步骤1)中所述特有多态位点为SSR(微卫星)标记产生的。

优选的，步骤2)中所述寻找特有多态位点的个体及计算多态位点的频率采用的分析软件为非商业化软件GenAlEx 6.51b2(Rod Peakall and Peter Smouse，2018)。

优选的，步骤3)中所述核心种质的数量为10-30％。

优选的，步骤4)中所述群体结构分类分析软件为非商业化软件Structure 2.3.4(Jonathan K.Pritchard et.al.，2012)。

优选的，步骤4)中所述亲缘关系聚类图采用软件为非商业化软件MEGA_X_10.1.8(Sudhir Kumar et.al.，2020)。

最后依据种质资源种群遗传结构分类结果、亲缘关系聚类结果和特有多态位点及其比例为取样策略获得核心种质样本。

本发明的特点是：提供的以分子标记为手段的植物核心种质的抽样新策略比目前国内外大多使用的随机抽样方法更科学、种质资源的遗传多样性能够最大化的得到保存并且冗余最低，本发明设计简单、快捷，适合应用于各种植物核心种质资源的保存，对其他物种的核心种质资源保存亦有重要的参考价值。

本发明已经应用于国家自然科学基金“木本油料植物光皮木果实高产性状的全基因组选择育种策略研究”项目(31770767)中取得成功。

附图说明

图1为本发明程序框图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的一种以分子标记为手段的植物核心种质的抽样新策略进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

湖南省林业科学院、南京大学、广东省林业科学研究院等单位共同收集了中国特有木本油料植物光皮树种质资源265份材料，来源于湖南(HN)、广东(GD)、广西(GX)、江西(JX)、福建(FJ)、重庆(CQ)和贵州(GZ)等地。

上述所有样本新鲜叶片于2019年4-11月间采集完成，每个样本标号后装入自封袋中，放入装有干冰的泡沫盒带回实验室，将样品置于-80℃的超低温冰箱中备用。按常规方法提取所有样本DNA。采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，结合紫外分光光度计、Qubit荧光计检测DNA纯度与浓度。

用筛选出的29对多态性好、稳定性高的来自光皮树转录组测序数据的EST-SSR有效引物对全部265个样本DNA进行扩增分析，去除没有条带的样本后，实际用于数据分析的样本为224份。PCR产物使用ABI3730测序仪进行毛细管电泳检测，结合分子内标来分析片段大小，测序仪检测结果经Genemapper软件分析，获得毛细管电泳图。根据荧光检测的峰值得到片段大小信息，按样本和引物获得EST-SSR扩增产物大小矩阵。

采用非商业化GenAlEx 6.51b2软件分析得到光皮树种质资源各微卫星位点的基因频率、特有多态位点、Shannon信息指数和基因多样性指数等。

在检测的光皮树全部362个多态位点中，共发现133个特有多态位点，占36.74％。其中广东群体有7个、广西群体有6个、贵州群体2个、湖北群体1个、江西群体4个、重庆群体12个；湖南群体最多，高达87个。

用非商业化Structure 2.3.4(Jonathan K.Pritchard et.al.，2012)软件对224份光皮树种质资源29个EST-SSR微卫星位点，经过200000次Burn-in period和1200000重复计算，全部材料推测为5个类群。各类群个体间平均遗传距离(期望杂合度)分别为：0.8088(Q1)、0.5439(Q2)、0.5412(Q3)、0.5233(Q4)和0.5344(Q5)。

对224份光皮树种质资源进行聚类分析并构建UPGMA亲缘关系聚类图。

对有EST-SSR基因型分型信息的211株优树(224份材料中扣除1份灯台树、1份美国梾木、1份美国小梾木和10份杂交子代)分别按10％、20％和30％的比例进行抽样。即建立光皮树SW10(21株)、SW20(42株)和SW30(63株)三个核心种质各子集的样本数。

按照各群体原始种质资源所占的比例，各核心种质子集分配给每个群体的样本数如下：

SW1：广东(3株)、广西(1株)、贵州(1株)、湖北(2株)、湖南(8株)、江西(2株)、重庆(4株)；

SW2：广东(6株)、广西(2株)、贵州(3株)、湖北(3株)、湖南(17株)、江西(2株)、重庆(9株)；

SW3：广东(9株)、广西(3株)、贵州(4株)、湖北(5株)、湖南(25株)、江西(4株)、重庆(13株)。

依据上述全部种质资源STRUCTURE种群遗传结构分类结果、亲缘关系聚类结果和特有EST-SSR多态位点及其比例，以此为取样策略分别获得以下光皮树三个核心种质子集：

SW10核心种质子集：

SW10-01(G018)、SW10-02(G034)、SW10-03(G036)、SW10-04(GX09)、SW10-05(G370)、SW10-06(G304)、SW10-07(G369)、SW10-08(G102)、SW10-09(G113)、SW10-10(G114)、SW10-11(G129)、SW10-12(G213)、SW10-13(G324)、SW10-14(G379)、SW10-15(G407)、SW10-16(G012)、SW10-17(G016)、SW10-18(G396)、SW10-19(G509)、SW10-20(G515)、SW10-21(G563)

SW20核心种质子集：

SW20-01(G018)、SW20-02(G029)、SW20-03(G034)、SW20-04(G036)、SW20-05(G039)、SW20-06(G059)、SW20-07(GX09)、SW20-08(GX11)、SW20-09(G303)、SW20-10(G313)、SW20-11(G370)、SW20-12(G304)、SW20-13(G369)、SW20-14(G401)、SW20-15(G102)、SW20-16(G113)、SW20-17(G114)、SW20-18(G129)、SW20-19(G131)、SW20-20(G202)、SW20-21(G212)、SW20-22(G213)、SW20-23(G301)、SW20-24(G306)、SW20-25(G324)、SW20-26(G331)、SW20-27(G352)、SW20-28(G377)、SW20-29(G379)、SW20-30(G383)、SW20-31(G407)、SW20-32(G012)、SW20-33(G016)、SW20-34(G396)、SW20-35(G509)、SW20-36(G510)、SW20-37(G514)、SW20-38(G515)、SW20-39(G524)、SW20-40(G537)、SW20-41(G538)、SW20-42(G563)

SW30核心种质子集：

SW30-01(G018)、SW30-02(G025)、SW30-03(G029)、SW30-04(G034)、SW30-05(G036)、SW30-06(G039)、SW30-07(G047)、SW30-08(G053)、SW30-09(G059)、SW30-10(GX06)、SW30-11(GX09)、SW30-12(GX11)、SW30-13(G303)、SW30-14(G313)、SW30-15(G370)、SW30-16(G408)、SW30-17(G304)、SW30-18(G343)、SW30-19(G369)、SW30-20(G398)、SW30-21(G401)、SW30-22(G102)、SW30-23(G113)、SW30-24(G114)、SW30-25(G116)、SW30-26(G121)、SW30-27(G129)、SW30-28(G131)、SW30-29(G202)、SW30-30(G212)、SW30-31(G213)、SW30-32(G301)、SW30-33(G306)、SW30-34(G318)、SW30-35(G324)、SW30-36(G331)、SW30-37(G338)、SW30-38(G348)、SW30-39(G352)、SW30-40(G367)、SW30-41(G377)、SW30-42(G378)、SW30-43(G379)、SW30-44(G380)、SW30-45(G383)、SW30-46(G407)、SW30-47(G007)、SW30-48(G012)、SW30-49(G015)、SW30-50(G016)、SW30-51(G372)、SW30-52(G396)、SW30-53(G509)、SW30-54(G510)、SW30-55(G513)、SW30-56(G514)、SW30-57(G515)、SW30-58(G524)、SW30-59(G537)、SW30-60(G538)、SW30-61(G551)、SW30-62(G563)、SW30-63(G570)

采用Whitehead&Peakall(2015)Smouse方法分别对三种光皮树核心种质子集(SW1、SW2和SW3)与原始种质资源(POP)进行遗传多样性参数估算(表1)：

表1三种光皮树核心种质子集与原始种质资源的遗传多样性参数

对三种遗传多样性参数估算值进行T检验，结果表明：三种光皮树核心种质子集(SW1、SW2和SW3)与原始种质资源(POP)在Diveristy参数(t＝1.8589，df＝3，p-value＝0.16)、Scaled Diversity参数(t＝1.9757，df＝3，p-value＝0.1427)和ShannonInformation参数(t＝1.8807，df＝3，p-value＝0.1566)均呈现差异不显著，而且全部高于原始种质资源，说明本项研究采用的取样策略和方法正确，而且选择结果非常好。考虑到光皮树群体的遗传多样性很高，以及多态性位点的保存率，本发明建议采用SW3作为中国光皮树核心种质。

本发明提供的植物核心种质抽样新策略科学、设计简单、快捷，能够最大化保存遗传多样性以及最低的冗余，适合应用于各种植物核心种质资源的保存，对其他物种的核心种质资源保存亦有重要的参考价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。