耐受农药酷拉斯的小麦全蚀病生防枯草芽孢杆菌及应用

摘要

本发明公开了耐受农药酷拉斯的小麦全蚀病生防枯草芽孢杆菌及应用，属于农业微生物领域。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，命名为JY214，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.24123。本发明枯草芽孢杆菌对农药酷拉斯具有良好的耐受性，并且对小麦全蚀病病原菌具有良好的拮抗作用，可与酷拉斯共用进行小麦全蚀病的防治，在保证防效的基础上实现农药减量。

说明书

技术领域

本发明涉及农业微生物技术领域，更具体的说是涉及耐受农药酷拉斯的小麦全蚀病生防枯草芽孢杆菌及应用。

背景技术

小麦全蚀病是一种毁灭性土传病害，主要危害小麦的根部和茎基部，被全蚀病菌侵染的小麦植株容易倒伏、拔断，严重时造成枯白穗。该病在各个时期都有发生，有“侵染越早，危害越严重”的特点，其蔓延速度较快，一块地从零星发生到成片死亡只需要2-3年。该病严重影响小麦的生长，导致千粒重下降，危害不严重时能造成小麦减产10％-20％，严重时减产率能达到50％以上，甚至绝收。

在缺乏有效防治全蚀病的抗病品种情况下，目前主要依赖化学农药来防止小麦全蚀病的发生。将农药酷拉斯拌种后的小麦，施用到患小麦全蚀病的地区，可高效防治小麦全蚀病，提高小麦产量。但长期使用化学农药会造成农药残留，污染环境，并且大量使用后病原菌容易对农药产生耐药性；而减少农药的使用又会降低对病原菌的抑制效果，影响产量；此时以菌治菌的生物防治显得尤为重要。

若只依赖拮抗菌进行小麦全蚀病的生物防治，效果较为有限；而如果能够筛选到对农药具有耐受性的生防菌，与农药混合搭配施用，不仅有望降低农药的用量，减少农药的残留及对环境的污染，还可有效控制植株的发病率，避免病原菌耐药性的增强。因此，如何提供一种耐受农药，并且对小麦全蚀菌有拮抗效果的拮抗菌成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了耐受农药酷拉斯的小麦全蚀病生防枯草芽孢杆菌，其对农药酷拉斯具有良好的耐受性，并且对小麦全蚀病病原菌具有良好的拮抗作用，可与酷拉斯共用进行小麦全蚀病的防治，在保证防效的基础上实现农药减量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

耐受农药酷拉斯的小麦全蚀病生防枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为JY214，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.24123，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2021年12月27日。

上述耐受农药酷拉斯的小麦全蚀病生防枯草芽孢杆菌在防治小麦全蚀病中的应用。

进一步地，防治小麦全蚀病时，对小麦施用农药酷拉斯并且接种上述枯草芽孢杆菌。

进一步地，上述耐受农药酷拉斯的小麦全蚀病生防枯草芽孢杆菌在小麦全蚀病病原菌拮抗菌育种方面具有广阔的应用前景。具体地，可以该菌为原始材料，通过自然选育、人工诱变育种、基因工程育种等方法选育对农药耐受性更好、对小麦全蚀病病原菌拮抗作用更显著的菌株，从而有利于进一步减少农药用量，甚至完全实现生物防治。

一种小麦全蚀病生防制剂，包括上述耐受农药酷拉斯的小麦全蚀病生防枯草芽孢杆菌。

由上述技术方案可知，本发明公开的枯草芽孢杆菌JY214对酷拉斯具有较强的耐受作用；与酷拉斯共用，在酷拉斯减半的情况下即可达到与单独使用酷拉斯相似的防治效果，适于推广应用。

附图说明

图1所示为筛选获得的部分耐受农药酷拉斯的芽孢杆菌；

图2所示为JY214菌株对小麦全蚀病菌的拮抗效果；

图3所示为JY214菌株与其他芽孢杆菌对小麦全蚀病菌的拮抗效果比较；

图4所示为JY214菌株在含有酷拉斯的培养基中的生长情况；

图5所示为JY214菌株系统发育树；

图6所示为盆栽试验生长情况，从左到右依次为CK1组、CK0组、NY组、JN组。

图7所示为JY214菌株对多种病原菌的拮抗作用；

图中由左至右病原菌分别为玉米大斑病菌、梨黑斑病菌、马铃薯早疫病菌、链格孢属真菌Accc38230、链格孢属真菌Accc38231。

图8所示为JY214菌株产酶性能研究结果；

图中在由左至右培养基依次为牛奶培养基、淀粉培养基、羧甲基纤维素钠培养基。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1JY214的分离筛选及鉴定

1.试验材料

菌种分离样品采于河北唐山、沧州、邯郸大名、石家庄正定、行唐等市县农村农作物生长区土壤。小麦全蚀病病原菌由本实验室保存。

2.培养基

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1L。马铃薯去皮切片，加水煮沸至软，用纱布过滤，在滤液中加糖、琼脂粉，并加水补足1L，自然pH，121℃，20min。

NB培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1L，pH 7.2-7.4，121℃，20min。加琼脂粉1.5-2.0％，为NA培养基。

3.小麦全蚀病病原菌的培养

将灭菌的PDA培养基放至40-50℃倒平板，并加入终浓度为40μg/100mL的硫酸链霉素。将小麦全蚀病病原菌菌片接种于PDA平板中间，于26℃培养箱培养7-10d，待菌丝长满板备用。

4.耐受酷拉斯农药的芽孢杆菌的筛选

取2.0g农田土壤，加入装有20mL无菌蒸馏水的三角瓶中，25℃220rpm摇床培养20min，在水浴锅中80℃水浴加热5min，取1mL土壤悬浊液于1.5mL EP管中，10,000×g，离心1min，取100μL离心后的土壤上清液于装有900μL无菌蒸馏水的1.5mL EP管中，进行梯度稀释，取100μL稀释度为10

经初步筛选，从小麦根际土壤中筛选出了89株能够耐受酷拉斯农药的芽孢杆菌(图1)。

5.拮抗小麦全蚀病菌的芽孢杆菌的筛选

利用病原菌(实验室保藏)作为指示菌，采用对峙培养法进行拮抗试验，检测筛选的耐受酷拉斯的菌株生成抑菌带情况，筛选拮抗小麦全蚀病菌的菌株。

将小麦全蚀病病原菌菌块放置在PDA平板中央，将距离菌块3cm处点5μL筛选的菌株菌液(OD600＝1.0左右)，26℃培养7-10d，将能够产生明显抑菌圈的拮抗细菌接种到NA斜面37℃恒温培养过夜备用。

结果显示，对小麦全蚀病病原菌有显著抑制作用的菌株有23株，其中1株拮抗效果最为显著，命名为芽孢杆菌JY214(图2)。

进一步地，比较芽孢杆菌JY214与实验室保藏芽孢杆菌菌株NQ36对于小麦全蚀病病原菌的抑制作用，结果如图3所示，JY214对于小麦全蚀病病原菌的抑制作用显著优于NQ36。

6.拮抗菌的生长特性检测

将筛选的对病原菌有显著拮抗活性的菌株在含有酷拉斯(终浓度为80μL/100mL)的NB培养基中37℃220rpm摇床培养，定时检测菌株在600nm下的吸光值，培养时间为96h。并且设置对照组，即JY214在不含有酷拉斯的NB培养基中培养。每组处理设三个重复，记录好吸光值，绘制生长曲线。

如图4所示，JY214菌株在培养36h达到最大值，接近于对照组，表明该菌株对酷拉斯有很强的耐受能力，其生长虽然受到酷拉斯的抑制，但抑制作用较低。

7.菌株鉴定

将JY214菌株16S rDNA序列在NCBI的数据库中，使用Blast对基因的序列进行比对，使用MEGA 7.0软件进行系统发育树构建(图5)。经16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

实施例2拮抗菌和农药混施对小麦全蚀病的防治作用

试验所用小麦品种为周麦18。

JY214菌株在NA培养基划线，于37℃过夜培养，挑单菌落于NB培养基中，于37℃220rpm摇床培养至OD600＝1.0左右备用。

盆栽试验设置4个处理，分别为空白对照组CK0，病原菌组CK1，农药处理组NY和菌剂加农药组JN，每个处理设置3组，6棵苗为一组。取直径为12.9cm、高12.4cm的花盆，每盆均匀播种9粒小麦种子(保证萌发出足够数量的实验苗)。空白对照组用水进行浇灌，不接种病原菌和拮抗菌。

病原菌对照组接种小麦全蚀菌菌饼(直径7mm)，每个菌片上放置1粒小麦种子。

农药处理组和菌剂加农药组接种病原菌的方式和病原菌对照组相同。农药处理组使用100μL酷拉斯加2.2mL水稀释进行拌种；菌剂加农药组采用农药减半拌种，并浇灌JY214菌菌液20mL。

各组室温培养，种植20d后进行拮抗细菌防治效果调查。

植株生长状况检测按株进行，随机取样18株，然后计算平均值。

按照小麦根部被全蚀病菌侵染面积占总根面积的百分率作为严重程度指标，染病等级分为5级：0级＝0％，1级＝1-10％，2级＝11-30％，3级＝31-60％，4级＝61-100％。

病情指数＝[∑(各级病株数×代表数值)/调查总株数×发病最重级的代表数值]×100。

防治效果＝[(对照组病情指数－处理组病情指数)/对照组病情指数]×100％。

用SPSS statistics 21统计软件进行数据分析，结果如图6和表1所示。施用菌剂加农药处理组(JN)在株高，根长和根干重与施用农药酷拉斯处理组(NY)以及空白对照组CK0相比差异不显著，和病原菌对照组CK1差异显著。而在茎宽，地上重处理中，JN组与NY组有显著差异，且JN组较好。JN组对小麦全蚀病的防治效果达到88.1％，表明在农药减半施用的情况下，JY214菌株发酵液的施用能够有效防治小麦全蚀病的发生，起到和足量施用酷拉斯相似的防治效果，达到了在减施农药的条件下，有效防治病害发生的目的。

表1酷拉斯和JY214菌株混施对小麦全蚀病的防治效果

CK0为空白对照组，CK1为病原菌对照组，NY为农药处理组，JN为菌剂加农药组。

实施例3 JY214菌株对其他病原菌的拮抗作用

验证JY214菌株对链格孢属真菌Accc38230、链格孢属真菌Accc38231、玉米大斑病菌、梨黑斑病菌、马铃薯早疫病菌(均于实验室保藏)的拮抗作用，结果如图7所示，JY214菌株对多种病原菌均具有良好的拮抗作用。

实施例4 JY214菌株代谢产物研究

分别取JY214菌液5μL，接种于牛奶培养基、淀粉培养基及羧甲基纤维素钠培养基中，晾干，24℃倒置培养24～48h，至菌落生长至适当大小，结果如图8所示，证明JY214具有产蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶的能力。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。