无酒精啤酒风味饮料、无酒精啤酒风味饮料的醇厚味增强剂及酸味减轻剂以及无酒精啤酒风味饮料的醇厚味增强方法及酸味减轻方法

摘要

本发明的目的在于提供一种使用来自谷类的原料，醇厚味强，酸味得到减轻的无酒精啤酒风味饮料。本发明为一种无酒精啤酒风味饮料，其为酒精度数小于1.0％的无酒精啤酒风味饮料，其特征在于，含有构成来自谷类的蛋白质的赖氨酸的氨基被糖化且分子量35～50kDa的糖修饰蛋白质。

说明书

技术领域

本发明涉及无酒精啤酒风味饮料、无酒精啤酒风味饮料的醇厚味增强剂及酸味减轻剂，以及无酒精啤酒风味饮料的醇厚味增强方法及酸味减轻方法。

背景技术

伴随近年来消费者嗜好的多样化，期待开发出具有各种香味特征的无酒精啤酒风味饮料。

例如，专利文献1中公开有，为了增强啤酒类饮料的醇厚感等，而将甜味类成分、醛类成分等用作啤酒类饮料用风味改善剂等。

专利文献

专利文献1：日本特开2016-214262号公报

发明内容

然而，如专利文献1中的风味改善剂，会给香味带来影响，有时并不适合使用。

此外，作为无酒精啤酒风味饮料的原材料，一般使用麦类、玉米等来自谷类的原料。由于来自谷类的原料是通常用于无酒精啤酒风味饮料的原料，因此将来自谷类的原料用作增强醇厚味的材料，对于制造者及饮料的消费者而言阻力较小。因此，期待一种使用来自谷类的原料来使醇厚味增强的方法。

此外，为了降低pH防止腐败，有时会向无酒精啤酒风味饮料中添加柠檬酸等酸。由于添加酸会感觉到酸味，因此期望一种保持原有的pH而使酸味减轻的方法。

本发明的目的在于提供一种使用来自谷类的原料，醇厚味强，酸味得到减轻的无酒精啤酒风味饮料。此外，本发明的目的在于提供一种来自谷类的原料的无酒精啤酒风味饮料的醇厚味增强剂及酸味减轻剂。进一步，本发明的目的在于提供一种使用来自谷类的原料的无酒精啤酒风味饮料的醇厚味增强方法及酸味减轻方法。

即，本发明涉及以下无酒精啤酒风味饮料等。

[1]一种无酒精啤酒风味饮料，其为酒精度数小于1.0％的无酒精啤酒风味饮料，其特征在于，含有构成来自谷类的蛋白质的赖氨酸的氨基被糖化且分子量35～50kDa的糖修饰蛋白质。

[2]根据上述[1]所述的无酒精啤酒风味饮料，其特征在于，所述糖修饰蛋白质所具有的被糖化的赖氨酸的含量为4.7nmol/mL以上。

[3]根据上述[1]或[2]所述的无酒精啤酒风味饮料，其特征在于，所述糖修饰蛋白质所具有的被糖化的赖氨酸的含量为9.4nmol/mL以上。

[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的无酒精啤酒风味饮料，其特征在于，对所述被糖化的赖氨酸的氨基进行糖化的糖，为单糖或二糖。

[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的无酒精啤酒风味饮料，其特征在于，所述谷类为选自大麦、小麦、玉米、水稻及大豆中的至少1种。

[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的无酒精啤酒风味饮料，其特征在于，不含有麦汁。

[7]一种酒精度数小于1.0％的无酒精啤酒风味饮料的醇厚味增强剂，其特征在于，含有构成来自谷类的蛋白质的赖氨酸的氨基被糖化且分子量35～50kDa的糖修饰蛋白质。

[8]一种无酒精啤酒风味饮料的醇厚味增强方法，其特征在于，通过向酒精度数小于1.0％的无酒精啤酒风味饮料中，添加构成来自谷类的蛋白质的赖氨酸的氨基被糖化且分子量35～50kDa的糖修饰蛋白质，来增强无酒精啤酒风味饮料的醇厚味。

[9]一种酒精度数小于1.0％的无酒精啤酒风味饮料的酸味减轻剂，其特征在于，含有构成来自谷类的蛋白质的赖氨酸的氨基被糖化且分子量35～50kDa的糖修饰蛋白质。

[10]一种无酒精啤酒风味饮料的酸味减轻方法，其特征在于，通过向酒精度数小于1.0％的无酒精啤酒风味饮料中，添加构成来自谷类的蛋白质的赖氨酸的氨基被糖化且分子量35～50kDa的糖修饰蛋白质，来减轻无酒精啤酒风味饮料的酸味。

根据本发明，可提供一种使用来自谷类的原料，醇厚味强，酸味得到减轻的无酒精啤酒风味饮料。此外，可提供一种来自谷类的原料的无酒精啤酒风味饮料的醇厚味增强剂及酸味减轻剂。进一步，可提供一种使用来自谷类的原料的无酒精啤酒风味饮料的醇厚味增强方法及酸味减轻方法。

具体实施方式

本发明的无酒精啤酒风味饮料含有糖修饰蛋白质。

糖修饰蛋白质的分子量为35～50kDa。

分子量35～50kDa的蛋白质，是使用30kDa的截止膜对无酒精啤酒风味饮料的原料液进行超细过滤，接着由SDS-PAGE电泳所测定的在分子量为35～50kDa的区域所观察到的蛋白质。

优选约40kDa的蛋白质，本说明书中约40kDa的蛋白质也称40kDa蛋白质。

糖修饰蛋白质为来自谷类的蛋白质。

上述谷类优选为选自大麦、小麦、玉米、水稻及大豆中的至少1种。

此外，谷类为麦的情况下，可含有来自无酒精啤酒风味饮料的制造时所使用的公知的麦的蛋白质。作为这种麦，可列举：大麦、小麦、黑麦、野燕麦、燕麦等，优选为大麦。此外，可以为发芽麦、未发芽麦的任一种，优选为发芽麦的麦芽。这些可以单独含有，也可以组合含有2种以上。

糖修饰蛋白质，是构成来自谷类的蛋白质的赖氨酸的氨基被糖化的蛋白质。

本发明中所谓“赖氨酸的氨基被糖化”，是指糖在赖氨酸的氨基上进行键合。

在赖氨酸所具有的氨基中，优选糖对侧链的氨基进行糖化。

赖氨酸的氨基被糖化的确认，可由NBT法(Nitroblue tetrazolium法)通过比色定量来进行。

对赖氨酸的氨基进行糖化的糖，为单糖、二糖、三糖以上的多糖中的任一种均可，优选为单糖或二糖。

作为单糖，可列举：包含葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖的所有的糖。

作为二糖，可列举：麦芽糖、乳糖等的麦芽糖型二糖。

作为三糖，可列举：麦芽三糖、纤维三糖、墨角藻糖基乳糖、唾液乳糖等。

本发明的无酒精啤酒风味饮料，因含有如上述的糖修饰蛋白质，故可制成醇厚味强，酸味得到减轻的无酒精啤酒风味饮料。

此外，由于糖修饰蛋白质为来自谷类的原料，其可防止如专利文献1中所记载的风味改善剂那样给香味带来意图之外的影响。此外，由于来自谷类的原料是通常用于无酒精啤酒风味饮料的原料，因此将来自谷类的原料用作增强醇厚味的材料或用作减轻酸味的材料，对于制造者及饮料的消费者而言阻力较小。

在本发明中，“醇厚味”是无法通过5个基本味，即甜味、咸味、酸味、苦味及鲜味(Umami)来表达的味道，其是通过味的强度(饮后满足感)、味的延展性、味的厚度、味的经时变化(余韵或持续性)等来表达的味道。在本发明中所谓增强醇厚味，例如，包含对不具有醇厚味的饮食品赋予醇厚味，以及增强具有醇厚味的饮食品的醇厚味。醇厚味的有无或其程度，可由专业评审通过感官评价进行评价。

此外，酸味的有无或其程度，也可由专业评审通过感官评价进行评价。

在本发明的无酒精啤酒风味饮料中，从减轻无酒精啤酒风味饮料的酸味的角度出发，优选被糖化的赖氨酸的含量为4.7nmol/mL以上。

此外，从增强无酒精啤酒风味饮料的醇厚味的角度出发，优选被糖化的赖氨酸的含量为9.4nmol/mL以上。

此外，优选被糖化的赖氨酸的含量为50.0nmol/mL以上，也优选为80.0nmol/mL以上，也优选为100nmol/mL以上。

此外，优选被糖化的赖氨酸的含量为50.0～1000nmol/mL，也优选为80.0～1000nmol/mL，也优选为100～1000nmol/mL。

被糖化的赖氨酸的含量的定量，可由NBT法通过比色定量来进行。

本发明的无酒精啤酒风味饮料的提取物部分的重量无特别限定，优选为0.01～20.0重量％。

本发明的无酒精啤酒风味饮料可使用麦芽作为原料。

此外，原料中的麦芽的比率可以为0重量％。

此处所谓的“麦芽的比率”，是指麦芽在麦芽、米、玉米、高粱、马铃薯、淀粉、麦芽以外的麦以及糖类等水和啤酒花以外的原料中所占的重量的比率。但是，酸味剂、甜味剂、苦味剂、调味料、香料等可微量添加的成分，不包含于上述比率的计算中。

本发明的无酒精啤酒风味饮料可以不含有麦汁。

本发明的无酒精啤酒风味饮料，优选嘌呤体浓度小于5.0mg/100mL。此外，嘌呤体浓度也优选为0mg/100mL。

对于嘌呤体浓度为上述范围的无酒精啤酒风味饮料，通过添加糖修饰蛋白质可特别增强醇厚味，减轻酸味。

所谓无酒精啤酒风味饮料，是酒精度数小于1％的啤酒风味饮料，优选实质上不含酒精。此外，酒精度数可以为0％。

所谓啤酒风味饮料是啤酒风味的碳酸饮料。

此处，实质上不含酒精的方式的饮料，并不排除含有无法检测出的程度的极微量的酒精的饮料。酒精度数通过四舍五入达到0.0％的饮料，其中，酒精度数通过四舍五入达到0.00％的饮料，也包含在无酒精啤酒风味饮料中。作为本发明的无酒精啤酒风味饮料的种类，例如，包含无酒精的啤酒风味饮料、啤酒风味的清凉饮料等。另外，此处的“酒精度数(酒精含量)”是指乙醇的含量，并不包含脂肪族醇。

本发明涉及的无酒精啤酒风味饮料的酒精度数，是指饮料中的酒精成分的含量(v/v％)，其可通过公知的任一种方法进行测定，例如，可通过振动式密度计进行测定。具体而言，可制备通过过滤或超声波处理而从饮料中除去二氧化碳的样本，然后对该样本进行直火蒸馏，测定所得馏出液在15℃下的密度，通过使用日本国税厅规定分析法(平19国税厅训令第6号，平成19年(2007年)6月22日修订)的附表“第2表酒精成分和密度(15℃)及比重(15/15℃)换算表”进行换算求取。酒精度数小于1.0％的情况下，可使用市售的酒精测定装置或气相色谱法。

以下示出一般无酒精啤酒风味饮料的制造工序。

因不具有使用酵母的发酵工序，故可容易地制造无酒精啤酒风味饮料。一般的非发酵的无酒精啤酒风味饮料，存在使用麦芽作为原料和不使用麦芽作为原料两种，可通过以下方式来制造。

使用麦芽作为原料所制造的无酒精啤酒风味饮料，首先，向含有除了麦芽等麦以外，根据需要含有其他谷物、淀粉、糖类、苦味剂或食用色素等原料及水的混合物中，根据需要添加淀粉酶等酶，通过进行糊化、糖化并过滤，而制成糖化液。根据需要将啤酒花或苦味剂等加入至糖化液中并煮沸，在澄清箱中去除凝固蛋白质等固体成分。作为该糖化液的代替，可以向已加入温水的麦芽提取物中加入啤酒花并煮沸。啤酒花可在煮沸开始至煮沸结束前的任意阶段进行混合。糖化工序、煮沸工序、固体成分去除工序等的条件，使用已知的条件即可。煮沸后，过滤所得的麦汁，向所得的过滤液中加入二氧化碳。然后，填充至容器中并经由杀菌工序得到目标无酒精啤酒风味饮料。在上述各工序中添加糖修饰蛋白质时，可在填充前的任意工序中进行。

在制造不使用麦芽作为原料的无酒精啤酒风味饮料时，首先，将含有碳源的液糖、麦或麦芽以外的作为含有氨基酸材料的氮源、啤酒花、色素等，与温水一同混合，制成液糖溶液。将该液糖溶液煮沸。使用啤酒花作为原料时，啤酒花可不在煮沸开始前，而在煮沸过程中混合至该液糖溶液中。向煮沸后的液糖溶液中加入二氧化碳。然后，填充至容器中并经由杀菌工序而得到目标无酒精啤酒风味饮料。在上述各工序中添加糖修饰蛋白质时，可在填充前的任意工序中进行。

从赋予本发明涉及的无酒精啤酒风味饮料以酒感的角度出发，可添加脂肪族醇。作为脂肪族醇，只要为公知的脂肪族醇则无特别限制，优选碳数4～5的脂肪族醇。在本发明中，作为优选的脂肪族醇，就碳数4的脂肪族醇而言，可列举：2-甲基-1-丙醇、1-丁醇等，就碳数5的脂肪族醇而言，可列举：3-甲基-1-丁醇、1-戊醇、2-戊醇等。这些可使用1种或将2种以上组合使用。

碳数4～5的脂肪族醇的含量优选为0.0002～0.0007质量％，更优选为0.0003～0.0006质量％。在本说明书中，脂肪族醇的含量可使用顶空气相色谱法进行测定。

对于本发明涉及的无酒精啤酒风味饮料而言，为了迎合近年来低热量的嗜好，期望其为低热量。因此，本发明涉及的无酒精啤酒风味饮料的热量值，优选小于5kcal/100mL，更优选小于4kcal/100mL，进一步优选小于3kcal/100mL。

本发明涉及的无酒精啤酒风味饮料中所含的热量值，基本依照日本健康增进法关联公布的“关于营养标示标准中的营养成分等的分析方法等”来计算。即，原则上，可通过规定量的各种营养成分的量，分别乘以各成分的能量换算系数(蛋白质：4kcal/g、脂质：9kcal/g、含糖物质：4kcal/g、食物纤维：2kcal/g、酒精：7kcal/g、有机酸：3kcal/g)的总和来计算。详细请参考“关于营养标示标准中的营养成分等的分析方法等”。

本发明涉及的无酒精啤酒风味饮料所含的各营养成分量的具体测定方法，依照日本健康增进法“关于营养标示标准中的营养成分等的分析方法等”中记载的各种分析法即可。或者通过委托财团法人日本食品分析中心，也可得知这种热量及/或各营养成分量。

本发明涉及的无酒精啤酒风味饮料中所含的含糖物质，是指基于食品的营养标示标准(平成15年(2003年)日本厚生劳动省告示第176号)的含糖物质。具体而言，含糖物质是指从食品中去除蛋白质、脂质、食物纤维、灰分、酒精成分及水分后的物质。此外，食品中的含糖物质的量通过从该食品的重量中扣除蛋白质、脂质、食物纤维、灰分及水分的量来计算。此时，蛋白质、脂质、食物纤维、灰分及水分的量根据营养标示标准揭示的方法来测定。具体而言，蛋白质的量通过氮定量换算法进行测定，脂质的量通过醚萃取法、氯仿及甲醇混液萃取法、盖勃氏法、酸分解法或罗兹-哥特里法(Rose-Gottlieb Method)进行测定，食物纤维的量通过高效液相色谱法或Prosky法进行测定，灰分的量通过乙酸镁添加灰化法、直接灰化法或硫酸添加灰化法进行测定，水分的量通过卡尔·费休法、干燥助剂法、减压加热干燥法、常压加热干燥法或塑料薄膜法进行测定。

本发明涉及的无酒精啤酒风味饮料，为了迎合近年来低糖物质的嗜好，也可为低糖物质。因此，本发明涉及的无酒精啤酒风味饮料的含糖物质的含量可以小于2.5g/100mL，也可以小于0.5g/100mL，此外，不特别设定下限，通常为0.1g/100mL左右，例如可以为0.15g/100mL以上，也可以为0.2g/100mL以上。

本发明涉及的无酒精啤酒风味饮料可以含有酸味剂。作为酸味剂，优选使用选自柠檬酸、乳酸、磷酸及苹果酸中的1种以上的酸。此外，在本发明中，作为上述酸以外的酸，也可以使用琥珀酸、酒石酸、富马酸及冰醋酸等。这些只要是被批准可向食品中添加的物质即可，可无限制地使用。在本发明中，从适当赋予柔和的酸味的角度出发，优选使用与乳酸的组合，从适当赋予稍带刺激感的酸味的角度出发，优选使用与磷酸的组合。

在本发明涉及的无酒精啤酒风味饮料中，从赋予啤酒风味感的角度出发，酸味剂的含量以柠檬酸换算计，优选200ppm以上，更优选550ppm以上，进一步优选700ppm以上，此外，从酸味的角度出发，优选15000ppm以下，更优选5500ppm以下，进一步优选2000ppm以下。因此，在本发明中，酸味剂的含量，以柠檬酸换算计，可列举优选为200ppm～15000ppm，更优选为550ppm～5500ppm，进一步优选为700ppm～2000ppm等的合适范围。另外，在本说明书中，所谓柠檬酸换算量，是以柠檬酸的酸味度为标准由各酸味剂的酸味度换算的量，例如，与乳酸100ppm相当的柠檬酸换算量以120ppm，与磷酸100ppm相当的柠檬酸换算量以200ppm，与苹果酸100ppm相当的柠檬酸换算量以125ppm进行换算。

无酒精啤酒风味饮料中的酸味剂的含量，是指通过高效液相色谱法(HPLC)等进行分析所计算出的值。

在本发明涉及的无酒精啤酒风味饮料中，原料的一部分可使用啤酒花。

使用啤酒花时，可根据所期望的香味，适当选择啤酒等制造中所用的通常的颗粒啤酒花、粉末啤酒花、啤酒花提取物来使用。此外，也可使用异构化啤酒花、还原啤酒花等啤酒花加工品。本发明涉及的无酒精啤酒风味饮料所使用的啤酒花中包含这些物质。此外，啤酒花的添加量无特别限定，典型而言，相对于饮料总量为0.0001～1重量％左右。

本发明涉及的无酒精啤酒风味饮料，在不损害本发明的效果的范围内，根据需要也可使用其他原料。例如，在不损害本发明的效果的范围内，根据需要可使用甜味剂(包括高甜度甜味剂)、苦味剂、香料、酵母提取物、焦糖色素等食用色素，大豆皂苷或皂皮树皂苷等植物提取皂苷类物质，玉米或大豆等植物蛋白质及含肽物质，牛血清白蛋白等蛋白质类物质，食物纤维或氨基酸等调味料，抗坏血酸等抗氧化剂。

本发明涉及的无酒精啤酒风味饮料的pH，从使饮料的风味良好的角度出发，优选为3.0～5.0，更优选为3.5～4.5，进一步优选为3.5～4.0。

本发明涉及的无酒精啤酒风味饮料可制成容器装。容器的形态无任何限制，可填充至瓶、罐、桶或PET瓶等密封容器中，而制成容器装饮料。

本发明的醇厚味增强剂，为一种酒精度数小于1.0％的无酒精啤酒风味饮料的醇厚味增强剂，其特征在于，含有构成来自谷类的蛋白质的赖氨酸的氨基被糖化且分子量35～50kDa的糖修饰蛋白质。

此外，本发明的酸味减轻剂为一种酒精度数小于1.0％的无酒精啤酒风味饮料的酸味减轻剂，其特征在于，含有构成来自谷类的蛋白质的赖氨酸的氨基被糖化且分子量35～50kDa的糖修饰蛋白质。

含有构成来自谷类的蛋白质的赖氨酸的氨基被糖化且分子量35～50kDa的糖修饰蛋白质的制剂，可制成同时作为无酒精啤酒风味饮料的醇厚味增强剂及酸味减轻剂而发挥作用的制剂。

以下，对无酒精啤酒风味饮料的醇厚味增强剂及酸味减轻剂进行一并说明。

本发明的醇厚味增强剂及酸味减轻剂，是为了增强无酒精啤酒风味饮料的醇厚味及/或为了减轻酸味而使用的糖修饰蛋白质本身或含有糖修饰蛋白质的组合物。

糖修饰蛋白质，是构成来自谷类的蛋白质的赖氨酸的氨基被糖化且分子量35～50kDa的蛋白质，具体如上所述。

醇厚味增强剂及酸味减轻剂是含有糖修饰蛋白质的组合物时，只要不损害本发明的效果，还可以任意包含能添加至饮料中的公知的添加剂。

本发明的醇厚味增强剂及酸味减轻剂中所含的糖修饰蛋白质中的被糖化的赖氨酸的含量，以糖修饰蛋白质每1μg的被糖化的赖氨酸的含量(nmol)计，优选为0.04nmol/μg以上，更优选为0.4nmol/μg以上。

这种糖修饰蛋白质，由于在糖修饰蛋白质中被糖化的赖氨酸的含量较多，故可通过少量的使用，来作为用于增强无酒精啤酒风味饮料的醇厚味的醇厚味增强剂，或作为用于减轻酸味的酸味减轻剂而应用。

本发明的醇厚味增强剂及酸味减轻剂，可从由北美产麦芽酿造的啤酒中精制而获得。北美产麦芽较多含有构成来自谷类的蛋白质的赖氨酸的氨基被糖化且分子量35～50kDa的糖修饰蛋白质。

此外，也可从麦芽或大麦中精制而获得。麦芽或大麦含有构成来自谷类的蛋白质的赖氨酸的氨基被糖化且分子量35～50kDa的糖修饰蛋白质。

此外，也可通过淀粉糖化(Mashing)，以含有较多赖氨酸的氨基被糖化且分子量35～50kDa的糖修饰蛋白的方式，来提取蛋白质。

本发明的无酒精啤酒风味饮料的制造方法，无特别限定，可例示具有下述工序的制造方法，所述工序为向酒精度数小于1.0％的无酒精啤酒风味饮料中，添加分子量35～50kDa的糖修饰蛋白质的工序。

更具体而言，可列举：通过向酒精度数小于1.0％的无酒精啤酒风味饮料中，添加构成来自谷类的蛋白质的赖氨酸的氨基被糖化且分子量35～50kDa的糖修饰蛋白质，而得到醇厚味被增强及/或酸味得到减轻的无酒精啤酒风味饮料的方法。

基于该方法的无酒精啤酒风味饮料的制造方法，也为本发明的无酒精啤酒风味饮料的醇厚味增强方法及无酒精啤酒风味饮料的酸味减轻方法。

向无酒精啤酒风味饮料中添加醇厚味增强剂或酸味减轻剂时，醇厚味增强剂及酸味减轻剂的添加量，从醇厚味增强的角度出发，糖修饰蛋白质所具有的被糖化的赖氨酸的含量，优选设为9.4nmol/mL以上，从酸味减轻的角度出发，糖修饰蛋白质所具有的被糖化的赖氨酸的含量，优选设为4.7nmol/mL以上。

此外，糖修饰蛋白质所具有的被糖化的赖氨酸的含量，优选设为50.0nmol/mL以上，也优选设为80.0nmol/mL以上，也优选设为100nmol/mL以上。

这种情况下，醇厚味增强剂及酸味减轻剂的添加量，从醇厚味增强的角度出发，以糖修饰蛋白质的量计，优选设为5μg/mL以上，从酸味减轻的角度出发，以糖修饰蛋白质的量计，优选设为10μg/mL以上。

实施例

(来自啤酒的糖修饰蛋白质的精制)

将北美产麦芽粉碎为适当粒度并装入加料槽后，与温水混合。于适合麦芽酶的温度下，保持足够的糖化时间，通过麦芽酶的作用将淀粉质体转换为糖分，制造糖化液。然后，过滤糖化液并加入啤酒花，煮沸，制造热麦汁，备用于发酵。将热麦汁冷却，向其中加入啤酒酵母。通过数日酵母的作用，使麦汁中的糖分分解为酒精和二氧化碳从而制造生啤酒。将生啤酒转移至贮酒罐中，于低温下贮藏数十日。在此期间使啤酒熟成，调和啤酒的味道和香气。熟成结束后，过滤啤酒进行装瓶。

从通过上述方法由北美产麦芽酿造的啤酒中，依照下述进行糖修饰蛋白质的精制。

(1)基于阳离子交换树脂的分级分离

将阳离子交换树脂SP Sepharose 50mL放入空色谱柱中。使由北美产麦芽酿造的啤酒吸附于树脂。然后，将树脂转移至色谱柱，用20mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)进行清洗。接着，用20mM乙酸钠(pH4.5)+0.5M-NaCl进行洗脱并收集组分。对所得的组分通过SDS-PAGE进行评价，收集包含40kDa的糖修饰蛋白质的组分，将其作为阳离子交换树脂结合组分。

(2)超细过滤(缓冲液更换)

向经水清洗的超细过滤单元(Merck制Amicon Ultra-15 30K)中添加由(1)所得的阳离子交换树脂结合组分，以3500rpm离心并进行超细过滤，得到浓缩液。

(3)硫酸铵分级分离

将20mM磷酸缓冲液(pH7.0)+2M硫酸铵放入烧杯中，向其中滴加由(2)所得的浓缩液，并进行搅拌。接着将悬浊液离心(2330g，10分钟，室温)。将上清液收集于另一容器中。收集的溶液使用超细过滤单元进行浓缩。将浓缩液加入20mM乙酸钠(pH4.5)中并离心(2330g，10分钟，室温)，进行浓缩，得到糖修饰蛋白质精制品(Bradford定量(牛血清白蛋白(BSA)换算)，20.4mg/mL，2.21mL)。通过SDS-PAGE确认所得的糖修饰蛋白质精制品的纯度。

(糖修饰蛋白质的修饰解析)

(1)凝胶片的制备

将精制的糖修饰蛋白质溶液(浓度1mg/mL，20mM乙酸钠缓冲液(pH4.5))10μL通过SDS-PAGE进行电泳并通过CBB(考马斯亮蓝)染色后，切取40kDa左右的糖修饰蛋白质的凝胶。

(2)蛋白质的酶消化

将切取的凝胶片切碎，通过二硫苏糖醇进行还原(56℃、1小时)，通过碘乙酰胺进行脲甲基化(遮光下，室温，45分钟)。接着添加含有0.01％ProteaseMax的10ng/μL胰凝乳蛋白酶溶液(5mM氯化钙、50mM碳酸氢铵溶液)15μL、5mM氯化钙、50mM碳酸氢铵溶液15μL，孵育一晚后，回收酶消化液。将回收的溶液减压干燥，再溶解于0.1％甲酸溶液中。

(3)基于LC-MS/MS的测定

LC-MS/MS的测定通过下述条件进行。

使用装置：Direct Flow nanoLC系统Easy-nLC 1000TM(Thermo Scientific)

捕获柱：Acclaim PepMap(注册商标)(Thermo Scientific)

分析色谱柱：NANO HPLC CAPILLARY COLUMN(Nikkyo Technos株式会社)

液相色谱质量分析仪：Q Exactive Plus(Thermo Scientific)

流动相：A液：0.1％甲酸/水、B液：0.1％甲酸/乙腈

流速：300nL/min

梯度：0-40％B/0-30min、40-60％B/30-35min、60-90％B/35-37min、90％B/37-45min

注入量：10μL

离子化模式：ESI Positive

测定范围：MS1(m/z 350-1750)

Data Dependent Scan模式

(4)蛋白质及修饰解析

蛋白质鉴定以及修饰检索通过下述条件进行。

检索软件：Proteome Discoverer2.2.0.388(ThermoFisher制)

生物种类：大麦(Hordeum vulgare)、啤酒花(Humulus)、酵母(Saccharomycescerevisiae)

检索条件：消化酶：Chymotrypsin

修饰(Static)：Carbamidomethyl(Cysteine)

修饰(Dynamic)：Oxidation(Methionine)，Hex(K,R,Protein N-term)、Hex(2)(K,R,Protein N-term)、Hex(3)(K,R,Protein N-term)、Acetyl(Protein N-term)

先驱离子质量误差范围：Monoisotopic、±10ppm

产物离子质量误差范围：±0.02Da

最大漏切位点数(missed-cleavages)：5

置信水平(Percolator)：High(3个等级的准确度中概率最高的水平)

数据库：SwissProt

修饰解析的结果，确认到糖修饰蛋白质的赖氨酸的氨基被糖化。

(糖修饰蛋白质的糖修饰度的评价)

精制的糖修饰蛋白质的糖修饰度使用Fructosamine Assay kit(abcam公司制品，ab228558)通过NBT法进行比色定量。

求出来自啤酒的精制糖修饰蛋白质的糖修饰度。

对于各蛋白质将试验次数设为n＝2，采用平均值。

糖修饰蛋白质每1μg的被糖化的赖氨酸的量为0.94nmol/μg(糖修饰蛋白质)。

(市售无酒精啤酒风味饮料中的糖修饰蛋白质的浓度测定)

市售无酒精啤酒风味饮料A、B的饮料中的糖修饰蛋白质的浓度使用LabChip

(向市售无酒精啤酒风味饮料A中添加糖修饰蛋白质时的酸味及醇厚味评价)

向市售无酒精啤酒风味饮料A中，添加来自啤酒的精制糖修饰蛋白质，并对酸味及醇厚味进行感官评价。

市售无酒精啤酒风味饮料A的酒精度数为0.00％。

市售无酒精啤酒风味饮料A的嘌呤体浓度小于5.0mg/100mL。总嘌呤体浓度由日本食品分析中心通过分解法实施。(以下相同)。

就感官评价而言，将未添加糖修饰蛋白质的市售无酒精啤酒风味饮料A的酸味设为基准分3.0分，将醇厚味设为基准分0.5分，由5名专业评审以0.1分的刻度进行评分。

改变糖修饰蛋白质的添加浓度并进行评价，其结果示于表1。

酸味及醇厚味遵循以下标准。

0分：完全感觉不到

1分：稍微感觉到

2分：明确感觉到

3分：非常强烈地感觉到

表1示出，无酒精啤酒风味饮料中的糖修饰蛋白质所具有的被糖化的赖氨酸的含量(nmol/mL)。

[表1]

由表1所示的结果可知，通过向无酒精啤酒风味饮料中添加糖修饰蛋白质，使被糖化的赖氨酸的含量增加，可减轻无酒精啤酒风味饮料的酸味，增强醇厚味。

(向市售无酒精啤酒风味饮料A中添加酒精，进一步添加糖修饰蛋白质时的酸味及醇厚味评价)

向市售无酒精啤酒风味饮料A中加入乙醇，使酒精度数达到0.999％。进一步添加来自啤酒的精制糖修饰蛋白质，对酸味及醇厚味进行感官评价。

此时由于酒精度数也小于1.0％，因此其作为饮料而言也为无酒精啤酒风味饮料。

感官评价，以与向市售无酒精啤酒风味饮料A中添加来自啤酒的糖修饰蛋白质时的评价相同的方式进行。

表2示出，无酒精啤酒风味饮料中的糖修饰蛋白质所具有的被糖化的赖氨酸的含量(nmol/mL)。

[表2]

由表2所示的结果可知，通过向酒精度数为0.999％的无酒精啤酒风味饮料中添加糖修饰蛋白质，使被糖化的赖氨酸的含量增加，可减轻无酒精啤酒风味饮料的酸味，增强醇厚味。

(向市售无酒精啤酒风味饮料B中添加糖修饰蛋白质时的酸味及醇厚味评价)

向市售无酒精啤酒风味饮料B中添加来自啤酒的精制糖修饰蛋白质，对酸味及醇厚味进行感官评价。

市售无酒精啤酒风味饮料B的酒精度数为0.00％。

市售无酒精啤酒风味饮料B的嘌呤体浓度小于5.0mg/100mL。

就感官评价而言，将未添加糖修饰蛋白质的市售无酒精啤酒风味饮料A的酸味设为基准分3.0分，将醇厚味设为基准分0.5分，由5名专业评审以0.1分刻度进行评分。

改变糖修饰蛋白质的添加浓度并进行评价，将其结果示于表3。

酸味及醇厚味遵循以下标准。

0分：完全感觉不到

1分：稍微感觉到

2分：明确感觉到

3分：非常强烈地感觉到

4分：比市售无酒精啤酒风味饮料A更强烈地感觉到

表3示出，无酒精啤酒风味饮料中的糖修饰蛋白质所具有的被糖化的赖氨酸的含量(nmol/mL)。

[表3]

由表3所示的结果可知，即使针对不同种类的无酒精啤酒风味饮料，通过添加糖修饰蛋白质，使被糖化的赖氨酸的含量增加，也可减轻无酒精啤酒风味饮料的酸味，增强醇厚味。

工业实用性

根据本发明，可提供一种使用来自谷类的原料，醇厚味强，酸味得到减轻的无酒精啤酒风味饮料。