人HHIPL2 mRNA在食管鳞状细胞癌靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒

摘要

本发明涉及人HHIPL2mRNA在食管鳞状细胞癌靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒。本发明首次发现食管鳞状细胞癌肿瘤组织中HHIPL2mRNA异常高表达，敲低HHIPL2mRNA表达水平能够显著抑制食管鳞状细胞癌细胞系KYSE‑150细胞的恶性生物学行为。本发明试剂盒包含能特异性干扰HHIPL2mRNA表达的siRNA以及检测HHIPL2mRNA表达水平的引物对，并提出此siRNA与引物对在食管鳞状细胞癌靶向治疗策略发展中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及人HHIPL2 mRNA在食管鳞状细胞癌靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒，属于生物医学技术领域。

背景技术

食管癌是一种高度侵袭性的人类恶性肿瘤，按病理类型可分为食管腺癌与食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)。不同地区两种食管癌病理类型的发病率差异极大，西方国家以食管腺癌为主，而东亚地区，尤其是我国，食管癌确诊病例最为常见的是ESCC。由于缺乏有效的治疗靶点，目前食管癌的临床治疗手段仍然是手术治疗、放疗与化疗，这严重制约着食管癌个体化精准治疗与综合治疗策略的发展，以至于食管癌患者的5年生存期只有约18％。因此，食管癌临床治疗亟需发展新的有效靶点，这是靶向药物研发的基础，也是改善食管癌患者预后的关键所在。

小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)是一种含有20～25核苷酸的双链RNA，当其被转染至细胞内时，首先整合到RNA诱导的沉默复合体当中，然后特异性结合含有与其自身序列碱基互补序列的mRNA，进而导致该mRNA降解。因此siRNA已经成为基因功能研究与靶向药物研发领域的重要工具。因此，设计出针对某个特定基因具有专一敲低特性与显著敲低效率的siRNA对于探究该基因功能以及研发相关靶向药物至关重要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了人HHIPL2 mRNA在食管鳞状细胞癌靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒。

本发明的技术方案如下：

人HHIPL2 mRNA在制备食管鳞状细胞癌靶向治疗和预后评估产品中的应用。

根据本发明优选的，所述应用中HHIPL2 mRNA为食管鳞状细胞癌预后评估的生物标志物。

根据本发明优选的，所述应用中HHIPL2 mRNA为食管鳞状细胞癌靶向治疗的作用靶点。

根据本发明优选的，所述HHIPL2 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述食管鳞状细胞癌靶向治疗产品包括特异性敲低HHIPL2mRNA表达的物质。

进一步优选的，所述特异性敲低HHIPL2 mRNA表达的物质选自特异性干扰HHIPL2mRNA表达的siRNA。

进一步优选的，所述特异性干扰HHIPL2 mRNA表达的siRNA靶向识别序列如SEQ IDNO.2所示。

根据本发明优选的，所述食管鳞状细胞癌预后评估产品包括特异性识别HHIPL2mRNA逆转录产物cDNA的物质。

进一步优选的，所述特异性识别HHIPL2 mRNA逆转录产物cDNA的物质选自特异性扩增HHIPL2 mRNA的引物对。

进一步优选的，所述特异性扩增HHIPL2 mRNA的引物对为SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物。

根据本发明优选的，所述食管鳞状细胞癌预后评估产品的检测样本选自细胞、组织、血浆以及血清。

一种食管鳞状细胞癌靶向治疗药物，所述药物包括特异性敲低HHIPL2 mRNA表达的物质。

根据本发明优选的，所述特异性敲低HHIPL2 mRNA表达的物质选自特异性干扰HHIPL2 mRNA表达的siRNA。

进一步优选的，所述特异性敲低HHIPL2 mRNA表达的物质选自特异性干扰HHIPL2mRNA表达的siRNA。

进一步优选的，所述特异性干扰HHIPL2 mRNA表达的siRNA靶向识别序列如SEQ IDNO.2所示。

一种食管鳞状细胞癌预后评估试剂盒，所述试剂盒包括特异性识别HHIPL2 mRNA逆转录产物cDNA的物质。

根据本发明优选的，所述特异性识别HHIPL2 mRNA逆转录产物cDNA的物质选自特异性扩增HHIPL2 mRNA逆转录产物cDNA的引物对。

进一步优选的，所述特异性扩增HHIPL2 mRNA逆转录产物cDNA的引物对为SEQ IDNO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物。

根据本发明优选的，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR的检测试剂。

有益效果：

本发明研究发现食管鳞状细胞癌肿瘤组织中HHIPL2 mRNA表达水平异常上调，敲低HHIPL2 mRNA表达能够显著抑制食管鳞状细胞癌细胞系KYSE-150细胞的恶性生物学行为。在此基础上，本发明设计出能够检测HHIPL2 mRNA表达水平的引物对以及能够特异性干扰HHIPL2 mRNA表达的siRNA，并提出其在食管鳞状细胞癌靶向治疗策略发展中的应用。

附图说明

图1为本发明分析TCGA数据库中的ESCC标本的测序数据示意图，以HHIPL2 mRNA在11例正常食管组织中的表达水平为参照，计算95例ESCC癌组织中HHIPL2 mRNA相对表达水平，应用Student’s t检验明确两组间表达差异的统计学意义。

图2为本发明所述siRNA-HHIPL2特异性干扰KYSE-150细胞中HHIPL2 mRNA表达水平示意图，组间差异的统计学意义应用Student’s t检验明确。

图3为CCK-8实验检测下调的HHIPL2 mRNA表达对KYSE-150细胞增殖能力的影响示意图。

图4为本发明siRNA特异性敲低KYSE-150细胞中HHIPL2 mRNA表达水平，应用Transwell实验检测HHIPL2 mRNA表达下调对KYSE-150细胞迁移与侵袭能力的影响示意图。

具体实施方式

下面结合实验例对本发明的技术方案作进一步描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂与材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。

人源ESCC细胞系KYSE-150细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

实施例1

应用TCGA数据库分析食管鳞状细胞癌(ESCC)测序数据，结果显示HHIPL2 mRNA在ESCC肿瘤组织中的表达水平相比于临近正常食管组织显著上调，具体分析结果如图1所示。

具体实施过程如下：

在TCGA数据库中下载ESCC标本测序数据，计算每个样本的log

实施例2

设计siRNA-HHIPL2，将siRNA-HHIPL2和siRNA-NC分别转染至KYSE-150细胞中，应用逆转录-实时荧光定量PCR检测HHIPL2 mRNA在KYSE-150细胞中的敲低水平，所述siRNA-HHIPL2的靶向序列如SEQ ID NO.2所示，所用检测HHIPL2 mRNA表达水平的物质为本发明提供的引物对，上游引物序列为SEQ ID NO.3所示，下游引物序列为SEQ ID NO.4所示，具体结果如图2所示。

由图2可知，siRNA-HHIPL2能够有效地特异性敲低KYSE-150细胞中HHIPL2 mRNA表达水平。

具体实施过程如下：

(1)设计能够靶向HHIPL2 mRNA编码区序列的siRNA(siRNA-HHIPL2)，其靶向序列为5’-cacaatcgcaagttctata-3’(SEQ ID NO.2)；

(2)在6孔板中培养KYSE-150细胞，待其生长密度达到70％时，使用转染试剂Lipofectamine RNAiMAX Reagent(Life technologies，13778-150)将siRNA-NC和siRNA-HHIPL2分别转染至KYSE-150细胞中，36～48小时后收集细胞并使用RNA-QuickPurification Kit(上海奕杉，RN001)试剂盒提取RNA，应用琼脂糖凝胶电泳评估所提RNA的完整性是，应用NanoDrop2000检测所提RNA的浓度，-20℃备用；

(3)使用lnRcute lncRNA cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN，KR202)去除步骤(2)所提RNA中混入的基因组DNA，然后以RNA为模板进行逆转录合成cDNA产物；应用本发明的引物，以cDNA产物为模板，在PCR仪器QuantStudio

其中，引物对的核苷酸序列如下：

上游引物：5’-ttcagaccactcgccaagac-3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物：5’-tgggccagaagctaaggttg-3’(SEQ ID NO.4)；

去除基因组DNA的体系：2μL RNA(250ng/μL)，6μL RNase-Free ddH

逆转录PCR体系：2μL lnR-RT Primer Mix，5μL RNase-Free ddH

实时荧光定量PCR体系：1μL上述逆转录体系产物，1μL引物稀释液(1μM)，3μLRNase-Free ddH

上述试剂均来自lnRcute lncRNA cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN，KR202)与Power SYBR

实施例3

将KYSE-150细胞培养于6孔板中，将特异性干扰HHIPL2 mRNA表达的siRNA-HHIPL2(SEQ ID NO.2)转染至KYSE-150细胞中，应用CCK-8实验检测HHIPL2 mRNA敲低表达对KYSE-150细胞增殖能力的影响，具体结果如图3所示。

由图3可知，应用siRNA-HHIPL2特异性敲低HHIPL2 mRNA表达水平能够显著抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖能力。

具体实施过程如下：

(1)将siRNA-HHIPL2和siRNA-NC分别转染至KYSE-150细胞中，具体方法见实施例2，转染后24～36小时，收集细胞，调整细胞浓度至25000个/mL培养基，向96孔板中的每孔加入100μL细胞悬液，每个细胞设置6个复孔，重复4组；

(2)待细胞贴壁以后(约2-4小时)，向第1组内的每个孔加入10μL CCK-8试剂(TargetMol,C0005)，37℃孵箱中放置1小时，简单震荡后放入酶标仪中测量起始吸光度值(450nm)；

(3)在起始测量细胞吸光度值后的1、2、3天分别向剩余3组六孔板中的每孔加入10μL CCK-8试剂(TargetMol，C0005)，简单震荡，使用酶标仪测量测量上述孔板中450nm的吸光度值，以此计算两组细胞在1天，2天，3天后的数量。

实施例4

选取KYSE-150细胞，应用siRNA-HHIPL2(SEQ ID NO.2)敲低细胞中HHIPL2 mRNA表达水平，应用Transwell实验检测干扰HHIPL2 mRNA表达对KYSE-150细胞迁移与侵袭能力的影响，具体结果如图4所示。

由图3可知，应用siRNA-HHIPL2特异性敲低HHIPL2 mRNA表达水平能够显著抑制食管鳞状细胞癌细胞KYSE-150的迁移与侵袭。

具体实施过程如下：

(1)将siRNA-HHIPL2和siRNA-NC分别转染至KYSE-150细胞中，具体方法见实施例2，转染24～36小时后，收集细胞，离心后使用无血清培养基重悬细胞，调整细胞浓度至100000个/mL培养基；

(2)预先将基质胶加入Transwell小室(Corning，3422)内面(用于检测细胞侵袭)，向24孔板中每孔中加入600μL完全培养基，将预先加入基质胶的小室与未加基质胶的Transwell小室(用于检测细胞迁移)放入24孔板内，吸取200μL细胞悬液加入到每个小室内，然后置于37℃细胞孵箱培养48小时；

(3)弃掉24孔板内的培养基，PBS清洗2次，向每孔加入适量4％多聚甲醛并室温放置15分钟，然后弃掉4％多聚甲醛并加入0.1％结晶紫染色过夜，使用棉签去除小室内侧面未穿孔的细胞，将24孔板连同小室放入倒置显微镜下观察小室外侧面细胞，拍照并计数。

以上所述实施例仅为本发明优选的具体实施方案，并不用来限制本发明，凡是在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换以及改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学第二医院

<120> 人HHIPL2 mRNA在食管鳞状细胞癌靶向治疗和预后评估中的应用及试剂盒

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2572

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gggcagagca gggaagccaa cctgagcaaa cacagcagcc cgagtgttcc caaggccaaa 60

atgctgagaa cgtccactcc taatctgtgt ggtggtctgc attgccgggc cccctggctc 120

tcttctggca ttctctgcct ctgcctcata ttcttgttgg gccaggtggg cttgctgcag 180

ggacaccccc agtgcctgga ttacgggccc cctttccagc cccctctgca ccttgagttt 240

tgctctgact atgagtcctt cggctgctgt gatcagcaca aggaccgccg catcgctgcc 300

cggtactggg acatcatgga atattttgat ctgaagagac atgagctgtg tggagattac 360

attaaagaca tcctttgcca ggagtgctcg ccctacgcag cccacctcta cgacgccgaa 420

aacacccaga cgcctctccg gaatctcccg ggcctctgct ctgattactg ctctgccttc 480

cattctaact gtcactcagc catttccctg ctgaccaatg accgcggcct ccaggagtct 540

catggaaggg acggtacccg cttctgccac ctcctggacc ttcctgacaa ggactattgc 600

ttccctaatg tcctgaggaa cgactatctc aaccgccacc tgggcatggt ggcccaagat 660

cctcagggct gcctgcagct ctgcctgagc gaggtggcca acgggctgag gaaccccgtc 720

tccatggtcc atgctgggga cggcacccat cgcttctttg ttgccgagca ggtaggagtg 780

gtgtgggtct acctccctga tgggagtcgc ctggagcaac ccttcctgga cctcaagaac 840

atcgtgttga ccaccccatg gatcggggat gagagaggct tcttggggtt ggcttttcac 900

cccaaattcc gccacaatcg caagttctat atttattatt cgtgcctgga caagaagaag 960

gtagaaaaga tccgaattag tgagatgaag gtttctcggg ctgatcctaa caaagctgac 1020

ctgaaatcag agagggtcat cttggagatt gaagaaccag cctcaaacca taatggcgga 1080

caacttcttt ttggcctgga tggctatatg tacatattca ctggggacgg gggacaggct 1140

ggagatccct ttggcctgtt tggaaatgct cagaacaaaa gttccctgct gggaaaagtt 1200

ttaaggatcg atgtgaacag ggcaggctca catggcaagc ggtaccgagt cccctcggac 1260

aatccatttg tttctgagcc aggggcccac cccgccatct atgcctatgg gatcaggaac 1320

atgtggcgtt gtgctgtgga ccgaggggac cccatcacgc gccagggccg aggccggata 1380

ttctgtgggg acgtgggcca gaacaggttt gaagaggttg acctcatttt gaaaggtgga 1440

aactatggct ggagagcaaa ggaagggttt gcatgttatg acaaaaaact ttgtcacaat 1500

gcctctttgg atgatgttct gccaatctat gcttatggcc atgcagtggg gaagtcagtc 1560

actggaggtt atgtctatcg tggttgtgaa tccccaaatc tcaatggcct gtatatcttt 1620

ggagacttca tgagtggtcg acttatggct ttgcaggaag atagaaaaaa caagaaatgg 1680

aagaagcagg atctttgcct gggcagcacc acgtcctgtg ccttcccagg gctgatcagc 1740

acccatagca agttcatcat ctcctttgct gaagatgaag caggggagct gtatttcctg 1800

gcgacctctt acccaagtgc ctatgcacca cgtggatcta tttacaagtt tgttgacccc 1860

tcaaggcgag cacccccagg caagtgcaaa tacaagccag tgcccgtgag aaccaagagt 1920

aagcggatcc cgttcagacc actcgccaag acagtcttgg acttgctaaa ggaacaatca 1980

gagaaagctg ctagaaaatc ttccagtgca accttagctt ctggcccagc ccagggtttg 2040

tctgagaaag gctcctccaa gaagctggct tctcctacaa gcagcaagaa tacattgcga 2100

gggcctggta caaagaagaa agccagagtg gggccccacg tccgccaggg caagaggagg 2160

aagagcctga aaagccacag tggcaggatg aggccatcag cagagcagaa gcgagctggc 2220

agaagtctcc cttgacctat tggtcaaggt ggccgacagg gtgacgtgag agaggagagc 2280

cacctcatca aatgaaagtc actgctgaat aaagacctta gaagtctggg aagccagggt 2340

agaggtgggg cagggcggtt ttcctctccc tgggaaatct tgctgtctac tgaataaata 2400

aatgcacctt ctctgtatgc agtgcttctg tgggagacca tatcccagat tgctggtgca 2460

cctgggttat ggtaagcact agtccatgag cctgcttgga atcacactgg atgtctccgt 2520

tttgtcttgt aaatgcctac aacctgaggt aataaatcaa catttgctca aa 2572

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacaatcgca agttctata 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcagaccac tcgccaagac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgggccagaa gctaaggttg 20