一株促进金沙江石斛萌发的真菌菌株和应用

摘要

本发明提供了一株促进金沙江石斛萌发的真菌菌株和应用，属于植物保护技术领域。一株促进金沙江石斛萌发的真菌菌株为镰刀菌(Fusariumsp.)菌株1‑1‑2，保藏编号为CCTCCNO：M2020553。所述菌株1‑1‑2从金沙江石斛原球茎中分离而得。将所述菌株1‑1‑2与金沙江石斛共培养后，与其他真菌菌株相比，可极大促进金沙江石斛种子萌发，因此所述菌株1‑1‑2可在金沙江石斛萌发中的应用。因此本发明为提高金沙江石斛种子萌发率增加种群数量，进一步开展原生境保护工作提供了有利条件。

说明书

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一株促进金沙江石斛萌发的真菌菌株和应用。

背景技术

金沙江石斛(Dendrobium wangliangii)是金沙江干热河谷极小种群植物的典型代表，是认识兰科植物在干热河谷物种形成与演化的窗口植物，在药用及观赏方面均具有重要的潜在价值。分布区域狭窄、气候异常以及人为采集等因素的叠加，使金沙江石斛目前处于濒临灭绝的境地，亟待保护。

通过提高种子萌发率增加种群个体数量，是开展原生境保护的重要措施。成熟的兰科植物种子极其微小，没有贮存营养的胚乳组织，需要通过与兰科菌根真菌(Orchidmycorrhiza fungi,OMF)所形成的菌丝圈(Pelotons)获取营养，从而萌发分化出子叶和胚根，最终形成幼苗。因此，获得最适促萌发真菌是珍稀濒危兰科植物保护的关键步骤。利用金沙江石斛种子与其原生境的基质共生萌发形成原球茎，再从原球茎中分离纯化并鉴定共生真菌，最后将共生真菌分别与金沙江石斛种子回接，筛选出金沙江石斛最适促萌发真菌。从而为高效生产菌根化幼苗提供必要条件，为开展金沙江石斛野外回归和原生境保护奠定基础。

目前，兰科菌根真菌虽然与金沙江石斛种子共生萌发，但萌发率不高，这大大阻碍了金沙江石斛幼苗的培育进程。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株促进金沙江石斛萌发的真菌菌株1-1-2，与其他类型真菌相比，该菌株能够大大提高金沙江石斛的萌发率。

本发明提供了一株促进金沙江石斛萌发的真菌菌株，所述真菌菌株为镰刀菌(Fusarium sp.)菌株1-1-2，保藏编号为CCTCC NO：M2020553。

优选的，所述镰刀菌菌株1-1-2的ITS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供了一种所述促进金沙江石斛萌发的真菌菌株的培养方法，包括以下步骤：

将促进金沙江石斛萌发的真菌菌株接种至PDA培养基上进行培养。

本发明提供了所述促进金沙江石斛萌发的真菌菌株在促进金沙江石斛种子萌发中的应用。

优选的，所述促进金沙江石斛种子萌发的方法，将金沙江石斛种子和所述促进金沙江石斛萌发的真菌菌株接种至萌发培养基中进行共培养，获得萌发的金沙江石斛。

优选的，所述促进金沙江石斛萌发的真菌菌株先接种至萌发培养基中进行预培养一周后再接入金沙江石斛种子。

优选的，所述金沙江石斛种子以悬浮液的形式添加到萌发培养基中，所述悬浮液的种子密度为700～900粒/ml。

优选的，所述促进金沙江石斛萌发的真菌菌株的接种量为直径0.8cm的菌块/培养皿。

优选的，所述萌发培养基是燕麦琼脂培养基。

优选的，所述共培养的温度为23～27℃；

所述共培养的时间为30～45d。

本发明提供的促进金沙江石斛萌发的真菌菌株，经形态学和分子生物学鉴定为镰刀菌菌株1-1-2，保藏编号为CCTCC NO：M2020553。将所述镰刀菌菌株1-1-2与成熟金沙江石斛种子共培养，结果表明，与1-1-2菌株共生培养的金沙江石斛种子，除了萌发阶段2与萌发阶段3，略低于与2-1-2菌株共生培养的金沙江石斛外，其他各萌发阶段的萌发比例及萌发率都显著高于其他菌株共培养的金沙江石斛。可见本发明提供的镰刀菌菌株1-1-2较其他常规真菌菌株相比，在促进金沙江石斛萌发方面具有明显优势，能显著提高该种子萌发率，从而为高效生产菌根化幼苗提供必要条件，为进一步开展原生境保护工作提供了基础。

附图说明

图1为金沙江石斛迁地共生萌发图；

图2为镰刀菌属1-1-2菌株形态图，其中图2A为菌落形态图；图2B为分生孢子图；

图3为菌株1-1-2基于ITS序列构建的系统发育树图；

图4为菌株1-1-2及其他菌株与金沙江石斛种子共生萌发对比图；

图5为菌株1-1-2与金沙江石斛种子于OMA培养基上共生萌发图，其中图5A.阶段1，吸水膨胀；图5B.阶段2，种胚突破种皮，原球茎形成；C.阶段3，出现原生分生组织，原球茎发育，视为萌发；D.阶段4，长出幼叶，幼苗形成。

生物材料保藏信息

镰刀菌(Fusarium sp.)菌株1-1-2，于2020年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学校内(武汉大学第一附属小学对面)，中国典型培养物保藏中心211室，其保藏编号为CCTCC NO：M2020553。

具体实施方式

本发明提供了一株促进金沙江石斛萌发的真菌菌株，所述真菌菌株为镰刀菌(Fusarium sp.)菌株1-1-2，保藏编号为CCTCC NO：M2020553。

在本发明中，所述镰刀菌菌株1-1-2从金沙江石斛原球茎中分离而得。将镰刀菌菌株1-1-2接种至PDA培养基上培养，观察菌落形态特征(培养4d)：菌丝为乳白色，气生，菌落形态规则，呈圆形，每两天生长速度为2.000±0.255cm，培养时间较短，7天左右铺满9cm的平板，初期为白色短绒状菌丝，后期可见次级代谢产物颜色为淡黄色。在光学显微镜下观察分生孢子，分生孢子有两种形态，小型分生孢子卵圆形至柱形，有1～3个隔膜；大型分生孢子镰刀形或长柱形，散生于气生菌丝上，分隔数多为3-10分隔，有的分隔数更多，隔膜也不一样，有的分隔明显，而有的分隔不明显。未观察到厚垣孢子。同时将镰刀菌菌株1-1-2进行分子生物鉴定，PCR扩增ITS基因片段，得到所述镰刀菌菌株1-1-2的ITS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1(CTGATCCGAGGTCAACATTCAGAAGTTGGGGGTTTAACGGCATGGCCGCACCGCGTTCCAGTTGCGAGGTGTTAGCTACTACGCAATGGAGGCTGCAGTGAGACCGCCACTAGATTTAGGGGGCGGCTGGTCCTAAGACTCGCCGATCCCCAACACCAAACCCGGGGGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTTATTTGTTTGTTTTACTCAGAAGTTACAATAACAGCAAGAGTTTGGATCCTCTGGCGGGCCGTCCCGTTTTACCGGGCGCGGGCTGATCCGCCGAGGCAACATTAAGGTATGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTCACCCTACGGAA)所示，经比对与镰刀菌属菌株(Fusarium sp.)最为相似，相似度达到99％，将ITS片段构建系统发育树(见图3)。

本发明提供了一种所述促进金沙江石斛萌发的真菌菌株的培养方法，包括以下步骤：

将促进金沙江石斛萌发的真菌菌株接种至PDA培养基上进行培养。所述培养的温度优选为28℃，所述培养的时间优选为6～10d，更优选为7d。

本发明提供了所述促进金沙江石斛萌发的真菌菌株在促进金沙江石斛种子萌发中的应用。

在本发明中，所述促进金沙江石斛种子萌发的方法，优选将金沙江石斛种子和所述促进金沙江石斛萌发的真菌菌株接种至萌发培养基中进行共培养，获得萌发的金沙江石斛。

在本发明中，所述共培养优选将所述促进金沙江石斛萌发的真菌菌株先接种至萌发培养基中进行预培养后再接入金沙江石斛种子。所述预培养的时间优选为6～8d，更优选为7d。所述预培养的温度优选为25～30℃，更优选为28℃。所述萌发培养基优选是燕麦琼脂培养基。

在本发明中，所述促进金沙江石斛萌发的真菌菌株的接种量优选为直径0.8cm的菌块/培养容器。所述接种的方法优选挑取PDA培养基菌落边缘的菌丝于OMA培养基表面中央，封膜，培养。

在本发明中，所述金沙江石斛种子优选以悬浮液的形式添加到萌发培养基中，所述悬浮液的种子密度优选为700～900粒/ml，更优选为750～850粒/ml，最优选为800粒/ml。所述悬浮液的溶剂优选为无菌水。所述金沙江石斛种子的接种量优选为750～850粒/ml，更优选为800粒/ml。

在本发明中，所述共培养的温度优选为23～27℃，更优选为25℃。所述共培养的时间优选为30～45d，更优选为35～40d。金沙江石斛种子萌发过程过分为4个阶段，各阶段的生长特征见表1。

表1金沙江石斛种子萌发阶段描述

共培养结果表明，与1-1-2菌株共生培养的金沙江石斛，除了阶段2与阶段3，略低于2-1-2菌株共生培养的金沙江石斛，其他各阶段比例及萌发率都显著高于其他菌株共培养的(如图4所示)。

下面结合实施例对本发明提供的一株促进金沙江石斛萌发的真菌菌株和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

镰刀菌菌株1-1-2的诱导分离纯化方法

1)利用迁地共生萌发技术，将金沙江石斛原生境中的树皮采回实验室，磨成粉末做成共生萌发基质，播种成熟的金沙江石斛种子，待种子萌发形成原球茎，进而出芽形成幼苗，如图1所示；

2)挑取长势良好的原球茎对半切后，置于PDA培养基上，在黑暗28℃恒温条件下倒置培养。待菌丝长到一定长度时进行纯化，纯化过程是不断地挑取菌落边缘菌丝到新的PDA培养基上作系列转移，转移3～5次后，可得纯菌落。对获得的真菌进行形态和分子鉴定，同时将金沙江石斛种子与所得真菌进行共生萌发实验筛选出最适促萌发菌株；

3)真菌保存：利用常规的试管斜面法对已纯化的真菌进行保存。将配制好的适量PDA培养基倒入规格为18×20mm的玻璃试管中，培养基倒入量约为试管体积的1/3。硅胶塞后，放入高压灭菌锅内灭菌(121℃，25min)。灭菌后将试管置于超净工作台内摆成斜面待用。在超净工作台上，将纯化后的菌株用灭过菌的竹签挑取边缘菌丝接种于PDA斜面上，并注明菌种、编号、日期。将接种后的试管置于28℃恒温培养箱中培养。待菌丝长满PDA斜面时，将试管取出放入4℃冰箱内保存。

分离得到的最适促萌发菌株保藏于中国典型培养物保藏中心；地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学校内(武汉大学第一附属小学对面)，中国典型培养物保藏中心211室。该菌株分类命名为镰刀菌属(Fusarium sp.)保藏号为CCTCC NO：M2020553，保藏日期为2020年9月29日。

实施例2

镰刀菌1-1-2菌株的鉴定方法

1)菌株的形态学分类

将菌株接种在PDA培养基上，观察菌落形态特征，如图2所示：图2A为菌株1-1-2在PDA培养基上生长4天的菌落形态特征图，其菌丝为乳白色，气生，菌落形态规则，呈圆形，每两天生长速度为2.000±0.255cm，培养时间较短，7天左右铺满9cm的平板，初期为白色短绒状菌丝，后期可见次级代谢产物颜色为淡黄色。图2B为1-1-2分生孢子图，分生孢子有两种形态，小型分生孢子卵圆形至柱形，有1～3个隔膜；大型分生孢子镰刀形或长柱形，散生于气生菌丝上，分隔数多为3～10分隔，有的分隔数更多，隔膜也不一样，有的分隔明显，而有的分隔不明显。未观察到厚垣孢子。

2)分子生物学鉴定

采用CTAB法提取真菌DNA，PCR扩增所用通用引物为ITS1和ITS4；PCR反应体系(50μl)包括：2.5μl 10×PCR缓冲液，0.4μl dNTP，1.5μl Mg

扩增反应在PCR仪Perkin Elmer上进行如下PCR循环：94℃预变性3min，循环1次；94℃变性1min，51℃退火30s，72℃延伸1min，30次循环；最后72℃延伸5min。PCR扩增产物送昆明擎科生物工程有限公司进行测序。

对所测ITS序列提交至美国国立生物技术信息中心数据库进行比对，初步确认其分类地位为Fusarium；然后把Fusarium属下的27已知种的ITS序列与菌株1-1-2的ITS序列一起构建系统发育树。结果如图3基于ITS序列构建的系统发育树图结果显示，菌株1-1-2与镰刀菌属其他已知物种不在聚在一个小分枝上(支持率为55％)。基于以上形态学和分子生物学的鉴定信息，把菌株1-1-2鉴定为Fusarium属下的一个疑似新种，命名为Fusariumsp.1-1-2。

实施例3

将实施例2保藏的Fusarium sp.1-1-2菌株接种至PDA培养基(200g/L土豆，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂)上，28℃恒温条件下培养7d，长出菌丝，得到Fusarium sp.1-1-2菌种。

对比例1

按照实施例1中记载的分离方法，分离得到1-5-1、1-6-4、2-1-4-⑤、2-1-4-②、未知种1-3-1、2-1-2菌株，并利用实施例1记载的方法进行菌种鉴定。

分离方法与1-1-2菌株分离方法一样，1-5-1、1-6-4、2-1-4-⑤、2-1-4-②、2-1-2菌种鉴定结果均为镰刀菌属真菌。

实施例4

1-1-2菌株对成熟金沙江石斛种子萌发的促进作用

1)萌发培养基配制

配制燕麦琼脂培养基(OMA培养基配方：4g/L燕麦+10g/L的琼脂，pH＝5.8)作为真菌和种子共生萌发培养基。OMA培养基具体配制方法：称取4g发酵专用燕麦粉和10g琼脂，煮沸搅拌，混匀后移入烧杯中补充水至1L，调节pH至5.8，倒入三角瓶中灭菌(121℃，25min)，灭菌后在超净工作台分装于直径为9cm的无菌培养皿中冷却。用无菌竹签挑取PDA培养基菌落边缘的菌丝于OMA培养基表面中央，封膜，做好标记，置于28℃恒温培养箱内培养7天，以备后续实验使用。

2)种子播种

将适量的金沙江石斛种子和无菌水加入灭菌后的试管中，混匀后制作成种子悬浮液。然后用移液枪吸取1ml悬浮液(约含800粒种子)，均匀地播种在接有1-1-2及其他菌株的OMA培养基表面。盖好培养皿，封口膜密封，做好标记。以上各处理每组重复10个培养皿。光照条件(12/12h，光/暗)，人工培养箱内恒温(温度条件，25±2℃)培养。

3)观察与数据统计分析

种子萌发大约40d后，打开培养皿，对金沙江石斛种子萌发情况按照表1进行分级描述。

记录下阶段1-4以及萌发的数量，结果如表2所示。

与1-1-2菌株共生培养的金沙江石斛，除了阶段2与阶段3，略低于2-1-2菌株共生培养的金沙江石斛，其他各阶段比例及萌发率都显著高于其他菌株共培养的(如图4所示)。

图5中，即金沙江石斛种子与镰刀菌1-1-2菌株共培养后，各个阶段的生长情况。图5A.阶段1，吸水膨胀；图5B.阶段2，种胚突破种皮，原球茎形成；图5C.阶段3，出现分生组织，原球茎发育，即视为萌发；图5D.阶段4，长出幼叶，幼苗形成。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 云南大学

<120> 一株促进金沙江石斛萌发的真菌菌株和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 515

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgatccgag gtcaacattc agaagttggg ggtttaacgg catggccgca ccgcgttcca 60

gttgcgaggt gttagctact acgcaatgga ggctgcagtg agaccgccac tagatttagg 120

gggcggctgg tcctaagact cgccgatccc caacaccaaa cccgggggct tgagggttga 180

aatgacgctc gaacaggcat gcccgccaga atactggcgg gcgcaatgtg cgttcaaaga 240

ttcgatgatt cactgaattc tgcaattcac attacttatc gcattttgct gcgttcttca 300

tcgatgccag aaccaagaga tccgttgttg aaagttttga tttatttgtt tgttttactc 360

agaagttaca ataacagcaa gagtttggat cctctggcgg gccgtcccgt tttaccgggc 420

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