单克隆非特异性抑制因子-β作为反复自然流产临床评价的指标

摘要

本发明提供了免疫抑制因子MNSFβ或其检测试剂在制备诊断哺乳动物受试对象的反复自然流产的诊断试剂或诊断试剂盒中的用途。本发明提供了能够用于RSM鉴别和预测的分子指标，从而为RSM发病机制的研究及其生物标志分子的筛选鉴定提供新的途径，奠定了新的物质基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域。具体地说，本发明涉及单克隆非特异性抑制因子-β(MNSFβ)或其编码基因作为反复自然流产(RSM)临床评价的指标，以及利用MNSFβ鉴别和预测反复自然流产的方法。

背景技术

人类正常妊娠的建立和维持需要经历胚胎植入、胎盘形成、胚胎发育等一系列重要环节，受到多层面不同系统的协同调控，其中任一环节障碍均会导致自然流产等不良妊娠结局。2005年，人类生殖和胚胎学协会(ESHRE，European Society of HumanReproduction and Embryology)将“流产”定义为：(1)尿妊娠试验阳性或者血HCG水平升高，但超声或组织学未能确认妊娠的情况为“生化流失”，一般发生于妊娠6周之前；(2)当超声或组织学能够确认为宫内妊娠时，称之为“临床流产”，又可细分为早期流产(妊娠12周之前)与晚期流产(妊娠12周到22周之间)。据估计，人类妊娠中生化流失率达60％；早期临床妊娠流产率达15％，并且与年龄显著相关，在20-24岁时临床流产率为10％，而40-44岁时，流产率达51％；晚期流产率一般在4％。

反复自然流产(recurrent spontaneous miscarriages，RSM)又称为RM(recurrent miscarriages)或者是RPL(recurrent pregnancy loss)，是指与同一性伴侣连续发生2次及2次以上的妊娠第20周之前的自然流产，在妊娠期妇女中的发病率约为1～2％。RSM病因复杂，涉及遗传、生殖内分泌、生殖道解剖、感染及女性自身免疫等诸多方面，虽然已有大量研究聚焦于这个领域，但仍有半数以上原因不明。而临床上对于利用什么样的生物标志分子鉴定以及预测RM的发生，仍是空白。

母胎界面免疫耐受的核心是蜕膜免疫细胞(DIC)之间及其与胎盘滋养层细胞之间的精细互作。DIC主要包括：dNK细胞(70％)、dMφ细胞(20％)、T细胞(10～20％)，以及少量的树突状细胞和B细胞。dMφ细胞在妊娠各个阶段保持相对稳定的比例，并且主要定位在子宫螺旋动脉周围，并可能参与调控母胎界面的血管重铸过程；而蜕膜中不同免疫细胞功能失调是与RSM相关的局部免疫功能紊乱因素。

综上所述，从现有的研究可以看出，目前人们对RSM的鉴别以及预测方法知之甚少。因此，本领域急需能够用于RSM鉴别和预测的临床评价指标。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确率高、灵敏度高、易操作的鉴别和预测早孕期反复自然流产风险的技术。

本发明的另一个目的是提供一种用于早孕期反复自然流产鉴别和预测的生物标志物。

本发明的还一个目的是提供一种鉴别和预测早孕期反复自然流产的诊断试剂或诊断试剂盒。

在第一方面，本发明提供免疫抑制因子MNSFβ或其检测试剂在制备诊断哺乳动物受试对象的反复自然流产的诊断试剂或诊断试剂盒中的用途。

在具体的实施方式中，所述的MNSFβ包括MNSFβ的基因或蛋白。

在具体的实施方式中，所述MNSFβ的基因是mRNA。

在具体的实施方式中，所述哺乳动物受试对象包括但不限于人、马、狗、猫、啮齿动物；优选地，所述哺乳动物受试对象是人、家兔、小鼠、大鼠、豚鼠；更优选人。

在优选的实施方式中，所述检测试剂包括免疫抑制因子MNSFβ蛋白的特异性抗体、特异性结合分子，或者MNSFβ基因的特异性扩增引物、探针或芯片。

在优选的实施方式中，所述检测包括免疫组化、免疫印迹和荧光定量PCR方法检测。

在优选的实施方式中，所述检测是针对离体样本的检测。

在优选的实施方式中，所述的检测包括定性和/或定量检测。

在优选的实施方式中，所述的离体样本是蜕膜组织样本。

在第二方面，本发明提供一种鉴别和预测哺乳动物受试对象的反复自然流产的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括：

1)含有免疫抑制因子MNSFβ的检测试剂的容器；和

2)利用所述诊断试剂盒诊断反复自然流产的使用说明书。

在具体的实施方式中，所述诊断试剂盒还包括免疫抑制因子MNSFβ作为对照。

在具体的实施方式中，所述的MNSFβ包括MNSFβ的基因或蛋白。

在具体的实施方式中，所述MNSFβ的基因是mRNA。

在具体的实施方式中，所述哺乳动物受试对象包括但不限于人、马、狗、猫、啮齿动物；优选地，所述哺乳动物受试对象是人、家兔、小鼠、大鼠、豚鼠；更优选人。

在优选的实施方式中，所述检测试剂包括免疫抑制因子MNSFβ蛋白的特异性抗体、特异性结合分子，或者MNSFβ基因的特异性扩增引物、探针或芯片。

在优选的实施方式中，所述使用说明书中注明利用所述诊断试剂盒诊断反复自然流产的步骤包括：

a)检测早孕期对象的dMφ细胞中MNSFβ的表达水平；

b)检测该早孕期对象蜕膜全细胞中MNSFβ的表达水平；

c)如果步骤a)中检测到的MNSFβ的表达水平高于正常早孕期对象的dMφ细胞中MNSFβ的表达水平，和/或步骤a)中检测到的MNSFβ的表达水平低于正常早孕期对象蜕膜全细胞中MNSFβ的表达水平，则判断该早孕期对象具有反复自然流产风险。

在优选的实施方式中，在步骤c)中，如果步骤a)中检测到的MNSFβ的表达水平高于正常早孕期对象的dMφ细胞中MNSFβ的表达水平，和步骤a)中检测到的MNSFβ的表达水平低于正常早孕期对象蜕膜全细胞中MNSFβ的表达水平，则判断该早孕期对象具有反复自然流产风险。

在第三方面，本发明提供一种鉴别和预测哺乳动物受试对象的反复自然流产的方法，所述方法包括以下步骤：

a)检测早孕期哺乳动物受试对象的dMφ细胞中MNSFβ的表达水平；

b)检测该早孕期哺乳动物受试对象蜕膜全细胞中MNSFβ的表达水平；

c)如果步骤a)中检测到的MNSFβ的表达水平高于正常早孕期对象的dMφ细胞中MNSFβ的表达水平，而步骤a)中检测到的MNSFβ的表达水平低于正常早孕期对象蜕膜全细胞中MNSFβ的表达水平，则判断该早孕期对象具有反复自然流产风险。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了早孕期人蜕膜组织中MNSFβ蛋白表达情况；

图2显示了dMφ细胞纯度及细胞形态学特征；

图3显示了人dMφ细胞中MNSFβ在其mRNA和蛋白水平的表达情况；和

图4显示了早孕期人蜕膜中MNSFβ的表达水平。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，观察到早孕期人蜕膜组织中EVT细胞、血管内皮细胞以及蜕膜巨噬细胞dMφ细胞中均有MNSFβ蛋白的表达；以CD14和CD45作为dMφ细胞的生物标志分子，分离出高纯度(>85％)的dMφ细胞，并发现RSM患者dMφ细胞中MNSFβ的表达水平较正常早孕期妇女有着显著的差异；但与之相反，RSM患者蜕膜全细胞中MNSFβ的表达水平却低于正常早孕期妇女蜕膜全细胞。因此MNSFβ在蜕膜组织不同细胞中的分布比率可作为反复自然流产(RSM)临床评价指标。在此基础上完成了本发明。

单克隆非特异性抑制因子-β及其用途

在本文中，单克隆非特异性抑制因子-β(Monoclonal nonspecific suppressorfactor-β，MNSFβ)具有本领域技术人员常规理解的含义。单克隆非特异性抑制因子-β，又称FAU(Finkel-Biskis-Reilly murine sarcoma virus-associated ubiquitouslyexpressed gene)，其是一种在体内广泛表达的无抗原特异性的免疫抑制因子，能抑制T细胞和B细胞的增殖和活化，以及B细胞中IgG的合成分泌。人和小鼠MNSFβ蛋白均由133个氨基酸残基组成，其同源性高达98％，都含有氨基端的泛素样蛋白(Ubi)结构域和羧基端的S30核糖体蛋白结构域。前期研究中观察到，MNSFβ在滋养层细胞、子宫内膜上皮细胞(endometrial epithelial cell，EEC)和基质细胞(endometrial stromal cell，ESC)、DSC细胞、蜕膜自然杀伤细胞(decidual natural killer cell，dNK)、蜕膜巨噬细胞(decidualmacrophages，dMφ)中均有表达。研究已对MNSFβ在人EVT细胞中的作用进行了初步探讨，发现敲降人绒毛外滋养层细胞系HTR-8/SVneo细胞中MNSFβ的表达水平后，细胞的增殖、迁移和侵袭活性都显著减弱，进一步提示MNSFβ在妊娠过程中发挥重要作用，并且MNSFβ可能参与母胎界面上dMφ细胞功能的调节。MNSFβ在母胎界面微环境调控中的作用及其与RSM的关联，可用于鉴别RSM等疾病干预的潜在靶分子提供科学依据。

本发明提供了MNSFβ在反复自然流产患者蜕膜不同细胞中分布的鉴定方法。包括步骤：(a)提供来自20例不明原因RSM患者和50例早孕期人工流产妇女(Control)蜕膜组织样本，通过免疫荧光方法在人早孕蜕膜组织的植入位点(IS)和非植入位点(nIS)均检测到dMφ细胞的存在，而且在EVT细胞、血管内皮细胞以及dMφ细胞中均检测到MNSFβ蛋白的表达；(b)分离得到的dMφ细胞纯度达到85％以上；(c)RSM患者dMφ细胞中MNSFβ在mRNA和蛋白表达水平与Control妇女的dMφ细胞相比均存在显著差异；(d)RSM患者蜕膜全细胞中MNSFβ的表达水平低于Control妇女蜕膜全细胞。

本发明人发现，免疫抑制因子MNSFβ在蜕膜组织不同细胞中的分布比率可以作为反复自然流产(RSM)的临床评价指标。在具体的实施方式中，本发明人通过以下方法确定免疫抑制因子MNSFβ可以作为反复自然流产(RSM)的临床评价指标：

(a)通过免疫荧光检测技术鉴别RSM病人早孕蜕膜组织中EVT细胞、血管内皮细胞以及蜕膜巨噬细胞中MNSFβ的表达分布；

(b)应用磁珠分离法从新鲜蜕膜组织中分离得到dMφ细胞，通过流式细胞术检测蜕膜组织中CD45

(c)通过qRT-PCR和Western Blot方法观察RSM患者dMφ细胞中MNSFβ表达水平的变化；

(d)应用流式间标荧光检测方法观察蜕膜组织中全细胞以及其中dMφ细胞中MNSFβ蛋白的平均荧光强度；

在优选的实施方式中，步骤(a)中的鉴定方法是通过免疫荧光技术鉴定，在人早孕蜕膜组织的植入位点(IS)和非植入位点(nIS)均检测到dMφ细胞的存在，而且在EVT细胞、血管内皮细胞以及蜕膜巨噬细胞dMφ细胞中检测到MNSFβ蛋白的阳性信号。

在优选的实施方式中，在步骤(b)中，通过磁珠分离法检测所分离到的dMφ细胞纯度达到85％以上。

在优选的实施方式中，在步骤(c)中，通过qRT-PCR和Western Blot方法检测得到RSM患者dMφ细胞中MNSFβ在mRNA和蛋白表达水平与Control妇女的dMφ细胞相比均显著上调。

在优选的实施方式中，在步骤(d)中，通过流式间标荧光方法得到RSM dMφ细胞中MNSFβ的表达水平高于Control dMφ细胞；但与之相反，RSM患者蜕膜全细胞中MNSFβ的表达水平却低于正常早孕期妇女蜕膜全细胞。

在优选的实施方式中，所述的鉴定标本是RSM病人的早孕蜕膜组织。

诊断试剂和诊断试剂盒及其使用方法

在发现免疫抑制因子MNSFβ可以作为反复自然流产(RSM)的临床评价指标的基础上，本发明人进一步提供了一种鉴别和预测反复自然流产的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括免疫抑制因子MNSFβ的检测试剂。

基于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员可以理解，本发明的诊断试剂盒还可以包括其它成分或组件。例如，所述诊断试剂盒可以包括盛放检测试剂的容器。在进一步的实施方式中，本发明的诊断试剂盒还可以包括利用所述诊断试剂盒诊断反复自然流产的使用说明书。在优选的实施方式中，本发明的诊断试剂盒还包括免疫抑制因子MNSFβ作为对照。

基于本发明的教导，本领域技术人员可以理解可以所述MNSFβ可以是MNSFβ的编码基因，例如mRNA，也可以是MNSFβ蛋白本身。因此，可以采用各种检测试剂检测免疫抑制因子MNSFβ。例如，所述检测试剂包括但不限于免疫抑制因子MNSFβ蛋白的特异性抗体、特异性结合分子，或者MNSFβ基因的特异性扩增引物、探针或芯片。

基于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员可以知晓利用本发明的诊断试剂盒诊断反复自然流产的方法。例如，所述方法可以包括以下步骤：

a)检测早孕期对象的dMφ细胞中MNSFβ的表达水平；

b)检测该早孕期对象蜕膜全细胞中MNSFβ的表达水平；

c)如果步骤a)中检测到的MNSFβ的表达水平高于正常早孕期对象的dMφ细胞中MNSFβ的表达水平，和/或步骤a)中检测到的MNSFβ的表达水平低于正常早孕期对象蜕膜全细胞中MNSFβ的表达水平，则判断该早孕期对象具有反复自然流产风险。

在优选的实施方式中，步骤a)中检测到的MNSFβ的表达水平高于正常早孕期对象的dMφ细胞中MNSFβ的表达水平，和步骤a)中检测到的MNSFβ的表达水平低于正常早孕期对象蜕膜全细胞中MNSFβ的表达水平，则判断该早孕期对象具有反复自然流产风险。

基于本发明的教导，本领域技术人员可以进一步量化上述判断标准。例如，本领域技术人员可以做ROC进行评估，从而量化上述判断标准。

此外，本领域知晓，MNSFβ在哺乳动物中具备较高的同源性。例如目前有报道MNSFβ在18个物种中的相似度基本都在90％以上。因此，基于本发明的内容，本领域技术人员可以合理知晓免疫抑制因子MNSFβ作为反复自然流产(RSM)的临床评价指标适用于不同的哺乳动物受试对象。在具体的实施方式中，所述哺乳动物受试对象包括但不限于人、马、狗、猫、啮齿动物；优选地，所述哺乳动物受试对象是人、家兔、小鼠、大鼠、豚鼠；更优选人。换言之，在本发明中，单克隆非特异性抑制因子-β(MNSFβ)可以来源于哺乳动物，包括但不限于人、马、狗、猫、啮齿动物；优选地，来源于人、家兔、小鼠、大鼠、豚鼠；更优选来源于人。

本发明的优点：

1.发明人首次发现MNSFβ基因在早孕期人蜕膜组织中EVT细胞、血管内皮细胞以及蜕膜巨噬细胞dMφ细胞中的不同表达分布，可作为RSM病理妊娠的临床评价指标。

2.本发明提供本领域急需能够用于RSM鉴别和预测的分子指标，为RSM发病机制的研究及其生物标志分子的筛选鉴定提供新的途径。

3.本发明为RSM发病机制的研究及其生物标志分子的筛选奠定了新的物质基础。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

材料与方法

纳入研究的RSA患者和早孕人工流产妇女的基本情况如表1所示。

表1.纳入本研究的RSA患者和早孕人工流产妇女的基本情况表

本发明的实施例中使用的具体试剂和材料均是可以商业购得的。

实施例

实施例1.检测早孕期人蜕膜组织中MNSFβ蛋白的表达情况

在本实施例中，发明人检测了早孕期人蜕膜组织中MNSFβ蛋白的表达情况。

具体地说，本发明人如下所述进行组织免疫荧光检测：

新鲜取材的组织尽快放入4％多聚甲醛(PFA)中，于4℃下固定过夜；先后经10％、25％蔗糖溶液梯度脱水后，用包埋剂O.C.T进行冰冻组织包埋，-80℃存放待用。用冰冻切片机切取8μm冰冻切片后，直接放入预冷的4％PFA中固定10min；PBS洗3×5min，1％Triton-X100/PBS溶液打孔10min；加入3％BSA或者相应血清和IgG，室温下封闭1h；加一抗(购自Abcam)，4℃过夜(浓度视不同抗体使用说明书具体调整)。PBS洗3×5min后，加入荧光标记的相应二抗(购自北京中山金桥生物技术有限公司)(1:200)后，室温下孵育1h。如若进行多抗体复染，此处重复以上染色步骤：一抗4℃下孵育过夜，PBS洗3×5min，二抗室温孵育1h，PBS洗3×5min，DAPI染核，室温孵育10min。PBS洗后用防淬灭封片剂封片；激光共聚焦显微镜下观察，绿色通道波长488nm，红色通道波长568nm，UV作为激发光观察细胞核。

检测结果如图1所示。其中，图a表示CK7(EVT细胞标志物)和CD31(血管内皮细胞标志物)阳性细胞；图b表示MNSFβ阳性细胞；图c表示CD14(dMφ细胞标志物)阳性细胞；图d、e、f表示各蛋白荧光信号Merge图；另外IS表示植入位点；nIS表示非植入位点；白色箭头表示MNSFβ阳性dMφ细胞。

实施例2.检测dMφ细胞纯度及细胞形态学特征

在本实施例中，发明人检测了dMφ细胞纯度及细胞形态学特征。

具体地说，通过以下方法进行检测：

(1)将收集到的新鲜早孕期蜕膜组织，用无菌无糖的PBS溶液洗涤2～3次，至蜕膜组织中无明显血块。

(2)取5ml大小的蜕膜组织放入C型管中，用Gentle MACS Dissociator组织破碎仪粉碎组织，模式为M-heart-01.01(16s)，粉碎后的蜕膜组织倒入消化瓶中，按1:1比例，加入无血清1640培养基(5ml)，重复该步骤，直到消化瓶中的溶液体积至20ml。

(3)消化结束后，将消化瓶中的蜕膜组织混合液导入50ml离心管中，补加无血清1640培养基至45ml，400rpm，4℃离心3min，室温下静置5min后，取上清，沉淀再次消化，重复步骤3。

(4)取到的上清中，补加无血清1640培养基至40ml，1000rpm，离心10min，弃上清，收集底部沉淀，4℃放置保存，等待二次消化的上清，然后两次细胞沉淀混合，再次补加无血清1640培养基至40ml，1000rpm，4℃离心10min。

(5)离心结束后，弃上清，收集底部沉淀，加入20ml无血清1640培养基重悬细胞沉淀，依次过150目和400目筛网，过筛结束后，用20ml无血清1640培养基清洗筛网上残留的细胞，最终再次补加无血清1640培养基至45ml，1000rpm，4℃离心10min。

(6)弃上清，收集底部沉淀，加入1～2ml红细胞裂解液，裂解红细胞，每2min摇晃一次，4℃中放置5min后，加入20ml PBS中和，1000rpm，4℃离心10min；弃上清，收集底部细胞沉淀，加入20ml磁珠buffer重悬细胞，进行细胞计数，并根据细胞数目，每10

(7)孵育结束后，每10

(8)为提高dMφ细胞纯度，进行第二次过柱，重复步骤8后，对细胞收集液进行性细胞计数，计算细胞得率，每5×10

(9)dMφ细胞纯度的流式细胞术检测：

①取10

②沉淀物中加入1ml预冷的PBS，轻吹匀，重悬细胞，1000rpm，4℃离心5min洗涤细胞，洗涤2次，弃上清；

③沉淀物中加入100μl预冷的PBS轻吹匀，重悬细胞，分别加入1μl Pacific Blue标记的抗CD45抗体和1μl FITC标记的抗CD14抗体，然后再次轻吹匀细胞悬液，于4℃下孵育30min；

④孵育结束后，加入1ml预冷的PBS，轻吹匀，4℃，1000rpm，离心5min洗涤细胞，洗涤3次，弃上清；

⑤沉淀物中加入300μl预冷的PBS，轻吹匀，重悬细胞，把细胞悬液转移到流式管中，用于上机检测。

检测结果如图2所示。其中图A表示CD45

实施例3.检测人dMφ细胞中MNSFβ的mRNA和蛋白表达水平

在本实施例中，发明人检测了人dMφ细胞中MNSFβ在mRNA和蛋白水平的表达情况。

具体地说，通过以下方法进行检测：

1.细胞总RNA和总蛋白的提取：

(1)细胞裂解：分离出的dMφ细胞，每5×10

(2)分层：从-80℃冰箱中取出Trizol裂解液，在冰上缓慢溶解，加入氯仿(200μl/1mlTrizol)，上下混匀后，冰上静止2～3min，4℃，12000g，离心15min；离心后，取出EP管，会出现如下图的分层，其中RNA融于上层，DNA融于中间层和下层，而蛋白主要融于下层中。

(3)细胞总RNA的提取和逆转录反应：

①将上层液体用无RNA酶的枪头小心吸出，小心不要吸到中间层，保证RNA的纯度；

②加入异丙醇(500μl/1ml Trizol)，上下混匀后，-20℃中放置1～2h，4℃，12000g，离心10min；

③弃上清，小心不要吸到底部沉淀RNA，加入75％酒精(1ml/1ml Trizol)，轻柔涡旋，洗涤沉淀，冰浴上静置2～3min，4℃，7500g，离心5min；

④弃上清，尽量吸干净液体，自然风干沉淀RNA，直到无肉眼可见的沉淀存在；

⑤加入10μl无RNA酶的水，轻柔涡旋，完全溶解RNA，瞬离液体，用NanoDrop2000测RNA浓度，如果需要，可以用少量RNA跑琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量；

⑥逆转录RNA：根据RNA的浓度，建立如下逆转录体系：

⑦混匀，瞬离后，70℃中孵育5min，迅速放置在冰上2min，加入11μl以下试剂从混合物：

⑧混匀，瞬离后，42℃中孵育1h，得到cDNA，-20℃中保存备用。

(4)细胞总蛋白的提取：

吸取中层和氯仿层，尽量分取干净且完全；

①加入300μl无水乙醇/1ml Trizol溶解，然后轻柔缓慢混匀，冰上静置2～3min，4℃，2000g，离心5min，沉淀出DNA；

②小心吸取上清，加入1.5ml异丙醇/1ml Trizol，轻柔缓慢混匀，冰上静置10min，4℃，12000g，离心10min，沉淀出蛋白；

③弃上清，沉淀中加入2ml 0.3M盐酸胍溶液/1ml Trizol，轻柔涡旋，洗涤蛋白质沉淀，冰上静置20min，4℃，7500g，离心5min，洗涤3次；

④洗涤后，加入2ml无水乙醇/1ml Trizol，轻柔涡旋沉淀蛋白，冰上静置20min，4℃，7500g，离心5min；

⑤弃上清，尽量弃干净液体，空气干燥沉淀10min(注意不要真空干燥)；

⑥加入适量的1％SDS溶液重悬蛋白沉淀，轻柔涡旋蛋白，在50℃中孵育，直到蛋白几乎完全溶解，4℃，10000g，离心10min，沉淀其它不溶物；

⑦收集上清，弃沉淀，用BCA蛋白试剂盒检测蛋白浓度，加入Buffer煮沸，在-20℃中保存备用。

2.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测

(1)引物处理：从Thermo Fisher公司订购的引物(1nM，引物序列如下所示)，加入10倍体积的无RNA酶的水，作为引物10×储存液，然后再稀释10倍体积成10μM，作为工作液；

(2)反应体系：按照下表配制10μl的反应体系，一般做两个复孔：

(3)检测程序：按“两步法”进行qRT-PCR检测：

用罗氏

95℃，30s；[95℃，5s；60℃，30s]55cycles；[95℃，5s；60℃，1min]1cycle；[50℃，30s；37℃，5min]1cycle。

(4)数据分析：反应结束后，用

3.蛋白印迹(Western Blot)

(1)制胶：5％浓缩胶(5ml)

(2)上样：每孔上样20～30μg细胞总蛋白；

(3)电泳：先以80V电压，电泳30min，压胶，再以120V电压，电泳约60min；

(4)转膜：运用湿转法进行转膜；

(5)封闭：取出PVDF膜，先用PBST进行洗涤2次，5min/次，洗掉PVDF膜上的甲醇，然后放入1％BSA溶液中，常温下，摇床孵育1h；

(6)一抗：封闭结束后，加入兔抗MNSFβ抗体(购自北京康为世纪生物技术有限公司)(1:4000稀释)或小鼠抗β-actin抗体(1:2000稀释)，4℃下，摇床孵育过夜；

(7)二抗：一抗孵育结束后，回收一抗，PBST洗膜3次，5min/次，加入HRP标记的抗兔或抗小鼠二抗(购自Proteintech)(1:8000稀释)，室温下，摇床孵育2h；

(8)显影：二抗孵育结束后，PBST洗膜3次，5min/次，吸干膜上液体，在膜上均匀的滴加发光液，选用GENE GNOME SYNGENE BIO IMAGING系统显色发光；

(9)数据处理：用ImageJ软件对显色后的蛋白条带进行灰度值计算，将目的蛋白条带的灰度值与内参蛋白条带的灰度值比值作为相对表达量并进行统计分析。

检测结果如图3所示。其中，图A表示dMφ细胞中MNSFβ的mRNA的表达水平；图B表示dMφ细胞中MNSFβ的蛋白的表达水平。图B的上图表示一次代表性Western Blotting图；下图表示MNSFβ蛋白相对表达量的统计分析结果(Control dMφ：早孕期人工流产妇女的dMφ细胞，n＝6；RSA dMφ：RSM患者的dMφ细胞，n＝6；*：P<0.05，**：P<0.01)。

实施例4.检测早孕期人蜕膜中MNSFβ的表达水平

在本实施例中，发明人检测了早孕期人蜕膜中MNSFβ的表达水平。

具体地说，提供以下方法进行检测：流式细胞术检测

(1)从液氮中复苏收集的dMφ细胞，观察细胞中是否有白色絮状物，若有，则加入适量的DNA酶，37℃下，孵育30min；然后于4℃下，1000rpm，离心5min，弃上清；加入适量1640完全培养基，轻轻吹匀以重悬细胞，取出5×10

(2)在取出的5×10

(3)孵育结束后，加入1ml的预冷PBS，轻吹匀，4℃，1000rpm，离心5min，洗涤细胞，共洗涤3次；弃上清，加入250μl预冷的打孔液，轻柔吹打细胞沉淀，重悬细胞，避光，4℃下孵育20min。

(4)孵育结束后，加入800μl预冷的洗液(BD Biosciences，554723)，4℃，1000rpm，离心5min，洗涤细胞，共洗涤2次；洗涤后，加入100μl预冷的洗液，轻吹匀，重悬细胞后，加入1μl兔抗MNSFβ抗体，避光，4℃下孵育30min。

(5)孵育结束后，加入800μl预冷的洗液，4℃，1000rpm，离心5min，洗涤细胞，共洗涤2次；弃上清，100μl预冷的洗液，轻吹匀，重悬细胞后，加入1μl PE标记的兔二抗，避光，4℃下孵育30min。

(6)孵育结束后，加入800μl预冷的洗液，1000rpm，离心5min，洗涤细胞，共洗涤2次；弃上清，加入300μl预冷的洗液轻吹匀，重悬细胞后，转移到流式管中，上机检测。

检测结果如图4所示。其中图A表示dMφ细胞中MNSFβ表达水平的流式间标法检测结果。图A的上图表示一次代表性检测的荧光强度图；下图表示MFI值的统计分析结果。图B表示蜕膜全细胞中MNSFβ表达水平的流式间标法检测结果(RSM：RSM患者，RSM dMφ：RSM患者的dMφ细胞，n＝8；Control：正常早孕期妇女，Control dMφ：正常早孕期妇女的dMφ细胞，n＝9；*：P<0.05)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海市计划生育科学研究所

<120> 单克隆非特异性抑制因子-β作为反复自然流产临床评价的指标

<130> P2020-2584

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial sequence)

<400> 1

actccatctt cgcggtagc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial sequence)

<400> 2

ggagcacgac ttgatcttcc 20