非洲猪瘟病毒I73R蛋白作为免疫抑制剂的应用及免疫抑制位点突变毒株的构建

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒I73R蛋白作为免疫抑制剂的应用及免疫抑制位点突变毒株的构建。本发明首先发现了非洲猪瘟病毒I73R蛋白能够抑制SeV诱导的IFN‑β的表达，具有较强的免疫抑制作用，可用于制备免疫抑制剂；其次，本发明发现非洲猪瘟病毒I73R蛋白的免疫抑制位点，并构建了I73R蛋白的免疫抑制位点突变的非洲猪瘟重组病毒，所述非洲猪瘟重组病毒的天然免疫的能力显著增强，毒力明显减弱，感染重组毒实验动物存活率较感染野毒实验动物明显升高，提高了生物安全性，及免疫保护效力，可作为重组疫苗株，具备良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒I73R蛋白作为免疫抑制剂的应用及免疫抑制位点突变毒株的构建。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的猪的一种以发热和全身脏器出血为特征的急性烈性传染病，家猪病死率可高达100％。ASFV是一种大型的胞质内复制的病毒，病毒粒子二十面体对称，直径200nm，呈同心圆状结构。非洲猪瘟病毒基因组为末端共价闭合的单分子线性双链DNA，基因组全长为170～190kb，不同毒株的基因组长度不一致。ASFV整个基因组含有超过160个开放阅读框，可以编码150～200种蛋白质。基因组中部为中央保守区(C区)，长度约125kb，C区两侧各有一个可变区，右侧可变区(VR)长度13-22kb，含有5个多基因家族(MGF)。该区域与病毒抗原变异、逃避宿主防御系统等机制有关。

疫苗是预防和控制传染病最有效、最经济的手段，自ASF传入欧洲后，ASF有效疫苗的研发受到了多个国家尤其是欧洲研究机构的高度重视，取得了重要进展。但由于ASFV致病机制复杂，病毒感染和免疫机理不清，迄今为止，仍无有效疫苗防控该病。尽管针对ASF疫苗的研究起始于20世纪60年代末，近年来报道也很多，但尚未成功应用于实际。

I73R属于非洲猪瘟病毒早期转录基因，I73R能整合在无症状宿主组织细胞基因组上。本发明首先意外发现，非洲猪瘟病毒I73R蛋白能够抑制SeV诱导的IFN-β的激活，具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用。

基于上述发现，本发明通过突变PCR、基因合成等方法构建了I73R蛋白突变体质粒，该突变位点是发挥免疫抑制功能的关键位点；并通过在非洲猪瘟CN/GS/2018分离株中突变了I73R蛋白的免疫抑制位点，构建获得了一种I73R蛋白的免疫抑制位点突变的非洲猪瘟重组病毒，所述非洲猪瘟重组病毒的天然免疫的能力显著减弱，可作为重组疫苗株，能够促进早期免疫应答，诱导高水平抗体产生，提高了生物安全性，及免疫保护效力，具备良好的应用前景。

发明内容

首先本发明发现，非洲猪瘟病毒I73R蛋白能够抑制SeV诱导的IFN-β的激活，具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用。因此，本发明的第一目的在于：

提供一种非洲猪瘟病毒I73R蛋白在制备免疫抑制剂中的应用。

提供一种非洲猪瘟病毒I73R蛋白在制备SeV抑制剂中的应用。

提供一种非洲猪瘟病毒I73R蛋白在制备抑制IFN-β活性药物中的应用。

优选地，所述非洲猪瘟病毒I73R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述编码非洲猪瘟病毒I73R蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

其次，本发明通过突变PCR、基因合成等方法构建了I73R蛋白突变体质粒，该突变位点是发挥免疫抑制功能的关键位点；并通过在非洲猪瘟CN/GS/2018分离株中突变了I73R蛋白的免疫抑制位点，构建获得了一种I73R蛋白的免疫抑制位点突变的非洲猪瘟重组病毒，所述非洲猪瘟重组病毒的天然免疫的能力显著减弱，可作为重组疫苗株应用。因此，本发明的另一目的在于：

提供一种通过抑制非洲猪瘟病毒I73R蛋白的免疫抑制功能制备非洲猪瘟重组病毒的应用。

优选地，所述抑制非洲猪瘟病毒I73R蛋白的免疫抑制功能为：将非洲猪瘟病毒I73R蛋白59-60位氨基酸突变为天冬酰胺和丙氨酸。

优选地，所述非洲猪瘟病毒为CN/GS/2018分离株，所述编码非洲猪瘟病毒I73R蛋白59-60位氨基酸的基因位于非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株全基因序列的第172292-172297位。

优选地，所述非洲猪瘟病毒I73R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述编码非洲猪瘟病毒I73R蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；突变后的I73R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码突变后的I73R蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

提供一种I73R蛋白免疫抑制功能丧失的非洲猪瘟重组病毒，所述非洲猪瘟重组病毒包括将非洲猪瘟病毒I73R蛋白59-60位氨基酸突变为天冬酰胺和丙氨酸。

优选地，所述非洲猪瘟病毒为CN/GS/2018分离株，所述编码非洲猪瘟病毒I73R蛋白59-60位氨基酸的基因位于非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株全基因序列的第172292-172297位。

优选地，所述非洲猪瘟病毒I73R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述编码非洲猪瘟病毒I73R蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；突变后的I73R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码突变后的I73R蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

提供一种非洲猪瘟疫苗，所述非洲猪瘟疫苗包含I73R蛋白免疫抑制功能丧失的非洲猪瘟重组病毒。

提供一种I73R蛋白免疫抑制功能丧失的非洲猪瘟重组病毒的制备方法，所述方法为：通过基因工程手段使非洲猪瘟病毒I73R蛋白59-60位氨基酸突变为天冬酰胺和丙氨酸。

优选地，所述非洲猪瘟病毒为CN/GS/2018分离株，所述编码非洲猪瘟病毒I73R蛋白59-60位氨基酸的基因位于非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株全基因序列的第172292-172297位。

优选地，所述非洲猪瘟病毒I73R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述编码非洲猪瘟病毒I73R蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；突变后的I73R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码突变后的I73R蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选地，所述方法包括以下步骤：

(1)构建I73R蛋白基因突变序列，所述基因突变序列为编码I73R蛋白59-72位氨基酸，且59-60位氨基酸突变为天冬酰胺和丙氨酸的基因序列，所述基因突变序列如SEQ IDNO.5所示；

(2)以CN/GS/2018分离株全基因组第172292位上游基因约1.0kb左右为同源重组左臂，以CN/GS/2018分离株全基因组第172510位下游基因序列约1.0kb左右为同源重组右臂，并分别克隆入pUC19载体中，获得重组转移载体；

(3)在步骤(2)所述重组转移载体左、右臂基因序列中插入步骤(1)所述的基因突变序列、以及筛选表达盒基因片段，获得同源重组转移载体；

(4)将步骤(3)所述同源重组转移载体转染至感染了亲本非洲猪瘟毒株的BMDM细胞，纯化筛选获得I73R蛋白免疫抑制功能丧失的非洲猪瘟重组病毒。

提供一种根据上述方法制备获得的I73R蛋白免疫抑制功能丧失的非洲猪瘟重组病毒。

本发明的有益效果是：

①本发明首先发现非洲猪瘟病毒I73R蛋白能够抑制SeV诱导的IFN-β的激活，表明I73R蛋白具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用；而将I73R蛋白59-60位点的氨基酸突变为天冬酰胺和丙氨酸后恢复了SeV对IFN-β的激活作用，

②本发明意外发现，将I73R蛋白59-60位点的氨基酸突变为天冬酰胺和丙氨酸后恢复了SeV对IFN-β的激活作用，发现了非洲猪瘟病毒I73R蛋白的免疫抑制位点，并通过基因工程手段构建获得了I73R蛋白的免疫抑制位点突变的非洲猪瘟重组病毒；

③所述非洲猪瘟重组病毒的天然免疫的能力显著减弱，可作为重组疫苗株，能够促进早期免疫应答，重组毒株毒力明显减弱，感染重组毒实验动物存活率较感染野毒实验动物明显升高，提高了生物安全性，及免疫保护效力，具备良好的应用前景。

附图说明

图1非洲猪瘟病毒I73R蛋白抑制SeV诱导的IFN-β激活的结果图；

图2非洲猪瘟病毒I73R蛋白59-60位点突变后SeV对IFN-β的激活作用的结果图；

图3非洲猪瘟病毒I73R蛋白59-60位氨基酸突变毒株构建策略示意图；

图4单个GPF阳性细胞接种96孔板中PAM细胞72h后的荧光成像图；

图5非洲猪瘟病毒I73R KT59/60NA突变毒株感染猪温度变化结果图；

图6非洲猪瘟病毒I73R KT59/60NA突变毒株感染猪致死率结果图；

图7非洲猪瘟病毒I73R KT59/60NA突变毒株感染猪血毒结果图；

图8非洲猪瘟病毒I73R KT59/60NA突变毒株纯净性检测。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。

以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：

中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。

以下实施例中所述的实验细胞、病毒以及质粒来源：

原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)及原代骨髓巨噬细胞(BMDM)取自2-4月龄健康长白猪，无菌采集细胞后，用红细胞裂解液(购自Biosharp公司)，去除红细胞，低速离心后，弃上清，将细胞沉淀重悬于含有10％FBS(购自PAN公司)的RPMI 1640完全培养基(购自Gibco公司)中，置于37℃、5％CO

II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018来自国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)，属于基因Ⅱ型，病毒效价为5×10

peGFP-N1载体、pUC19载体均购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司；无内毒素的质粒提取试剂盒，购于OMEGA公司。

HEK-293T细胞，购于ATCC公司；IFN-β启动子质粒、TK质粒、FLAG-I73R及其突变体质粒由兰州瑞博莱生物科技有限公司构建；Lipofectamine TM 3000，购于Invitrogen公司。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域知晓的操作方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。

实施例1 I73R蛋白抑制SeV诱导的IFN-β的激活

1.I73R蛋白对SeV诱导的IFN-β表达的影响

将HEK-293T细胞铺置于24孔板的单个孔内。待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂分别转染IFN-β启动子质粒(100ng/孔)和TK质粒(10ng/孔)和FLAG-I73R质粒(100ng)，转染24h，然后接种SeV(MOI＝1)16h，利用荧光素酶试剂盒检测IFN-β的活性。

结果如图1所示，其中EV为不转染FLAG-I73R质粒。结果表明，仅转染带有FLAG标签的空载质粒(100ng/孔)并感染SeV(MOI＝1)16h后，IFN-β表达含量较高；而转染FLAG-I73R质粒(100ng/孔)并感染SeV(MOI＝1)16h后，IFN-β表达显著降低。说明，非洲猪瘟病毒I73R蛋白能够抑制SeV诱导的IFN-β的激活，具有免疫抑制作用。

2.I73R蛋白KT59/60NA突变对SeV诱导的IFN-β表达的影响

将HEK-293T细胞铺置于24孔板的单个孔内。待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂分别转染IFN-β启动子质粒(100ng/孔)、TK质粒(10ng/孔)、FLAG-I73R质粒(100ng)以及I73R 59/60位点氨基酸突变质粒FLAG-I73R KT59/60NA质粒(100ng/孔)，转染24h，然后接种SeV(MOI＝1)16h，利用荧光素酶试剂盒检测IFN-β的活性。

结果如图2所示，其中EV为不转染FLAG-I73R及FLAG-I73R KT59/60NA质粒(100ng/孔)。结果表明，仅转染带有FLAG标签的空载质粒(100ng/孔)并感染SeV(MOI＝1)16h后，IFN-β表达含量较高；转染FLAG-I73R质粒(100ng/孔)并感染SeV(MOI＝1)16h后，IFN-β表达显著降低；而转染I73R 59/60位点氨基酸突变质粒FLAG-I73R KT59/60NA质粒(100ng/孔)并感染SeV(MOI＝1)16h后，IFN-β表达水平相较于转染FLAG-I73R质粒显著升高，与EV组水平相当。说明，非洲猪瘟病毒I73R蛋白KT59/60NA突变使I73R抑制SeV诱导的IFN-β的激活的功能丧失，即I73R蛋白59/60位点是I73R发挥天然免疫抑制功能的关键位点。

综上所述，非洲猪瘟病毒I73R蛋白能够抑制SeV诱导的IFN-β等相关干扰素的激活，具有免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂抑制天然免疫，并用于制备抑制SeV感染的药物或药物组合物。

实施例2 ASFV I73R-KT59/60NA重组毒株的构建及纯化鉴定

1.筛选表达盒构建

为了便于筛选，共构建一套筛选标记基因的表达盒，即增强型绿色荧光蛋白(Enhance Green fluorescent protein，eGFP)基因筛选表达盒构建

参照文献，通过PCR扩增CMV pro启动子备用；扩增引物为：正向引物5’-CAAGGCTTGACCGACAATTGCAT-3’(SEQ ID NO.6所示)和反向引物5’-TAGTGAGTCGTATTAGCGGCC-3’(SEQ ID NO.7所示)；以peGFP-N1载体为模板，扩增eGFP基因，备用，扩增引物为：正向引物5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’(SEQ ID NO.8所示)和反向引物5’-ACCACAACTAGAATGCAGTG-3’(SEQ ID NO.9所示)；

参照文献(Borca MV,Holinka LG,Berggren KA,Gladue DP.CRISPR-Cas9,a tooltoefficiently increase the development of recombinant African swine feverviruses.Sci Rep.2018；8(1):3154.)，将上述步骤扩增获得的CMV pro启动子和eGFP两个基因通过融合PCR的方法连接，获得eGFP筛选表达盒基因片段，命名为CMV pro-eGFP-SV40PA(SEQ ID NO.10)，该表达盒序列含SV40PA终止序列。

2.同源重组转移载体的构建

利用pUC19载体作为骨架载体，构建I73R蛋白59-60位氨基酸突变用同源重组转移载体，所述的I73R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述突变后的I73R基因序列如SEQ ID NO.4所示，构建策略见图3。

具体步骤为：

(1)构建表达编码I73R蛋白59-72位氨基酸且I73R蛋白59-60为氨基酸突变为天冬酰胺和丙氨酸的基因突变序列的元件(图中I73R mut.pat所示)；所述基因突变序列如SEQID NO.5所示。

(2)设计编码I73R蛋白第59位氨基酸(CN/GS/2018分离株全基因组第172292位)的基因上游序列约1.0kb作为同源重组左臂(Left arm，SEQ ID NO.11所示)；以I73R蛋白(CN/GS/2018分离株全基因组第172510位)下游约1.0kb基因片段作为同源重组右臂(Rightarm，SEQ ID NO.12所示)，并分别克隆入pUC19载体中，获得I73R基因59-60位氨基酸突变的重组转移载体；

(3)在I73R基因的重组转移载体左右臂基因序列中间依次插入基因突变序列的元件(图中表示为I73R mut.pat，SEQ ID NO.5所示)、CMV pro.的DNA序列(图中表示为CMVpro.SEQ ID NO.13所示)以及eGFP筛选表达盒基因片段eGFP-SV40PA(图中表示为eGFP-SV40PA)；经测序正确后，将该同源重组转移载体命名为I73R-mut-eGFP；用无内毒素的质粒提取试剂盒提取DNA，测定浓度，-20℃保存备用。

3.细胞转染和重组病毒筛选

将同源重组转移载体pEI73R-mut-eGFP(2μg)和6μL的-Macrophage DNA转染试剂充分混匀，共转染至猪BMDM细胞(细胞数约为106个/孔)，转染6h后，直接感染非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株(按1MOI感染量)，不换液，至感染48h，在荧光显微镜下观察荧光细胞数。结果如图4所示，在荧光显微镜下可见有零星绿色荧光，即视为可疑重组毒感染的细胞。挑取荧光细胞，在新的培养皿中小心吹散，沉降1h，挑取单个荧光细胞，收集后反复冻融3次，接种预先铺好的96孔板PAM细胞中，每12h观察一次，观察出现荧光的细胞孔并标记，继续观察至72h。荧光细胞数量比例达100％的为全阳性孔，这说明重组毒构建基本成功。

对该全阳性孔进行6次有限稀释扩大培养，挑取第8代重组病毒孔消化成单个细胞，小心吸取10个荧光细胞，分别接种于预先铺好的96孔板PAM细胞中，继续生长72h。挑取GFP荧光较多的细胞，提取基因组DNA，利用I73R-F/R引物对其纯净度进行PCR鉴定，利用I73R-check-F/R引物对其突变情况进行PCR鉴定。I73R-F/R引物对为：I73R-F：CCCCGCTTTGGATACGGAAA(SEQ ID NO.14所示)和I73R-R：GCGGGAATAAGCCAGGACATGA(SEQ IDNO.15所示)。I73R-check-F/R引物对为：I73R-check-F：CCCGACAACCACTACCTGAGCA(SEQ IDNO.16所示)和I73R-check-R：CTGCGGGAATAAGCCAGGACAT(SEQ ID NO.17所示)。PCR扩增结果显示，当以编码野生型ASFV I73R蛋白的基因为模板时，I73R-F/R引物可以扩增出明显的条带(图8，内源条带wt)，当以编码突变ASFV I73R蛋白59-60位氨基酸的基因为模板时，I73R-F/R引物扩增不出条带(图8，外源条带wt)，结果表明ASFV I73R蛋白59-60位氨基酸已突变并纯化。当以编码突变ASFV I73R蛋白59-60位氨基酸的基因为模板时，I73R-check-F/R引物能扩增出条带(图8，外源条带1、2、3)，结果表明，ASFV I73R蛋白59-60位氨基酸已缺失，并且产物测序结果显示编码ASFV I73R蛋白59-60位氨基酸的核苷酸序列已经成功突变，并命名为I73R-KT59/60NA重组毒株。

实施例3突变病毒I73R-KT59/60NA毒力评价

为了检测I73R 59/60基因突变减毒非洲猪瘟病毒株I73R-KT59/60NA的毒力，本实验用10HAD50剂量经肌肉注射仔猪对其毒力进行评价。

本实验用12头非洲猪瘟抗原抗体阴性的健康长白仔猪，共分为2组每组六头分别攻非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株和I73R 59/60基因突变减毒非洲猪瘟病毒株I73R-KT59/60NA，攻毒后每天测量体温变化情况，采集外周血，观察其存活情况，参照文献(KingDP,Reid SM,Hutchings GH,Grierson SS,Wilkinson PJ,Dixon LK,Bastos AD,DrewTW.2003.Development of a TaqMan PCR assay with internal amplification controlfor the detection of African swine fever virus.J Virol Methods 107:53-61)，通过荧光定量PCR方法测定血液中的ASFV病毒含量，观察至19天终止，实验结果如图7所示。

攻突变毒后存活的六头猪的病毒载量均处于较低水平，且ASFV I73R 59/60基因突变减毒非洲猪瘟病毒株I73R-KT59/60NA组与非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株组有显著性差异，结果如图7所示。实验结果证明，非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株突变I73R 59/60氨基酸突变基因后，获得的ASFV I73R 59/60氨基酸突变的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株I73R-KT59/60NA的毒力相较于非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株的毒力显著致弱。

非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株经过肌肉注射10HAD50后出现ASFV典型症状，高温发热，到后期全部死亡，而ASFV I73R 59/60基因突变减毒非洲猪瘟病毒株I73R-KT59/60NA组的结果显示大部分动物经过高温发热后下降到正常体温，存活率为100％，结果如图5，6所示。

以上所述的实施例仅表述了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可做出其它改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 非洲猪瘟病毒I73R蛋白作为免疫抑制剂的应用及免疫抑制位点突变毒株的构建

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 72

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 1

Met Glu Thr Gln Lys Leu Ile Ser Met Val Lys Glu Ala Leu Glu Lys

1 5 10 15

Tyr Gln Tyr Pro Leu Thr Ala Lys Asn Ile Lys Val Val Ile Gln Lys

20 25 30

Glu His Asn Val Val Leu Pro Thr Gly Ser Ile Asn Ser Ile Leu Tyr

35 40 45

Ser Asn Ser Glu Leu Phe Glu Lys Ile Asp Lys Thr Asn Thr Ile Tyr

50 55 60

Pro Pro Leu Trp Ile Arg Lys Asn

65 70

<210> 2

<211> 219

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 2

atggagactc agaagttgat ttccatggtt aaggaagcct tagaaaaata tcaataccct 60

cttactgcta aaaatattaa agtagtgata caaaaagagc acaatgtcgt cttacctaca 120

ggatctataa atagcatact gtacagtaac tcagaacttt ttgagaagat tgataagaca 180

aataccattt atcccccgct ttggatacgg aaaaactaa 219

<210> 3

<211> 72

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Glu Thr Gln Lys Leu Ile Ser Met Val Lys Glu Ala Leu Glu Lys

1 5 10 15

Tyr Gln Tyr Pro Leu Thr Ala Lys Asn Ile Lys Val Val Ile Gln Lys

20 25 30

Glu His Asn Val Val Leu Pro Thr Gly Ser Ile Asn Ser Ile Leu Tyr

35 40 45

Ser Asn Ser Glu Leu Phe Glu Lys Ile Asp Asn Ala Asn Thr Ile Tyr

50 55 60

Pro Pro Leu Trp Ile Arg Lys Asn

65 70

<210> 4

<211> 219

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggagactc agaagttgat ttccatggtt aaggaagcct tagaaaaata tcaataccct 60

cttactgcta aaaatattaa agtagtgata caaaaagagc acaatgtcgt cttacctaca 120

ggatctataa atagcatact gtacagtaac tcagaacttt ttgagaagat tgataacgca 180

aataccattt atcccccgct ttggatacgg aaaaactaa 219

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aacgcaaata ccatttatcc cccgctttgg atacggaaaa actaa 45

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caaggcttga ccgacaattg cat 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tagtgagtcg tattagcggc c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggtgagca agggcgagga g 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

accacaacta gaatgcagtg 20

<210> 10

<211> 1438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240

atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300

cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360

tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420

agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480

tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540

aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagcttcc ggatggtgag 600

caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 660

aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 720

gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 780

caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 840

cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 900

cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 960

catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 1020

gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa 1080

ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 1140

ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 1200

cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 1260

gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aattaacttg 1320

tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa 1380

gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttaag 1438

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<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

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tcaggaatgt aaagaaacta tttttgattt aaaggtggta ggaaatgttt agccaataaa 60

ctcatgcccg cattttttac aggtacaaaa tatcgtggat ggctcatcga gggcgcgtgt 120

ttgtacttct ctgtaggtac acatacgctg cttgcagttg ggacacttat aaagttgtga 180

cgtcttttcg gcgacctttt gctgcgaacg tagagtaatt tctgtcttct cctttaaggc 240

ggcagagggg caaagctcgg cgaacgtcat gctaccaatt gcctccggtt ttagctcgcc 300

agaaattagc ttattaaggg catcgttatc ctgttgttgg tgactttttt tttcgcagtt 360

aataatatga ttgatcgtcc cacaacgggt tgaatattct tctaaaaagg ttttttcttg 420

ttgctggtac gtataatgat aacacgaggc ctcgattttt tgcgcgtatt cggtgcataa 480

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<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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