一种化合物在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种化合物在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用，本发明通过对化合物AA005影响三阴乳腺癌MDA‑MB‑468细胞的实验发现，化合物AA005可以同时抑制MDA‑MB‑468细胞的氧化磷酸化和糖酵解过程，造成细胞能量危机从而发挥体内外抗肿瘤活性；因此，化合物AA005能应用于制备三阴乳腺癌能量代谢通路抑制剂的药物中；本发明为研究与开发新的抗三阴乳腺癌药物提供了候选药物。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及化合物AA005在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据统计，在英国每7名女性中就有1人罹患乳腺癌。乳腺癌包含四种亚型，其中三阴乳腺癌亚型最“毒”，被称为“癌中恶霸”。三阴乳腺癌是指雌激素受体、孕激素受体、人表皮生长因子受体2三个主要治疗靶点均为阴性的乳腺癌，其对传统内分泌治疗和人表皮生长因子受体2靶向治疗均不敏感。目前三阴乳腺癌尚无明确的靶向药物，临床治疗仍以化疗为主，但尚无最佳方案。在所有乳腺癌中，三阴乳腺癌占10％～17％，具有预后差、耐药性强、复发率高、治疗手段少等特点，成为乳腺界一大难题。因此，开发三阴乳腺癌治疗药物或寻找更多新型药物治疗靶点的工作日渐凸显重要性。

发明内容

本发明目的是提供化合物AA005在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用，化合物AA005如式1所示：

本发明通过对三阴乳腺癌人源细胞株MDA-MB-468和鼠源细胞株4T1，以及正常细胞L02的细胞毒活性测试，发现化合物AA005在50nM的浓度下对上述3株细胞的活力抑制率分别为45％、40％、8.4％。实验结果表明：化合物AA005具有显著的三阴乳腺癌细胞毒活性，并且对正常细胞的毒性明显低于三阴乳腺癌。因此，化合物AA005能应用于制备抗三阴乳腺癌的药物，特别是对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-468具有细胞毒活性的药物。

因此，本发明提供了化合物AA005在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用。

所述的治疗三阴乳腺癌药物是对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-468具有毒活性的药物。

本发明的第二个目的是提供一种治疗三阴乳腺癌药物，其特征在于，含有有效量的化合物AA005作为活性成分。

本发明的第三个目的是提供化合物AA005在制备通过抑制细胞能量代谢发挥作用的药物中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种细胞能量代谢抑制剂的药物，其特征在于，含有有效量的化合物AA005作为活性成分。

本发明公开了化合物AA005在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用。本发明通过对化合物AA005影响三阴乳腺癌MDA-MB-468细胞的实验发现，化合物AA005可以抑制MDA-MB-468细胞的氧化磷酸化，另一方面，化合物AA005可以通过抑制AKT信号通路降低葡萄糖转运蛋白GLUT1和GLUT4的表达，影响糖酵解产能，从而加重细胞能量危机，最后导致细胞的生命活动受到不可逆转的破坏。因此，化合物AA005能应用于制备三阴乳腺癌能量代谢通路抑制剂的药物中。本发明为研究与开发新的抗三阴乳腺癌药物提供了候选药物。

附图说明(***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，ns p≥0.05)：

图1是化合物AA005对三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-468和4T1以及对正常细胞L02的细胞活力影响。

图2是化合物AA005对MDA-MB-468细胞中抑癌基因PTEN转录水平的影响。

图3是化合物AA005对MDA-MB-468细胞中糖酵解相关蛋白表达水平的影响。

图4是化合物AA005处理72h对MDA-MB-468细胞的线粒体压力曲线(A)和糖酵解压力测试曲线(B)的影响。

图5是化合物AA005对MDA-MB-468细胞的ATP产生水平的影响。

图6是化合物AA005处理MDA-MB-468细胞8h(A)和16h(B)后的细胞周期分布的变化。

图7是化合物AA005对MDA-MB-468细胞的分裂增殖能力(A)、细胞克隆形成(B)和线粒体中超氧化物水平(C)影响。

图8是化合物AA005处理MDA-MB-468细胞48h后的细胞死亡情况。

图9是4T1荷瘤鼠腹腔注射化合物AA005两周内体重(A)、肿瘤体积(B)的变化以及治疗14天后肿瘤的质量(C)和照片(D)。

图10是化合物AA005对三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-468的可能作用机理图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本研究采用细胞系包括：人实体瘤细胞系三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-468、鼠实体瘤细胞系三阴乳腺癌细胞株4T1和人源正常肝细胞L02。细胞接种于含10％胎牛血清、100μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素和2mmol/mL谷氨酰胺的RPMI-1640或DMEM高糖培养液中常规培养(37℃，5％CO

实施例1：

利用CellCounting-Lite

实验结果如图1所示，化合物AA005对三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-468和4T1均呈现较强烈的细胞毒性。在50nM的作用浓度下，化合物AA005分别可以抑制45％的MDA-MB-468细胞生长和40％的4T1细胞生长。另外，50nM的化合物AA005对正常细胞L02的生长抑制率约为8.4％，一定程度上体现了化合物AA005对这一组癌细胞和正常细胞也存在一定程度的选择性作用。

实施例2：

利用qRT-PCR检测化合物AA005对抑癌基因PTEN转录水平的影响。将MDA-MB-468细胞接种于6孔板内，用100nM化合物AA005或含有对应DMSO含量的完全培养基分别处理细胞12h和36h，PBS洗涤后用胰酶消化收集细胞。使用柱提取试剂盒提取总RNA，用Nanodrop紫外分光光度计对总RNA的浓度进行测定。使用逆转录试剂盒对总RNA(1μg)进行逆转录，得到cDNA。将购买得到的引物用Nanodrop定量(用蒸馏水将浓度统一稀释至100μM)后与模板cDNA(1μL)以及染料法荧光定量专用预混液于每个PCR管中充分混合均匀，在实时荧光定量PCR仪进行扩增。

相关基因的qRT-PCR引物序列

实验结果如图2所示，当细胞经过100nM化合物AA005作用36h后，抑癌基因PTEN的转录水平增加约1.5倍。说明化合物AA005处理可以促进MDA-MB-468细胞中抑癌基因PTEN转录。

实施例3：

利用Western blotting技术检测化合物AA005对糖酵解相关蛋白表达水平的影响。将MDA-MB-468细胞接种于10cm的培养皿中，过夜培养使之贴壁后，分别用完全培养基或50、100nM化合物AA005处理细胞36h。预冷TBST洗涤后，每皿加入一定体积的TBST，用细胞刮刀收集细胞(冰上操作)，4℃下300g离心4min，预冷TBST洗涤一次后用RIPA裂解液(另加DTT、NaF、PMSF、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)于冰上裂解细胞30min，期间每隔10min用移液枪混匀吹打多次。裂解后于4℃下15300g离心15min，取上层清液并测定蛋白浓度。将细胞裂解得到的上层清液进行浓度归一化处理，并于95℃下煮10min使蛋白变性，样品放于-80℃冰箱内备用。制备10％浓度的分离胶。每孔中加入一定体积蛋白样品进行电泳实验，使用快速湿转法进行转膜。5％BSA的TBST溶液对PVDF膜进行室温封闭1h后，用1×TBST漂洗三次，使用一抗(1×TBST稀释)对PVDF膜进行4℃过夜孵化。回收一抗，用1×TBST洗膜三次。使用1×TBST稀释的二抗进行室温1h孵育，随后继续使用1×TBST洗膜三次。配置化学发光液，使用凝胶成像仪对条带进行曝光，并使用ImageJ软件分析相对灰度。

实验结果如图3所示，免疫印迹实验表明，当MDA-MB-468细胞被50nM和100nM化合物AA005刺激36h后，活化的AKT(p-AKT)的表达水平分别下调约46％和60％。另外，葡萄糖转运蛋白GLUT1和GLUT4的表达也在一定程度上被抑制。说明化合物AA005可以引起MDA-MB-468细胞的AKT通路失活，从而进一步导致葡萄糖摄取能力下降。

实施例4：

利用Seahorse细胞能量代谢分析仪检测化合物AA005对MDA-MB-468细胞的两种能量代谢水平的影响。将MDA-MB-468细胞以7000cells/well的密度接种在24孔板中(Seahorse Bioscience)。将一块24孔板划分成两半，上两排用来测试线粒体压力，下两排用来测试糖酵解压力。37℃下细胞贴壁生长7h后，向每孔继续加入150μL完全培养基继续培养过夜后，将每孔培养基更换成250μL含有100nM化合物AA005的完全培养液或者含有对应DMSO含量的完全培养液继续培养72h。(1)，配制含有丙酮酸盐(2mM)，葡萄糖(25mM)和谷氨酰胺(2mM)的XF检测液并将其pH调至pH 7.4。测试前，用XF测试液洗涤细胞三次，然后每孔加入530μL的XF测试液，在不含CO

实验结果如图4所示，线粒体压力测试曲线和对应的柱状图数据分析(A)显示化合物AA005处理过的MDA-MB-468细胞的基础呼吸被明显压制，同时，ATP产生和备用呼吸储备能力基本丧失。另一方面，糖酵解压力测试曲线和对应的柱状图数据分析(B)显示，在葡萄糖刺激阶段细胞已按最大糖酵解能力运转，但此阶段的细胞外酸化速率仍明显比空白组细胞低。综上说明化合物AA005不仅完全抑制了线粒体氧化磷酸产能，也很大程度地抑制了糖酵解产能。

实施例5：

采用ATP检测试剂盒对MDA-MB-468细胞内ATP的含量进行检测。将MDA-MB-468细胞按照合适的密度(6×10

实验结果如图5，与空白处理组相比，100nM化合物AA005处理组细胞在36h和48h内的ATP量减少约34％和95％。说明化合物A005可以通过抑制糖酵解和氧化磷酸化两方面的产能功能，引起细胞严重的能量危机。

实施例6：

采用PI单染法染色，用流式细胞仪分析化合物AA005对MDA-MB-468细胞周期分布的影响。将MDA-MB-468细胞以每孔2.4×10

实验结果如图6，数据分析显示，50nM化合物AA005孵育8h后，处于DNA合成期S期的细胞比例可从空白组的25％增加至65％。继续延长化合物AA005的孵育时间至16h，空白组和化合物AA005使用浓度较低的实验组会更早进入下一个周期阶段，如200nM化合物AA005作用16h后，处于G

实施例7：

用CFSE荧光探针通过流式细胞仪检测化合物AA005对MDA-MB-468细胞分裂增殖的影响。胰酶消化收集细胞，PBS洗涤后加入1mL PBS重悬细胞(并计数)，加入1μL CFDA SE母液(5mM)，使CFDA SE工作液浓度为5μM。37℃下避光孵育20min后(每5min弹匀一次)，将孵育液全部转移至含有5mL完全培养液的50mL离心管，于37℃下继续避光孵育5min。离心并去掉上清液，用完全培养液调整细胞悬液浓度为1×10

利用细胞克隆形成实验检测化合物AA005对MDA-MB-468细胞的群体依耐性和增殖能力的影响。将MDA-MB-468细胞按照低密度以每孔1500的数量接种于6孔板中，过夜培养使之贴壁后，将每孔培养液更换成2mL含有100nM化合物AA005的完全培养液或者含有对应DMSO含量的完全培养液继续培养。每2～3天换液一次，继续培养14d后，去掉上清培养液并用PBS洗涤细胞，每孔加入1mL甲醇固定30min后用PBS洗涤1次，每孔加入1mL结晶紫染色工作液，染色20min。用水洗涤数次后晾干，对每孔进行拍照。

利用MitoSox荧光染料通过流式细胞仪检测化合物AA005对MDA-MB-468细胞线粒体内活性氧含量的影响。将MDA-MB-468细胞以每孔5×10

实验结果如图7，基于CFSE荧光探针的分代追踪分析显示，化合物AA005药物处理组细胞的荧光强度比空白组高，并且呈现剂量依耐性，说明其得到的子代细胞代数偏小，表明化合物AA005可以抑制MDA-MB-468分裂增殖。从细胞克隆形成实验可以发现化合物AA005实验组的结晶紫染色程度比空白组细胞浅，反映化合物AA005在一定程度上可以抑制细胞克隆形成，影响MDA-MB-468的群体依耐性和增殖能力。另外，流式检测发现化合物AA005处理后的MDA-MB-468细胞经MitoSox染色后，荧光强度明显增强，说明线粒体内超氧阴离子水平经化合物AA005刺激后明显上升。

实施例8：

采用AnnexinV-FITC/PI双染法通过流式细胞仪分析化合物AA005处理MDA-MB-468细胞48h后的细胞死亡情况。将MDA-MB-468细胞以每孔7×10

实验结果如图8，化合物AA005实验组的细胞出现一定程度的死亡，如50nM化合物AA005处理后，细胞的死亡比例可从空白组的10.7％增加至50.3％。说明化合物AA005可以明显诱导细胞死亡。

实施例9：

通过体内抗肿瘤检测化合物AA005对三阴乳腺癌荷瘤鼠的治疗效果。选取5周龄的BALB/c雌性小鼠为实验对象，将100μL 4T1细胞悬液(1×10

实验结果如图9，化合物AA005对4T1荷瘤鼠的体重没有影响，并且化合物AA005的两个剂量组与空白组的肿瘤生长曲线以及最终采集到的肿瘤体重之间存在显著性差异。说明化合物AA005在没有明显毒性的前提下，对4T1荷瘤鼠具有一定的肿瘤生长抑制能力。

实施例10：

综上所述，如图10，化合物AA005对三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-468和4T1具有较强的细胞毒性。进一步研究发现化合物AA005通过促进MDA-MB-468细胞中抑癌基因PTEN转录水平增加，抑制AKT信号通路从而降低葡萄糖转运蛋白GLUT1和GLUT4的表达，进而抑制MDA-MB-468细胞糖酵解功能。最终，MDA-MB-468细胞因糖酵解和线粒体氧化磷酸化的双重功能受损出现能量危机(ATP总量急剧下降)，从而对细胞的生命活动(如细胞周期和分裂增殖)产生不可逆转的影响，直至细胞出现氧化应激行为和死亡。同时，化合物AA005对4T1荷瘤鼠的瘤体生长抑制表现说明化合物AA005在三阴乳腺癌治疗中具有一定的应用前景。本发明为实现和开发新的抗三阴乳腺癌药物提供了候选药物。

需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京大学

<120> 一种化合物在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(人工序列)

<400> 1

acccaccaca gctagaactt 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(人工序列)

<400> 2

gggaatagtt actccctttt tgtc 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(人工序列)

<400> 3

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<212> DNA

<213> 引物(人工序列)

<400> 4

gcattacata atttacacga aagca 25