人工大规模诱导雌核发育花䱻的方法及雌核发育花䱻的应用

摘要

本发明公开了一种人工大规模诱导雌核发育花的方法，包括如下步骤：首先挑选性成熟雄性锦鲤和雌性花进行人工催产，然后将经过紫外灭活的锦鲤精子和花卵子混合，用羽毛搅拌以激活卵子，将被激活的卵子置于0‑1℃的黄泥浆中冷休克处理20‑22min，然后依次置于4‑6℃、8‑10℃、15‑18℃水中各处理1‑2min，再将其置于水温为22‑25℃的孵化槽中孵化，经鉴定筛选后即得到二倍体的雌核发育花本发明的培育方法，可以减少温度急剧升高对受精卵的损伤，提高了受精卵的孵化率和后代存活率，有效克服了常规方法难以获得可存活雌核发育花的技术障碍，成功获得了雌核发育花群体，填补了花雌核发育技术方面的空白。

说明书

技术领域

本发明属于鱼类培育技术领域，特别是一种人工大规模诱导雌核发育花

背景技术

雌核发育是一种重要的遗传育种方法，是快速建立纯系的有效途径，1-2代雌核发育相当于8-10代传统近亲交配的连续选育。通过基因纯化，携带有害基因的个体在雌核发育过程中被自然淘汰，因此雌核发育后代往往表现出耐低氧、抗逆能力强、生长速度快等优良性状。

花

由于花

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种人工大规模诱导雌核发育花

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种人工大规模诱导雌核发育花

鱼类受精卵在孵化过程中，温度急剧变化会导致其大量死亡。在以前的多次试验中，将冷休克处理后的被激活卵子直接转入水温为22-24℃水中，未经过梯度升温处理，均没有获得大量的雌核发育花

上述的培育方法，优选的，所述人工催产具体包括如下步骤：采用一次注射法对雌性花

优选的，所述人工催产的注射完毕后，将雌雄花

优选的，花

优选的，进行人工催产时维持池塘水温在22-25℃。

优选的，所述紫外灭活的锦鲤精子由以下方法得到：轻压雄性锦鲤腹部将精子从泄殖腔中挤出，用干燥洁净的容器接取后迅速用4℃预冷的Hank's液按1:2-3的体积比稀释，然后以薄层形式平铺0-4℃预冷的培养皿中，将培养皿置于垫有冰板的摇床上，并用紫外灯照射，直至得到灭活程度为70％-80％的紫外灭活锦鲤精子。

更优选的，所述紫外灯照射的具体操作包括如下步骤：用2支15W能散发出明显的臭氧味的紫外灯在距离精子10-12cm处进行照射处理，在照射15min后，每隔1-2min沾取精液涂于载玻片上，用水激活后于显微镜下镜检判断其活性，当70％-80％数量的精子游动能力明显减弱时停止照射，得到紫外灭活的锦鲤精子。在雌核发育过程中，精子的灭活程度与雌核发育成功率密切相关。灭活不彻底将产生杂交后代，过度灭活则精子不能激活卵子启动发育。因为不同个体来源的精子可能活力不同，因此灭活时间是不同的。本发明中采用70％左右的精子游动能力明显减弱时作为标准，可提高雌核发育的成功率。

优选的，所述卵子的激活时间为1-2min。

优选的，所述孵化槽中孵化出的鱼苗转入池塘中进行养殖，然后采用流式细胞检测法、血细胞DNA含量检测法、染色体检测法进行鉴定筛选，可在不处死样本的前提下准确获得其DNA含量和染色体数目。

基于一个总的发明构思，本发明还提供一种上述方法得到的雌核发育花

花

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明的培育方法，采用雄性锦鲤精子作为刺激源，使花

2、本发明的培育方法，在异源精子的选择方面，采用与花

3、本发明的培育方法，在母本花

4、本发明的培育方法，获得的雌核发育花

5、本发明的应用，利用雌核发育花

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中雌核发育花

图2为本发明中普通花

图3为本发明中雌核发育花

图4为本发明中雌核发育花

图5为本发明中普通花

图6为雌核发育花

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种人工大规模诱导雌核发育花

1、人工催产：在每年1-2月份，分别挑选2龄以上，无病态、发育良好、性成熟特征明显的花

2、精子灭活：在预计花

3、受精：当雌、雄花

4、冷休克处理：卵子激活后，置于预先调好的0℃冷黄泥浆中冷休克处理20-22min，然后依次置于4-6℃、8-10℃、15-18℃水中各处理1-2min，再将其置于孵化槽中，22-24℃水温下流水孵化；同时设置对比试验，在冷休克处理后，直接将受精卵置于22-24℃水温下流水孵化，试验结果见表1所示。

表1：不同处理方法对雌核发育发育花

本发明还探究了不同休克温度和休克时间对其受精率、孵化率和存活率的影响情况，结果见表2。从以下数据可以得出，当休克温度在4℃，休克时间22分钟时，其受精率，孵化率和存活率是最高的。

表2：不同休克温度和休克时间对其受精率、孵化率和存活率的影响情况

表3：不同精子的诱导花

如表3，通过不同精子刺激实验，比较发现，在同等条件下，锦鲤精子刺激的存活率最高。

5、饲养：雌核发育花

6、检测：当雌核发育花

随机选取15尾4-5月龄的雌核发育花

表4：雌核发育花

结果显示，雌核发育花

此外，经试验证明本发明的方法可以提高受精卵的孵化率和后代存活率。

同时，以普通花

最后，通过鱼类尾鳍细胞法检测雌核发育花

①取材，在细胞房外，准备好要取材用的鱼，将需要做原代的组织取到离心管中，然后喷酒精带入细胞房内(细胞房需要提前签好时间，在取材之前开好紫外，将需要用的物品放入紫外台照至少15分钟，需要用到剪刀镊子的话要需要用锡纸包好放进180的灭菌箱中灭菌，再带入细胞房)用加了双抗的PBS漂洗组织6-7次，再更换一个EP管漂洗6-7次，最后留下300-500ul的PBS剪碎(用多少PBS剪碎可以根据材料的多少来决定)；

②将装有剪碎好的组织的离心管放到离心机离心1000转3min(这个是尾鳍用的时间，肌肉应该要转速高一些，离心次数可能需要多一些)，弃上清再加入新的PBS300-500ul这样离心2次；

③离心结束后，弃上清，用胎牛血清FBS 300ul加入离心管中，静置；

④取小皿，铺上一层明胶可以加个700ul，将皿底铺满即可，再吸走明胶，明胶是可以重复利用的再将组织和胎牛血清均匀铺在小皿上，再吸走FBS；

⑤放入培养箱1h后再加入培养基。

染色体悬液制作：

1、将培养好的细胞取到EP管中，带出细胞房，转移到15ml的离心管中，进行离心5-10min，弃上清，加入低渗液，看细胞沉淀的量适当加入。

2、低渗1h-2h(不同鱼的低渗时间会有不同)，再加入几滴固定液，再离心5-10min，弃上清，加固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)，也是根据细胞沉淀量加入，放入冰箱4℃1h，离心弃上清，再加入固定液固定30min左右即可滴片。

如图4、图5所示，表明了雌核发育花

如图6是雌核发育花

综上，DNA含量检测与尾鳍细胞培养染色体倍性检测方法均显示本发明培育得到的后代为二倍体雌核发育花

实施例2：

本发明还提供一种实施例1得到的雌核发育花

利用实施例1得到的雌核发育花

该改良花