一种翻译组学标准品及其制备方法

摘要

本发明公开了一种翻译组学标准品及其制备方法以及标准品细胞株的筛选方法和相关试剂盒；本发明通过利用人类肝癌细胞MHCC97H制得了翻译组学标准品；该标准品具有代次间差异小，稳定性高的优点。为翻译组学提供了一种可重复好的标准品。

说明书

技术领域

本发明属于细胞翻译组学领域，具体涉及一种翻译组学标准品及其制备方 法。

背景技术

近年来，随着生命组学研究包括基因组学、转录组学、翻译组学和蛋白质组 学的快速发展以及生物信息与大数据科学交叉应用的推动下，孕育了一种新型医 学概念和医疗模式，即精准医疗。科技论文《翻译组学：方法及应用》(生命的 化学，2017,37(1)：70-79)阐述了广义的翻译组(translatome)指直接参与翻译 过程的所有元件，包括但不限于核糖体、正在翻译的mRNA(translating mRNA， 又称RNC-mRNA)、tRNA、调控性RNA(如miRNA、lncRNA等)、新生肽链 (nascent polypeptide chain)、各种翻译因子等；狭义的翻译组特指正在翻译的 mRNA。

生命组学研究是揭示疾病机制和精准医疗最重要的手段之一，组学的数据质 量直接关乎疾病机制的准确性和精准医疗的有效性。然而，目前的组学数据因各 实验室选择的标准品没有统一，同时样品处理方式多样，测定平台多样化以及分 析技术不精准，导致跨平台和跨实验室数据的重复性和实验性差。人类通用参考 RNA标准品(Universal HumanReference RNA,UHRR)是包括HeLa在内的10 种癌细胞系的混合RNA，其不稳定性是众所周知的。实际上，在UHRR批次间 比较中，Pearson相关性仅达到R

发明内容

本研究通过实例提供一种翻译组学标准品及其制备方法、标准品细胞株的筛 选方法及其一种试剂盒，从而获得了一种高稳定性的翻译组标准品。

为了实现上述的目的，本发明按照如下技术方案进行实施：

一种翻译组学标准品，所述标准品为从MHCC97H细胞株中提取获得的总 RNC-mRNA。

优选地，所述的总mRNA由以下方法制备而成：步骤一、培养MHCC97H 细胞；步骤二、从细胞中分离获得RNC；步骤三、从RNC中分离获得RNC-mRNA。

本发明还提供一种试剂盒，所述的试剂盒包含有权利要求1或2任一项所述 的翻译组学标准品。

本发明还提供了一种翻译组学标准品的制备方法；包括以下步骤：

步骤一、培养MHCC97H细胞；

步骤二、从细胞中分离获得RNC；

步骤三、从RNC中分离获得RNC-mRNA。

优选地，步骤二的具体操作为：

1、待细胞长满75cm

2、弃培养上清，将培养瓶置冰上，用预冷PBS洗两次；本发明中，如 无特殊说明，所谓预冷指的是将试剂放置在冰水混合物中至其温度下降至与冰水 混合物相同。

3、尽弃PBS，加入2mL预冷RB裂解液，冰上裂解30min；

4、用细胞刮刮取细胞，将裂解产物转移至预冷EP管中；

5、13200rpm，4℃离心10min；

6、向超速离心管内加入15mL预冷30％蔗糖溶液；

7、将步骤5中的上清转移至超速离心管内；

8、42500rpm，4℃超速离心5h；

9、弃上清，用预冷PBS小心洗涤RNC沉淀表面2次；获得RNC。

优选地，步骤三的具体操作为：

1、向步骤二所获RNC沉淀块加入1mL Trizol，其中每1000微升Trizol加 入0.2mL氯仿，剧烈摇动混匀15s，室温放置3min；

2、12000×g，4℃离心15min，使样品分成三层；

3、吸取上层水相，转移至新的1.5mL EP管中，操作时不要吸取到中间层 液体；

4、加入800μL异丙醇，倒置混匀；

5、置于-20℃静置8h；

6、8h后，12000×g，4℃离心30min，去除上清液；

7、加入1mL 75％乙醇；乙醇需-20℃提前预冷30min；

8、7500×g，4℃离心5min，去除上清；

9.重复步骤7)、8)一次；

10.去除残留的乙醇，打开管盖，风干5min；

11.根据颗粒的大小加入约30～60微升RNase Free纯水溶解，此步骤得到 RNC-mRNA标准品，置于-80°冰箱保存。

本发明还提供了一种翻译组学标准品细胞株的筛选方法；包括以下步骤：

步骤一、培养待筛选的目标细胞；具体为：使用含10％胎牛血清，1％双抗， 0.5％环丙沙星的DMEM完全培养基培养细胞，细胞长至90％密度进行胰酶消化 传代，连续采集8～10个代次细胞，每次分别采集8×10

步骤二、从细胞中分离获得RNC；具体为

1、待细胞长满75cm

2、弃培养上清，将培养瓶置冰上，用预冷PBS洗两次；

3、尽弃PBS，加入2mL预冷RB裂解液，冰上裂解30min；

4、用细胞刮刮取细胞，将裂解产物转移至预冷EP管中；

5、13200rpm，4℃离心10min；

6、向超速离心管内加入15mL预冷30％蔗糖溶液；

7、将步骤5中的上清转移至超速离心管内；

8、42500rpm，4℃超速离心5h；

9、弃上清，用预冷PBS小心洗涤RNC沉淀表面2次；获得RNC；

步骤三、从RNC中分离获得RNC-mRNA；具体步骤为：

1、向步骤二所获RNC沉淀块加入1mL Trizol，其中每1000微升Trizol加 入0.2mL氯仿，剧烈摇动混匀15s，室温放置3min；

2、12000×g，4℃离心15min，使样品分成三层；

3、吸取上层水相，转移至新的1.5mL EP管中，操作时不要吸取到中间层 液体；

4、加入800μL异丙醇，倒置混匀；

5、置于-20℃静置8h；

6、8h后，12000×g，4℃离心30min，去除上清液；

7、加入1mL 75％乙醇；乙醇需-20℃提前预冷30min；

8、7500×g，4℃离心5min，去除上清；

9.重复步骤7)、8)一次；

10.去除残留的乙醇，打开管盖，风干5min；

11.根据颗粒的大小加入约30～60微升RNase Free纯水溶解，此步骤得到总 RNC-mRNA样品；

步骤四、翻译组定量稳定性评估：将步骤3所获的各个细胞株不同代次的 RNC-mRNA进行测序，进行定性和定量检测；对同一细胞株不同代次间的 RNC-mRNA组表达量进行相关性分析，获得皮尔逊相关系数；对比不同细胞株 之间的相关系数，相关系数最高的细胞株选为制备翻译组学标准品的细胞株。

在本发明所述的筛选方法中，可以直接对多株细胞直接如上述步骤四的方法 进行横向比较相关系数，也可以以转录组的数据的相关性，做一次初筛，获得转 录组学层面比较稳定的细胞株；然后在选定的较稳定的目标细胞株进行本细胞株 代次间的翻译组学的相关系数分析，将相关系数最高的细胞株选为标准品细胞 株。

优选地，步骤一种所述的筛选的目标细胞为人类肝癌细胞MHCC97H、 HCCLM6、HCCLM3。

本发明的有益的效果在于：本发明通过连续采集人肝癌细胞系MHCC97H、 HCCLM3、HCCLM6,人肺癌细胞系A549,人宫颈癌细胞系Hela这5株细胞系， 并进行转录组检测，排除转录组稳定性较差的A549和Hela细胞后，进而进行 MHCC97H、HCCLM3和HCCLM6肝癌细胞的翻译组测序，评价并得到细胞传 代过程中翻译组稳定性最高的细胞株MHCC97H，以此选择稳定性最高的细胞株 进行候选参比物质采集对象，筛选出在翻译组学层次中存在高度稳健性的参比细 胞株作为可广泛推广的标准品，并以此开发轻度降解样品的翻译组建库和分析流 程，增加该类样品的稳健性。本发明展示了一个跨多次传代的翻译组稳定的人细胞系及其相应的标准品，适合作为长期生产参考翻译组标准物质的材料。

附图说明

为了清楚地展示本发明具体的实施方式以及在实验中采用的某些检测技术， 下面将对实施方案及采用的技术进行描述，主要通过附图的形式进行介绍。

图1.五株细胞不同代次转录组定量稳定性评估。图A～E分别为MHCC97H、 HCCLM6、HCCLM3、Hela和A549五株细胞不同代次间转录组定量相关性分析，横纵坐标 代表不同细胞代次；图F为分别选取MHCC97H细胞第3代、5代、7代和9代细胞进行三 个转录组测序的技术重复。

图2.MHCC97H转录组多中心、多时空测序稳定性评估。分别在不同时间下 (2021年的5月和12月)获得两批MHCC97H不同代次细胞株RNA，进行转录组建库和 测序，并进行定量相关性分析。其中A图为2021年12月的转录组测序定量相关性分析；B 图为12月和5月对应样品的定量相关性比较分析。将MHCC97H不同代次细胞株RNA提 取后一分为二，分别交给两位均具备2年高通量测序经验的实验员进行转录组建库并测序， 其中图C为实验员2操作下得到的不同代次MHCC97H转录组测序定量相关性分析结果； 图D为实验员1和实验员2对MHCC97H转录组测序定量相关性比较分析结果。将 MHCC97H不同代次细胞株RNA提取后一分为二，将MHCC97H的RNA样品分别送至承 启生物和赛哲基因，图E和F为两家商业公司的转录组测序定量相关性分析结果，横纵坐 标为细胞代次。使用不同测序数据比对算法对同一批MHCC97H不同代次转录组测序数据 进行分析得到定量相关性分析数据；图G为不同实验室对同一样品定量相关性分析；图H 使用Bowtie2算法，图I使用Hista算法。分别采用两种不同的核糖体RNA去除流程后进行 转录组测序，图J为使用Ribominus法去除核糖体RNA后测得的MHCC97H转录组数据相 关性分析结果，图K为PolyA+mRNA富集法和Ribominus法对MHCC97H转录测序定量相 关性比较分析结果。

图3.天然降解RNA样本建库方法评估。图A：模拟环境暴露下引起的不同代次 的MHCC97H细胞RNA降解，得到降解RNA进行琼脂糖凝胶电泳图；图B～D使用不同算 法(FANSe、bowtie2和Hista)对采用polyA+mRNA富集法建库的MHCC97H不同代次降 解的RNA样品和未降解RNA样品测序数据进行定量相关性比较分析，normal代表未降解 RNA样品，degradation代表降解样品。

图4为MHCC97H翻译组定量稳定性评估。从第6代MHCC97H细胞连续采集到第12 代次MHCC97H细胞系，每个代次设计两个独立重复样品，进行RNC-mRNA提取，共得到 14个样品。进行翻译组测序，分析数据后得到样品间两两翻译组定量数据，进行皮尔森相 关性分析，得到相关系数R，展示在方格中。

图5为HCCLM3翻译组定量稳定性评估。从第6代HCCLM3细胞连续采集到第12代 次HCCLM3细胞系，每个代次设计两个独立重复样品，进行RNC-mRNA提取，共得到14 个样品。进行翻译组测序，分析数据后得到样品间两两翻译组定量数据，进行皮尔森相关性 分析，得到相关系数R，展示在方格中。

图6为HCCLM6翻译组定量稳定性评估。从第6代HCCLM6细胞连续采集到第12代 次HCCLM6细胞系，每个代次设计两个独立重复样品，进行RNC-mRNA提取，共得到14 个样品。进行翻译组测序，分析数据后得到样品间两两翻译组定量数据，进行皮尔森相关性 分析，得到相关系数R，展示在方格中。

图7为MHCC97H蛋白质组定量稳定性评估。其中图A为不同代次MHCC97H 翻译组测序定量相关性分析结果；图B/C为不同代次MHCC97H细胞在DDA和DIA模式 下采集的蛋白质组学定量相关性分析结果；图D/E分别为第三代次的MHCC97H细胞在 DDA和DIA采集模式三次独立实验蛋白质组定量相关性分析结果。

图8为不同实验室MHCC97H蛋白质组定量相关性分析。其中图A为四家实 验采用的质谱、色谱型号、高效液相色谱柱和分析柱规格；图B为不同实验室鉴定蛋白质 等电点分布图和两两KS分析得到的P值结果；图C/D分别为不同实验室对同一样品在DDA 和DIA模式下鉴定蛋白质的相关性分析结果。

具体实施的方式

本发明具体的实施方式通过实施例来辅助解释，除检测所用的技术对本发明 不做任何形式的限制外，描述的实施例中部分方案属发明的一部分实施例，在本 领域的普通技术操作人员在没有创造性的成果获得的实施例，均属本发明的保护 范围。

实施例1

主要试剂及配方

细胞系

人类肝癌细胞MHCC97H、HCCLM6和HCCLM3购自复旦大学生物医学研 究院；MHCC97H细胞为常规常见且容易获得的细胞，其中多篇已经授权的专利 中(CN107523544B、CN102813643B)均披露了该细胞系的来源。人宫颈癌Hela 细胞和人非小细胞肺癌细胞A549购买自美国菌种保藏中心。

细胞培养试剂

Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)培养基，美国Life technology 公司；

胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)，美国Life technology公司；

双抗(Penicillin-streptomycin,PS)，广州捷倍斯生物科技公司；

胰酶，美国Amresco公司；

环丙沙星，(Ciprofloxacin,CIP)，广州南新制药有限公司；

二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)，美国Sigma公司；

T25、T75和T175细胞培养瓶，美国Becton Dickison公司；

左旋谷氨酰胺(L-Glutamine)，美国Sigma公司；

主要仪器

分析天平，英国Syngene公司；

MilliPore纯水系统，美国MilliPore公司；

超净工作台，中国江苏台苏净安泰公司；

小型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；

制冰机，日本三洋公司；

Optima L-XP超速离心机，美国Beckman公司；

BGIseq500/2000测序仪，中国华大智造公司；

RNC提取试剂及配方

1.RB缓冲液：5mL 1M HEPES，2.5mL 1.5M MgCl2，25mL 2M KCl， 212.5mL超纯水。121℃高压湿法灭菌1h。冷却至室温后加入2.5mL 200mM DTT，2.5mL 10mg/mL放线菌酮，并用KOH调节pH至7.4。

2.RB裂解液：含1％Triton X-100的RB缓冲液。

3. 30％蔗糖溶液：30g蔗糖，100mLRB缓冲液。

实验方法

细胞培养

使用含10％胎牛血清，1％双抗，0.5％环丙沙星的DMEM完全培养基培养细 胞，细胞长至90％密度进行胰酶消化传代，连续采集10个代次细胞，每次分别 采集8×10

RNC分离

具体方法参见参考文献[1,2]，亦可以可见以下具体步骤：

1、待细胞长满75cm

2、弃培养上清，置冰上，用预冷PBS洗两次。

3、尽弃PBS，加入2mL预冷RB裂解液，冰上裂解30min。

4、用细胞刮刮取细胞，将裂解产物转移至预冷EP管中。

5、13200rpm，4℃离心10min。

6、向超速离心管内加入15mL预冷30％蔗糖溶液。

7、将步骤5中的上清小心转移至超速离心管内。

8、42500rpm，4℃超速离心5h。

9、弃上清，用预冷PBS小心洗涤RNC沉淀表面2次。

RNC-mRNA提取

往上一步提取的RNC沉淀块加入1mL预冷总RNA抽提试剂，按说明书操 作提取RNC-mRNA。加入1mL预冷Trizol(总RNA抽提试剂)，充分震荡混匀， 具体提取操作如下：

1.每1000微升Trizol加入0.2mL氯仿，剧烈混匀(可涡旋)15s，室温 放置3min，可观察到样品开始分层；

2. 12000×g，4℃离心15min，使样品分成三层；

3.小心吸取上层水相，约600μL，转移至新的1.5mL EP管中，注意操作 时不要吸取到中间层液体；

4.加入800μL异丙醇，倒置混匀；

5.置于-20℃静置8h；

6. 8h后，12000×g，4℃离心30min，去除上清液；

7.加入1mL 75％乙醇(需-20℃提前预冷30min)；

8. 7500×g，4℃离心5min，去除上清；

9.重复步骤7)、8)一次；

10.去除残留的乙醇，打开管盖，风干5min；

11.视Pellet大小加入约30～60微升RNase Free纯水溶解，此步骤得到RNC 标准品，置于-80°冰箱保存。

RNA提取与转录组测序文库构建

按照人类poly-AmRNA标准转录组建库及测序流程进行，具体实验步骤可 参考申请人已发表文献[1,2]。

总RNA的提取流程为：待细胞长满75cm

富集总mRNA的流程使用诺唯赞poly-AmRNA富集试剂盒(VAHTS mRNA CaputreBeads)富集poly-AmRNA。具体步骤见说明书：

降解RNA样品转录组建库

使用诺唯赞Ribo-offrRNA depletion kit(Human/Mouse/Rat)去除试剂盒对 降解RNA样品建库。具体步骤可参考该产品的使用说明书。

通过MGI转录组建库试剂盒进行文库构建。使用BGIseq2000高通量测序平 台进行PE150测序。测序主体数据使用FANSe3将reads比对到人类转录组参考 序列，参数为-L80-E5-I0-S14-B1-U0。

本专利中出现的不同比对(Mapping)算法的分析参数

蛋白质提取

按照碧云天公司SDS蛋白质裂解液细胞样品蛋白质提取说明书进行蛋白质 提取，具体操作方法如下：

1.融解SDS裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入 PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM；

2.去除细胞培养液，用PBS洗一遍；

3.根据细胞数量，按每一百万细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解 液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触；

4.在冰上裂解30min。每隔10分钟涡旋震荡15秒；

5. 17000×g，4℃，离心30分钟，吸取上清液为蛋白质标准品。置于-80°冰箱保 存。

必要时，可使用BCA法蛋白质浓度定量试剂盒检测蛋白质浓度。

滤器辅助样品制备法(Filter-aided sample preparation,FASP)酶解

1、向每管200微克蛋白样品中加入适当体积的蛋白变性剂，并使尿素终浓度大 于6M，此时若液体有可见沉淀,可使用35％功率超声20s，每隔5s暂停一 次；

2、加入50mM的DTT，置于37℃水浴锅1h；

3、加入100mM的IAA，室温静置30min；

4、将经过还原和烷基化的蛋白样品转移至30kDa的超滤管中，4℃，12000×g 离心20min；

5、加入100μL 8M尿素，4℃，12000×g离心20min，重复此步骤一次；

6、加入100μL 50mM TEAB，4℃，12000×g离心20min，重复此步骤四次；

7、加入50μL 50mM TEAB后，再加入胰酶，其中蛋白量与胰酶量的比例为1: 30；

8、将超滤管置于干净套管中，用封口膜密封管口，放置37℃恒温箱中孵育12 h；

9、4℃下12000×g离心20min收集肽段。

10、冻干肽段样品于-80℃冰箱保存。

反相液质连用(Reversed-phase liquid chromatography combine massspectrum,RPLC-MS)

1、使用10μLA液溶解肽段，采用装有反相色谱柱Durashell C

2、将预分离得到的肽段组分冻干，使用25μLA液溶解肽段粉末，4℃，12000 ×g离心20min，取10μL样品进行MS鉴定；

3、Orbitrap Fusion质谱仪具体参数设置如下：循环时间设置为3.5s、MS1的分 辨率120K、MS1的扫描范围350-1550；MS2的分辨率设为15K，离子碎裂 模式为HCD、动态排除45s,n＝1、AGC阈值为5e4、最大注入时间90ms； 得到raw文件，该文件为蛋白质组原始数据。

数据库搜索

使用蛋白质鉴定检索软件Maxquant1.6.2进行蛋白质搜库定性和定量分析， 使用的数据库为搜库参数如下：MS1的容差值为10ppm,二级碎片的容差值为 0.02Da、允许的最大的漏切数为2、Carbamidomethyl(半胱氨酸)固定修饰、 甲硫氨酸氧化(甲硫氨酸)、乙酰化(蛋白N端)为可变修饰、蛋白鉴定控制肽段 水平FDR<0.01,蛋白水平FDR<0.01，特异肽段至少大于1。

参考文献：本发明中所使用的方法若有不详尽之处，可参考下面两篇参考文 献。

1.Wang,T.,et al.,Translating mRNAs strongly correlate to proteins ina multivariate manner and their translation ratios are phenotypespecific.Nucleic Acids Res,2013.41(9):p.4743-54.

2.Li,D.,et al.,Optimal Settings of Mass Spectrometry Open SearchStrategy for Higher Confidence.J Proteome Res, 2018.17(11):p.3719-3729.

实施例2结果与讨论

MHCC97H可作为转录组标准品稳定来源细胞株

发现筛选潜在稳定参考细胞株

本发明检测了5种常用细胞系，MHCC97H、HCCLM6、HCCLM3、HeLa 和A549。对于每一个细胞系，本发明进行了8～11代的培养，并从每一代中取样。 从每个样本中提取总RNA，并通过电泳检查RNA质量，以验证它们未被降解。 然后对polyA+mRNA进行测序，并使用RPKM法进行定量。彼此间的互相关分 析表明，MHCC97H的转录组最为稳定，Pearson R

MHCC97H转录组稳定性评估

一个好的参考标准品应该易于生产，并有一个稳健的标准处理方案作为补 充，理想情况下，该方案可以产生始终相同的结果。引入偏差的主要步骤是细胞 培养、mRNA富集、文库构建/测序和数据处理算法。首先，分别于2021年5月 和12月对两个批次的MHCC97H细胞系进行传代培养。基因表达的代次相似， 表明细胞培养物是一致的。其次，本发明通过不同实验者和不同实验室测试了流 程稳健性。本发明使用相同系列的总MHCC97H RNA作为起始材料，并要求另 一名实验者使用另一批文库构建试剂盒独立构建文库。结果(图2C/D)与前实验者 (图1A)几乎一致。此外,本发明还向1000多公里外的两家商业测序服务提供商发送了4份样本。承启生物(Chi-Biotech Co.Ltd.)配备了MGISEQ-2000测序仪， 赛哲生物(Sagene Co.Ltd.)配备了Illumina NovaSeq-6000测序仪。他们使用 Illumina试剂盒构建文库，并根据制造商的说明操作测序仪。R

接下来，本发明研究了映射和量化算法对稳健性的影响。本发明的标准SOP 使用FANSe3算法和RPKM方法对MHCC97H传代培养数据集的基因表达进行 定量，达到R

最后，本发明测试了不同的mRNA富集策略。本发明的标准方案使用 oligo-dT富集polyA+mRNA(成熟mRNA)，这在大多数研究中均有应用。另一种 策略是rRNA耗竭策略(也称为核糖消减)，通过探针杂交或RNaseH方法去除 rRNA。采用rRNA耗竭策略时，Pearson R

降解MHCC97H的RNA可以达到较高的转录组定量稳定性

一个好的RNA参考标准品应该在实际使用中具有较高的稳健性，即使发生 不可避免的降解，始终得到相同的结果。因实验环境中普遍存在的核糖核酸酶可 以快速降解核糖核酸。此外，由于RNA标准样品在长距离物流运输或者保存过 程中可能出现不同程度的降解而可能导致标准品失准。为了确认MHCC97H细 胞的RNA发生降解后是否依然具有较好的稳定性，本发明还对此类降解的RNA 标准品样本进行测试。首先，本发明创建了一个模拟环境暴露所致降解的场景： 将MHCC97H的RNA样本长时间暴露于空气中，因此环境中的RNA酶可能会 进入试管并降解RNA。这是实际实验中最常见的场景。电泳显示MHCC97H总 RNA有不同程度的降解(图3A)。本发明使用oligo-dT法富集mRNA，令人惊讶 的是，本发明为未降解样本开发的SOP可直接用于降解样本，而无需进行任何 实验和分析更改，即使使用不同的比对算法也可产生高度可比的基因表达值 (Pearson R

MHCC97H可作为翻译组标准品稳定来源细胞株

本发明已经通过转录组技术发现MHCC97H细胞在5种不同细胞株中稳定 性最高。为了进一步说明MHCC97H在蛋白质组学层面的稳定性，本发明对连 续代次MHCC97H、HCCLM3和HCCLM6三株细胞的翻译组样品进行检测，发 现MHCC97H翻译组(即对RNC-mRNA进行定量)定量相关性依然达到0.93 以上(图4)，而HCCLM3和HCCLM6相关性仅能达到0.91(图5)和0.82(图 6)以上，说明MHCC97H翻译组层面稳定性极高，适合作为翻译组标准品来源 细胞株。

MHCC97H蛋白质组定量稳定性评估

由于翻译组与蛋白质组相关性极高，蛋白质必须由翻译过程产生，因此蛋白 质组学是翻译组学的直接下游，通过对MHCC97H的蛋白质组稳定性检测可以 反映其翻译组的稳定性。本发明进一步同时检测MHCC97H的第2代至9代次 细胞翻译组和蛋白质组，使用Orbitrap Fusion Lumos质谱仪对肽断进行鉴定， 形成9个DDA及9个DIA数据集。通过目标-诱饵库(Target-decoy)搜库策略 降低鉴定假阳性率，最终得到不同代次间细胞的翻译组和蛋白质组定性及定量列 表。MHCC97H的第2代至9代次细胞翻译组相关性R

MHCC97H蛋白质组样品第三方实验室质谱一致性评估

好的蛋白质标准品在不同实验室中应达到相似的鉴定和定量效果，具有较高 的稳定性。本发明将同一批次标准样品MHCC97H细胞株全蛋白，分别给华南 理工大学(SCUT)，北京师范大学(BNU)、中国科学院大连化学物理研究所 (DICP)和暨南大学(JNU)每个实验室1mg蛋白质，所有实验室均采取标准 化的酶解及质谱实验流程，质控方法如下：采取超滤管酶解标准操作进行实验， 酶解后对肽断除盐并进行肽断浓度检测，富集后肽断≥1μg/μL。三家实验室仪器 全部统一为Thermo Orbitrap Fusion Lumos，一家使用Q Exactiveplus(图8A)。 通过目标-诱饵库(Target-decoy)搜库策略降低鉴定假阳性率，最终得到不同实 验室对同一样品的蛋白质定性及定量列表。对不同实验室鉴定蛋白质的等电点分 布进行两两KS统计分析，未得出具有统计学意义的差异(P值＞0.05)(图8B)， 说明同一样品蛋白质在四个实验室的测试下，鉴定蛋白质的等电点分布相对一 致。对四个实验室蛋白质定量结果进行DDA iBAQ定量一致性测试同实验室定 量重复性R

结论

本发明通过连续多代次采集MHCC97H等5株细胞株，进行转录组测序， 得出在5株实验细胞株中，MHCC97H第5-14代次细胞转录组定量相关性最高 R

此外，本发明的研究得出的结果是建立在MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6、 A549、Hela这5株细胞系上的，只能说在统一的标准操作流程下这5株实验株 中选择出的标准品MHCC97H的稳定性是最强的，相对于其它实验细胞株 MHCC97H细胞株更加稳定的原因可能是，在细胞多代次连续培养的过程中相较 于其它实验株，MHCC97H细胞株生长速度相对缓慢，基础代谢率较低，可能是 其稳定性较高的原因。

本发明在5株癌细胞系中，通过对MHCC97H细胞株进行传代一致性测试 在定性定量准确性评估上的评估，结果得出MHCC97H细胞株稳定性超高，可 作为组学数据产出的标准品稳定生产，并且本发明优化统一的测序流程和质谱流 程也具有超高的稳健性，可以在各个实验室广泛移植推广。总之，本发明的研究 旨在研发出每种生命组学数据质量控制的关键技术和应用示范，建立全流程的生 命组学数据质量控制标准方法和自动化工具，促进生命组学数据在基础医学和临 床医学的应用，加速生命组学数据在精准医疗领域的有效转换和实际应用，使各 种疾病患者受益。同时，进一步提升我国生命组学技术的国际影响力，使精准医 疗成为国家战略性新兴产业的重要组成部分。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。