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抗CD74抗体偶联物,包含抗CD74抗体偶联物的组合物以及抗CD74抗体偶联物的使用方法

摘要

本发明提供了对CD74具有结合特异性的抗体偶联物,其中根据所述Kabat、Chothia或EU编号方案,所述抗体在选自由HC‑F404、HC‑K121、HC‑Y180、HC‑F241、HC‑221、LC‑T22、LC‑S7、LC‑N152、LC‑K42、LC‑E161、LC‑D170、HC‑S136、HC‑S25、HC‑A40、HC‑S119、HC‑S190、HC‑K222、HC‑R19、HC‑Y52或HC‑S70组成的组的位点处包含非天然氨基酸,和包含所述抗体偶联物的组合物,包括药物组合物,制备所述偶联物的方法,以及使用所述偶联物和组合物进行治疗的方法。

著录项

  • 公开/公告号CN114796520A

    专利类型发明专利

  • 公开/公告日2022-07-29

    原文格式PDF

  • 申请/专利权人 苏特罗生物制药公司;

    申请/专利号CN202210448662.X

  • 申请日2017-01-27

  • 分类号A61K47/68;C07D519/00;C07D498/18;C07K16/28;A61P35/00;

  • 代理机构中国专利代理(香港)有限公司;

  • 代理人彭昶

  • 地址 美国加利福尼亚州

  • 入库时间 2023-06-19 16:08:01

法律信息

  • 法律状态公告日

    法律状态信息

    法律状态

  • 2022-07-29

    公开

    发明专利申请公布

说明书

技术领域

本发明提供了对CD74具有结合特异性的抗体偶联物和包含所述抗体偶联物的组合物,包括药物组合物、生产所述偶联物的方法、以及使用所述偶联物和组合物进行治疗的方法。所述偶联物和组合物用于细胞增殖和癌症的治疗方法和预防方法,细胞增殖和癌症的检测方法,以及细胞增殖和癌症的诊断方法。所述偶联物和组合物还用于自身免疫性疾病、感染性疾病和炎性病症的治疗方法、预防方法、检测方法和诊断方法。

背景技术

人白细胞抗原(HLA)II类组织相容性抗原γ链(也称为HLA-DR抗原相关恒定链或CD74 (分化簇74)),是一种涉及主要组织相容性复合物(MHC)II类蛋白的形成和转运的蛋白质。参见Claesson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1983,80:7395-7399;Kudo etal.,Nucleic Acids Res.,1985, 13:8827-8841;和Cresswell,Ann.Rev.Immunol.,1994,12:259-291。

CD74的一个功能是调节肽加载到细胞内区室中的II类MHC异源二聚体上,以防止MHC II 类与细胞肽结合。所述细胞表面表达CD74的全部功能尚未可知。然而,研究表明,CD74是促炎性细胞因子巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的受体。MIF与CD74的结合通过MAPK和Akt途径激活下游信号,以及促进细胞增殖和存活。参见Gore et al.,J.Biol.Chem.,2008,283:2784-2792;以及Starlets et al.,Blood,2006,107:4807-4816。

CD74表达的上调节(Upregulation)已在癌症和自身免疫性疾病(Borghese etal.,Exp.Op.Ther. Targets,2011,15:237-251),以及感染(Vera et al.,Exp.Biol.&Med.,2008,233:620-626)和炎性病症 (Hofman et al.,Modern Pathology,2007,20:974-989)中观察到。在包括B-细胞淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤的多种血液肿瘤中,CD74已知以中等至高水平进行表达。Burton et al.,Clin.Cancer Res., 2004,10:6606-6611。CD74表达也被认为是与胰腺癌的恶化相关的关键因素。Zhang et al.,HepatobiliaryPancreat.Dis.Int.,2014,13:81-86。

鉴于CD74在多种疾病进程中的作用,需要改进的方法以调节CD74与其配体的相互作用以及由CD74激活的下游信号过程。此外,鉴于CD74在几种疾病中的上调节,也需要特异性地治疗靶向细胞和组织的过表达CD74的疗法。CD74的抗体偶联物可用于将治疗或诊断有效负载部分递送至表达CD74的靶细胞,以用于治疗或诊断此类疾病。

发明概要

一个方面,本发明所提供的是选择性地结合CD74的抗体偶联物。所述抗体偶联物包含抗体,所述抗体结合CD74,所述CD74连接至一个或多个有效负载基团部分。所述抗体可以通过共价键直接地或通过连接体间接地与有效负载进行连接。本发明所详述的CD74抗体是有用的有效负载基团部分和有用的连接体。

在另一方面,提供包含所述抗体偶联物的组合物。在一些实施方案中,所述组合物是指药物组合物。任何合适的药物组合物均可以使用。在一些实施方案中,所述药物组合物是指肠胃外给药的组合物。在另一方面,本发明所提供的是包含所述抗体偶联物或药物组合物的试剂盒。

另一个方面,本发明所提供的是使用所述抗CD74抗体偶联物的方法。在一些实施方案中,所述方法是将一种或多种有效负载基团部分递送至表达CD74的靶细胞或组织的方法。在一些实施方案中,所述方法是指治疗的方法。在一些实施方案中,所述方法是指诊断方法。在一些实施方案中,所述方法是指分析方法。在一些实施方案中,所述抗体偶联物用于治疗疾病或病症。在一些方面,所述疾病或病症选自癌症、自身免疫性疾病、传染病或炎性病症。在一些方面,所述疾病或病症是B- 细胞淋巴瘤。在一些方面,所述疾病或病症是非霍奇金淋巴瘤。在一些方面,所述疾病或病症是白血病。在一些方面,所述疾病或病症是胰腺癌。在一些方面,所述疾病或病症是多发性骨髓瘤。

附图简要说明

图1提供了CDR-H1的Kabat和Chothia编号系统的比较。参见Martin A.C.R.(2010).Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody VariableDomains.In R.Kontermann&S.Dübel(Eds.), Antibody Engineering vol.2(pp.33-51).Springer-Verlag,Berlin Heidelberg。

图2A提供了根据本发明实施例表达的抗体的蛋白质产量;和图2B提供了在非还原和还原条件下所述抗体的SDS-PAGE分析。

图3A为在本发明公开的抗CD74抗体-药物偶联物给药后,在扩散性ARP-1多发性骨髓瘤模型中体重变化(BWC)与时间的函数图。图3B提供了肿瘤细胞接种后第46天每个实验组的个体重量数据的散点图。

图4A示出施用本发明公开的抗CD74抗体-药物偶联物后,扩散性ARP-1多发性骨髓瘤模型中卵巢和肾脏中及其周围所形成的肿瘤块的图像。图4B提供每个实验组最终肿瘤组织的重量柱状图。

图5A提供施用本发明公开的抗CD74抗体-药物偶联物后,在骨髓(股骨和胫骨)中存在的人CD138阳性ARP-1骨髓瘤细胞的百分比的代表性流式细胞术点图。图5B提供每个实验组人CD138 阳性ARP-1骨髓瘤细胞的流式细胞术的数据百分比柱状图。

图6A显示施用本发明公开的抗CD74抗体-药物偶联物后,在扩散性MM.1S多发性骨髓瘤模型中体重变化(BWC)与时间的函数关系。图6B提供每个治疗组在多发性骨髓瘤模型中的 Kaplan-Meier存活点图(右)。图6C示出施用本发明公开的抗CD74抗体-药物偶联物后,每个实验组肿瘤接种后第32天的骨髓中存在的人CD138阳性MM.1S骨髓瘤细胞的百分比的条形图。图6D示出施用本发明公开的抗CD74抗体-药物偶联物后,实验组在肿瘤接种后第129天的骨髓中存在的人 CD138阳性MM.1S骨髓瘤细胞的百分比的条形图。

图7A提供施用本发明公开的抗CD74抗体-药物偶联物后,在非霍奇金淋巴瘤模型中肿瘤生长与时间的函数曲线。图7B提供施用抗CD74抗体-药物偶联物后,在非霍奇金淋巴瘤模型中每个实验组第18天的单个肿瘤大小的散点图。

图8提供施用本发明所公开抗CD74抗体-药物偶联物后,在非霍奇金淋巴瘤动物模型中体重变化(BWC)与时间的函数曲线。

发明详述

1.定义

除非另有说明,所有本发明所用的术语、符号和其他科学术语,旨在具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义。在一些情况下,为了清楚和/或便于参考,本发明所述定义的术语,具有通常理解的含义,并且本发明所包含的这些定义不应解释为表示与本领域通常理解的差异。本发明所述或引用的技术和程序,通常被本领域技术人员使用常规方法进行很好地理解和使用,例如在Sambrook et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual 2nd ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY中描述的广泛使用的分子克隆方法。适当地,除非另有说明,关于市售试剂盒和试剂使用的程序,通常按照制造商定义的方案和/或参数进行实施。

如本发明所使用的,除非上下文另有明确说明,否则,单数形式“一”,“一个/一种”和“所述”包括复数形式。

术语“约”表示并包含指示值,以及高于和低于所述值的范围。在一些实施方案中,术语“约”表示指定值±10%,±5%或±1%。在一些实施方案中,术语“约”表示指定值±所述值的一个标准偏差。

术语“CD74”和“CD74抗原”在本发明中可互换使用。除非另有说明,否则所述术语包括人 CD74的任何变体、异构体和物种同源物,所述人CD72由细胞天然表达、或由经CD74基因转染的细胞表达。

至少四种人CD74的异构体,是公知存在的,包括p43、p41、p35和p33。Borghese etal.,Expert Opin.Ther.Targets,2011,15:237-251,通过引用其整体并入本发明。这些异构体产生于替代的转录物剪接和两个翻译起始位点。

p43(也称为CD74异构体1,异构体a,或“长”;参见UniProt条目P04233-1和NCBI参考序列NP 001020330,各自通过引用整体并入本发明)包含296个氨基酸,形成细胞外部分的残基 73-296。CD74的蛋白质构建体具有异构体1的细胞外部分,在本发明中称为“变体1”或“CD74v1”。

p35(也称为CD74异构体2,异构体b或“短”;参见UniProt条目P04233-2和NCBI参考序列NP 004346,各自通过引用整体并入本发明)由于选择性剪接而缺少来自细胞外结构域的残基 209-272。CD74的蛋白质构建体具有异构体2的细胞外部分,在本发明中称为“变体2”或“CD74v2”。

p41和p33来自可选的翻译起始位点(下游48个核苷酸/16个氨基酸),所述起始位点导致缺乏内质网(ER)驻留信号的变体,所述内质网(ER)驻留信号存在于消除的16个氨基酸中,但分别具有与p43和p35相同的细胞外结构域。

在NP 001020329中提供了另一种异构体(称为异构体3和异构体c)的序列,其中残基148-160 被替换,以及残基161-296缺失。

食蟹猴CD74同源物的序列提供于,例如,NCBI参考序列:XP—001099491.2和NCBI参考序列:XP—002804624.1。

术语“免疫球蛋白”是指一类结构相关的蛋白质,通常由两对多肽链、一对轻(L)链和一对重(H)链组成。在完整的免疫球蛋白中,所有这四个链通过二硫键相互连接。所述免疫球蛋白的结构已得到好的表征。参见,例如,Paul,Fundamental Immunology 7th ed.,Ch.5(2013)Lippincott Williams &Wilkins,Philadelphia,PA。简而言之,每条重链通常包含重链可变区(V

术语“抗体”描述了一类免疫球蛋白分子,以及在本发明中以其最广泛的含义进行使用。抗体特异性地包括单克隆抗体偶联物、多克隆抗体偶联物、完整抗体偶联物和抗体片段。抗体偶联物包含至少一个抗原结合结构域。抗原结合结构域的一个实施例是通过V

所述V

来自任何脊椎动物物种的所述轻链,基于恒定结构域的序列可以分配为两种类型中的一种,所述两种类型称为κ和λ。

来自任何脊椎动物物种的所述重链,可以指定为五种不同类别(或亚型)的一种:IgA、IgD、 IgE、IgG和IgM。这些类别也分别指定为α、δ、ε、γ和μ。基于序列和功能上的差异,所述IgG和 IgA类进一步分为子类。人类表达以下子类:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。

CDR的所述氨基酸序列边界可以由本领域技术人员使用许多已知编号方案中的任何一种来确定,包括那些描述在Kabat et al.,supra(“Kabat”编号方案);Al-Lazikani etal.,1997,J.Mol.Biol., 273:927-948(“Chothia”编号方案);MacCallum et al.,1996,J.Mol.Biol.262:732-745(“Contact”编号方案);Lefranc et al.,Dev.Comp.Immunol.,2003,27:55-77(“IMGT”编号方案);和Honegge and Plückthun,J.Mol.Biol.,2001,309:657-70(“AHo”编号方案)中的描述,各自通过整体引用并入本发明。

表1提供了通过所述Kabat和Chothia方案确定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的位置。对于CDR-H1,残基编号是使用Kabat和Chothia编号方案提供而得。图1提供了CDR-H1的Kabat和Chothia编号方案的对比。参见Martin(2010),supra。

除非另有明确说明,本发明用于识别特定CDR的编号方案是Kabat/Chothia编号方案。在这两种编号方案不同的情况下,所述编号方案特指为Kabat或Chothia。

表1根据Kabat和Chothia编号方案CDR中的残基

*如图1所示,当使用Kabat编号规则编号时,所述CDR-H1的C-端取决于所述CDR的长度,在H32 和H34之间变化。

当所指为抗体重链恒定区中的残基时(例如,Kabat et al.,supra报道的所述EU索引),通常使用“EU编号方案”或“EU索引”。除非另有说明,所述EU编号方案用于指本发明所述的抗体重链恒定区的残基。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分,例如完整抗体的所述抗原结合区或可变区。抗体片段包括,例如Fv片段、Fab片段、F(ab’)

“Fv”片段包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的非共价连接的二聚体。

除重链和轻链可变结构域外,“Fab”片段还包含所述轻链的恒定结构域和所述重链的第一恒定结构域(C

“F(ab’)

“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段包含单一多肽链中的V

术语“单克隆抗体”是指来自基本上同种类的抗体群的抗体。基本上同种类的抗体群包含基本上相似且结合相同抗原表位的抗体,在单克隆抗体产生过程中通常可能出现的变体除外。这些变体通常仅以少量存在。通常单克隆抗体通过包括从多种抗体中选择单一抗体的方法获得。例如,所述选择过程可以是从多个克隆中选择独特的克隆,例如杂交瘤克隆库、噬菌体克隆、酵母克隆、细菌克隆或其他重组DNA克隆。例如,所选抗体可以进一步改变,以提高对靶标的亲和力(“亲和力成熟”),使抗体人源化,改善其在细胞培养物中的产物,和/或降低其在受试者中的免疫原性。

术语“嵌合抗体”是指一种抗体,其重链和/或轻链的一部分是从特定来源或物种衍生得到,而所述重链和/或轻链的其余部分从不同来源或物种衍生得到。

“人抗体”是一种具有对应于人或人细胞所产生抗体的氨基酸序列,或利用人抗体库或人抗体编码序列的非人源衍生得到的氨基酸序列(例如,从人源获得或从de novo设计而得)。人抗体特异性地排除人源化抗体。

非人抗体的“人源化”形式是嵌合抗体,其含有源自所述非人抗体的最小序列。人源化抗体通常是人免疫球蛋白(受体抗体),其中一个或多个CDR的残基被来自非人抗体(供体抗体)的一个或多个CDR残基替换。所述供体抗体可以是任何合适的非人抗体,例如具有所需特异性、亲和力或生物学效应的小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类动物的抗体。在一些情况下,所述受体抗体的选定框架区残基被来自所述供体抗体的所述相应框架区残基取代。人源化抗体还可以包含在所述受体抗体或所述供体抗体中未发现的残基。这种修饰可以进一步改进抗体功能。进一步的细节,参见Jones et al., Nature,1986,321:522-525;Riechmann et al.,Nature,1988,332:323-329;和Presta,Curr.Op.Struct.Biol., 1992,2:593-596,其各自通过引用整体并入本发明。

“分离的抗体”是一种已从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。所述天然环境的组分可包括酶、激素、和其他蛋白质或非蛋白质材料。在一些实施方案中,将分离的抗体纯化至足以获得N 端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度,例如使用旋转杯测序仪。在一些实施方案中,通过凝胶电泳(例如,SDS-PAGE)在还原或非还原条件下将分离的抗体纯化至均一,通过考马斯蓝或银染色进行检测。由于抗体天然环境的至少一种组分不存在,分离的抗体包含重组细胞内的原位抗体。在一些方面,分离的抗体可通过至少一个纯化步骤制备而得。

在一些实施方案中,将分离的抗体纯化至至少80%、85%、90%、95%或99%重量。在一些实施方案中,分离的抗体是以含有至少85%、90%、95%、98%、99%至100%重量的抗体溶液进行提供,其余重量包含溶解在溶剂中的其他溶质的重量。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明,如本发明所用,“结合亲和力”是指内在结合亲和力,其反映出结合对的成员(例如,抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常用解离常数(K

关于抗体与靶分子的结合,术语“特异性的结合”、“特异性地结合”、“对…特异性”、“选择性地结合”和“对…选择性”特定抗原(例如,多肽靶标)或特定抗原上的表位是指非特异性或非选择性相互作用有显著差异的结合。例如,通过比较对照分子的结合对分子结合进行测定。特异性结合还可以通过与靶标相似对照分子的竞争来测定,例如过量的非标记靶标。在这种情况下,如果标记靶标与探针的结合被过量的非标记的靶标进行竞争性地抑制,则表示为特异性结合。

如本发明所用,术语“k

如本发明所用,术语“k

如本发明所用,术语“K

如本发明所用,术语“K

“亲和力成熟的”抗体是与不具有变型(变型类)的亲本抗体相比,在一个或多个引发抗体对其抗原的亲和力改善的CDR或FR中具有一个或多个变型的抗体。在一个实施方案中,亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体可以使用多种本领域公知的方法进行产生。例如,Marks et al.(Bio/Technology,1992,10:779-783,通过引用整体并入本发明)公开了通过 V

当使用本发明上下文中所述两种或更多种抗体时,术语“与......竞争”或“与...交叉竞争”是指两种或更多种抗体竞争结合抗原(例如,CD74)。在一个示例性测定中,将CD74包被在平板上,并使其与第一抗体结合,再加入第二标记的抗体。如果所述第一抗体的存在减少了所述第二抗体的结合,则是抗体竞争。术语“与...竞争”还包括抗体的组合,其中一种抗体减少另一种抗体的结合,但当以相反的顺序添加抗体时,未观察到竞争。但是,在一些实施方案中,所述第一抗体和第二抗体抑制彼此的结合,而不管其添加顺序如何。在一些实施方案中,一种抗体使另一种抗体与其抗原的结合减少至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。

术语“表位”是指能够特异性结合抗体的抗原的一部分。表位通常由表面可接近的氨基酸残基和/或糖侧链组成,且可具有特定的三维结构特征,以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于,在变性溶剂的存在下,丧失与前者的结合,而与后者的结合未丧失。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基,以及不直接参与结合的其他氨基酸残基。与抗体结合的表位可以使用已知的表位检测技术进行测定,例如,与具有不同点突变的CD74变体进行结合的抗体测试。

多肽序列和参考序列之间的“同一性”百分比是指多肽序列中氨基酸残基与对比序列氨基酸残基相同的百分比,如果需要,在比对序列和引入间隙后,以实现最大百分比序列的同一性。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对,可以通过本领域技术范围内的各种方式进行实现,例如,使用公众可用的计算机软件,包括BLAST、BLAST-2、ALIGN、MEGALIGN(DNASTAR)或CLUSTALW 软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数,包括所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。

“保守取代”或“保守氨基酸取代”是指用一种或多种化学或功能相似的氨基酸取 代一个或多个氨基酸。提供相似氨基酸的保守取代表是本领域公知的。具有这种取代的多 肽序列被称为“保守修饰的变体”。此类保守修饰的变体是对多态性变体、种间同源物和等 位基因的补充,并且不排除。举例来说,以下氨基酸组被认为是彼此的保守取代。

其他保守取代可找到,例如在Creighton,Proteins:Structures and MolecularProperties 2nd ed. (1993)W.H.Freeman&Co.,New York,NY中。通过对亲本抗体氨基酸残基的一个或多个进行保守取代,而产生的抗体被称为“保守修饰的变体”。

术语“氨基酸”是指20种常见的、天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(Ala; A)、精氨酸(Arg;R)、天冬酰胺(Asn;N)、天冬氨酸(Asp;D)、半胱氨酸(Cys;C)、谷氨酸(Glu;E)、谷氨酰胺(Gln;Q)、甘氨酸(Gly;G)、组氨酸(His;H)、异亮氨酸(Ile;I)、亮氨酸(Leu;L)、赖氨酸(Lys;K)、蛋氨酸(Met;M)、苯丙氨酸(Phe;F)、脯氨酸(Pro; P)、丝氨酸(Ser;S)、苏氨酸(Thr;T)、色氨酸(Trp;W)、酪氨酸(Tyr;Y)和缬氨酸(Val; V)。

天然编码氨基酸是本领域技术人员公知的蛋白原氨基酸。它们包括20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)、较不常见的吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。天然编码的氨基酸包括22种天然氨基酸的翻译后变体,例如异戊酸氨基酸(prenylated amino acids)、异二戊烯化氨基酸(isoprenylated amino acids)、肉豆素酰化氨基酸、棕榈酰化氨基酸、N-连接糖基化氨基酸、O-连接糖基化氨基酸、磷酸化氨基酸和酰化氨基酸。

术语“非天然氨基酸”是指不是蛋白原氨基酸的氨基酸、或其翻译后修饰的变体。特别地,所述术语是指不是20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中一个的氨基酸,或其翻译后修饰的变体。

术语“偶联物”或“抗体偶联物”是指与一个或多个有效负载基团部分连接的抗体。所述抗体可以是本发明描述的任何抗体。所述有效负载可以是本发明所述的任何有效负载。所述抗体可以通过共价键直接连接有效负载,或者所述抗体可以通过连接体间接地连接有效负载。通常,所述连接体与所述抗体共价键合,并且还可以通过共价键连接所述有效负载。术语“抗体药物偶联物”或“ADC”是指偶联物,其中至少一种有效负载是治疗部分,譬如药物。

术语“有效负载”是指可以与抗体偶联的分子部分。在特定实施方案中,有效负载选自由治疗部分和标记部分组成的组。

术语“连接体”是指能够形成至少两个共价键的分子部分。通常,连接体能够与抗体形成至少一个共价键,与有效负载形成至少另一个共价键。在一些实施方案中,连接体可以与抗体形成一个以上的共价键。在一些实施方案中,连接体可以与有效负载形成一个以上的共价键,或者可以与一个以上的有效负载形成共价键。在连接体与抗体、或有效负载、或前述两者形成键后,剩余的结构,即在形成一个或多个共价键之后的连接体残基,在本发明中仍可称为“连接体”。术语“连接体前体”是指具有一个或多个能够与抗体或有效负载,或两者,形成共价键的活性基团的连接体。

在一些实施方案中,任何疾病或病症的“治疗”或“疗法”是指,减轻存在于受试者体内的疾病或病症。在另一个实施方案中,“治疗”或“疗法”包括减轻至少一种物理参数,所述参数可能是受试者难以察觉的。在另一个实施方案中,“治疗”或“疗法”包括通过物理方式(例如,可辨别的症状稳定化) 或生理方式(例如,物理参数的稳定化)或两者方式,来调理疾病或病症。在另一个实施方案中,“治疗”或“疗法”包括延迟疾病或病症的发作。

如本发明所用,术语“治疗有效量”或“有效量”是指当施用于受试者时有效预防或减轻疾病或疾病恶化,或导致症状改善的抗体或组合物的量。

如本发明所用,术语“抑制生长”(例如指细胞,比如肿瘤细胞)是指,与没有同CD74抗体接触的相同细胞的生长相比,包括任何与CD74抗体接触时细胞生长(例如,肿瘤细胞生长)可测量的减少。在一些实施方案中,生长可以被抑制至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%。所述细胞生长的减少可以通过多种机制发生,包括但不限于抗体内化、细胞凋亡、坏死和/或效应功能介导活动。

如本发明所用,术语“受试者”是指哺乳动物受试者。示例性受试者包括,但不限于人、猴、狗、猫、小鼠、大鼠、牛、马、山羊和绵羊。在一些实施方案中,受试者是指人。在一些实施方案中,受试者患有癌症、炎性疾病或病症,或自身免疫性疾病或病症,本发明提供的抗体可以对之进行治疗。在一些实施方案中,受试者是指患有或疑似患有癌症、炎性疾病或病症、或自身免疫性疾病或病症的人。

在本发明所示的一些化学结构中,一些取代基、化学基团和原子被描绘为具有弯曲/波浪线(例如,

术语“位点特异性”是指在多肽预定序列位置上多肽的修饰。所述修饰是发生在具有很少或没有变化的多肽上单个、可预测残基。在特定的实施方案中,在所述序列位置上引入修饰氨基酸,例如重组或合成。相似地,基团可以与多肽中特定序列位置残基进行“位点特异性”连接。在一些实施方案中,多肽可包含一种以上的位点特异性修饰。

2.偶联

本发明所提供的是抗体与CD74的偶联物。所述偶联物包含抗体与CD74,通过连接体直接或间接地与有效负载进行共价连接。在一些实施方案中,所述抗体与一种有效负载连接。在进一步的实施方案中,所述抗体与一种以上的有效负载进行连接。在一些实施方案中,所述抗体与两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或以上的有效负载进行连接。

所述有效负载可以是技术人员认为的任何有用有效负载。在一些实施方案中,所述有效负载是治疗部分。在一些实施方案中,所述有效负载是诊断部分,例如,标记物。有用的有效负载描述于如下部分和示例中。

所述连接体可以是能够与抗体形成至少一个键并且与有效负载形成至少一个键的任何连接体。本发明所述的有用连接体如以下的段落和实施例中所述。

在本发明提供的偶联物中,所述抗体可以是任何对CD74具有结合特异性的抗体。所述CD74 可以来自任何物种。在一些实施方案中,所述CD74来自于脊椎动物的CD74。在一些实施方案中,所述CD74来自于哺乳动物的CD74。在一些实施方案中,所述CD74来自于人源的CD74。在一些实施方案中,所述CD74来自于小鼠的CD74。在一些实施方案中,所述CD74来自于食蟹猴的CD74。

在一些实施方案中,所述CD74抗体与本发明所述的抗体竞争结合。在一些实施方案中,所述CD74抗体与本发明所述的抗体结合于相同的表位。

所述抗体通常是包含多条多肽链的蛋白质。在一些实施方案中,所述抗体是包含两条相同轻 (L)链和两条相同重(H)链的异四聚体。每条轻链可通过一个共价二硫键与重链连接。每条重链可以通过一个或多个共价二硫键与另一条重链连接。每条重链和每条轻链也可含有一个或多个链内二硫键。如本领域技术人员所知,每条重链通常包含由许多恒定结构域连接地可变结构域(V

本发明所提供的抗体可以具有本领域技术人员已知的任何抗体形式。它们可以是全长的,或片段的。示例性全长抗体包括IgA、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM 等。示例性片段包括Fv、Fab、Fc、sFv等。

在一些实施方案中,所述偶联物抗体包含本发明所述的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR序列。在一些实施方案中,所述偶联物抗体包含本发明所述的重链可变结构域(V

在一些实施方案中,所述抗体偶联物可以由包含一个或多个活性基团的抗体形成。在一些实施方案中,所述抗体偶联物可以由包含所有天然编码氨基酸的抗体形成。本领域技术人员将认识到,几种天然编码氨基酸包括能够与有效负载或连接体偶联的活性基团。这些活性基团包括半胱氨酸侧链、赖氨酸侧链和氨基末端基团。在这些实施方案中,所述抗体偶联物可包含与抗体活性基团残基相连接的有效负载或连接体。在这些实施方案中,所述有效负载前体或连接体前体包含能与抗体活性基团形成键的活性基团。典型的活性基团包括马来酰亚胺基团、活性碳酸酯(包括但不限于对硝基苯酯)、活化酯(包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯和醛)。特别地,有用的活性基团包括马来酰亚胺和琥珀酰亚胺,比如N-羟基琥珀酰亚胺,用于形成与半胱氨酸和赖氨酸侧链的键。更进一步的活性基团如以下段落和实施例中所述。

在进一步的实施方案中,如本发明所述,所述抗体包含一种或多种含有活性基团的修饰氨基酸。通常,所述修饰氨基酸不是天然编码氨基酸。这些修饰的氨基酸可包含用于与连接体前体或有效负载前体形成共价键的活性基团。本领域技术人员可以使用活性基团将多肽和能与修饰氨基酸形成共价键的任何分子个体进行连接。因此,本发明所提供的是包含直接地或间接地通过连接体连接有效负载修饰氨基酸残基的抗体偶联物。示例性修饰氨基酸如本发明以下段落所述。通常,修饰氨基酸含有活性基团,所述活性基团可与带互补活性基团的连接体或有效负载形成键。

所述非天然氨基酸位于抗体的多肽链的选定位置。经确定,这些位置可为非天然氨基酸取代提供最佳位点。每个位点能够携带具有最佳结构、功能和/或制备抗体方法的非天然氨基酸。

在一些实施方案中,用于取代的位点特异性位置提供稳定的抗体。稳定性可以通过任何本领域技术人员显而易见的技术进行测量。

在一些实施方案中,用于取代的位点特异性位置提供具有最佳功能特性的抗体。例如,与不含位点特异性非天然氨基酸的抗体相比,抗体对其靶抗原的结合亲和力较少或没有损失。在一些实施方案中,与不含位点特异性非天然氨基酸的抗体相比,抗体可显示出增强的结合。

在一些实施方案中,用于取代的位点特异性位置提供一种制备便捷的抗体。例如,在一些实施方案中,所述抗体在其合成方法中显示出优异的性质,讨论如下。在一些实施方案中,与不含位点特异性非天然氨基酸的抗体相比,所述抗体在生产中可显示很少或没有产量损失。在一些实施方案中,与不含位点特异性非天然氨基酸的抗体相比,所述抗体生产显示出产量增加。在一些实施方案中,与不含位点特异性非天然氨基酸的抗体相比,所述抗体可显示很少或不显示tRNA抑制的丧失。在一些实施方案中,与不含位点特异性非天然氨基酸的抗体相比,所述抗体可在生产中显示出增强的tRNA 抑制。

在一些实施方案中,用于取代的位点特异性位置提供一种具有优越溶解性能的抗体。在一些实施方案中,与不含位点特异性非天然氨基酸的抗体相比,所述抗体可显示很少或没有溶解度损失。在一些实施方案中,与不含位点特异性非天然氨基酸的抗体相比,所述抗体可显示出增强的溶解性。

在一些实施方案中,用于取代的位点特异性位置提供一种优异表达性能的抗体。在一些实施方案中,与不含位点特异性非天然氨基酸的抗体相比,所述抗体可以表现出很少或没有表达损失。在一些实施方案中,与不含位点特异性非天然氨基酸的抗体相比,所述抗体可显示增强的表达。

在一些实施方案中,用于取代的位点特异性位置提供一种具有优异折叠性能的抗体。在一些实施方案中,与不含位点特异性非天然氨基酸的抗体相比,所述抗体在适当折叠中显示出很少或没有损失。在一些实施方案中,与不含位点特异性非天然氨基酸的抗体相比,所述抗体可显示出增强的折叠性能。

在一些实施方案中,用于取代的位点特异性位置提供了一种可优良偶联的抗体。如下所述,几种非天然氨基酸具有侧链或官能团,所述官能团促进抗体与第二种试剂直接偶联,或通过连接体偶联。在一些实施方案中,与在其他位置没有相同或其他非天然氨基酸的抗体相比,所述抗体可显示出增强的偶联效率。在一些实施方案中,与在其他位置没有相同或其他非天然氨基酸的抗体相比,所述抗体可以显示增强的偶联产率。在一些实施方案中,与在其他位置没有相同或其他非天然氨基酸的抗体相比,所述抗体可显示出增强的偶联特异性。

所述一种或多种非天然氨基酸位于抗体的至少一条多肽链中的选定位点特异性位置。所述多肽链可以是抗体中任何多肽链,所述抗体没有限制,包括轻链或重链。所述位点特异性位置可以在抗体的任何结构域中,包括任何可变结构域和任何恒定结构域。

在一些实施方案中,本发明提供的抗体在位点特异性位置包含一个非天然氨基酸。在一些实施方案中,本发明提供的抗体在位点特异性位置包含两个非天然氨基酸。在一些实施方案中,本发明提供的抗体在位点特异性位置包含三个非天然氨基酸。在一些实施方案中,本发明提供的抗体在位点特异性位置包含三个以上的非天然氨基酸。

在一些实施方案中,本发明提供的抗体,根据Kabat或Chothia或EU编号方案,在选自由 HC-F404、HC-K121、HC-Y180、HC-F241、HC-221、LC-T22、LC-S7、LC-N152、LC-K42、LC-E161、 LC-D170、HC-S136、HC-S25、HC-A40、HC-S119、HC-S190、HC-K222、HC-R19、HC-Y52、或HC-S70 组成的组的重链或轻链残基中的一个或多个位置上包含一个或多个非天然氨基酸,或其翻译后修饰变体。在这些名称中,HC表示重链残基,以及LC表示轻链残基。

在一些实施方案中,本发明提供的偶联物具有式(C1)或(C2)所示的结构:

COMP-R-W

(C2)

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、位置异构体或互变异构体,其中:

COMP是抗CD74抗体的残基;

PAY是有效负载基团部分;

W

EG不存在、或者是消除基团(eliminator group);

每个RT是释放触发基团,在式(C1)或(C2)的骨架中或与EG键合,其中每个RT 是任选的;

HP是键、不存在或是二价亲水基团;

SG是键、不存在或是二价间隔基团;和

R是氢、末端偶联基团、或末端偶联基团的二价残基。

连接基团

连接基团有助于将消除剂基团、释放触发基团、疏水基团、间隔基团和/或偶联基团结合到化合物中。对本领域技术人员来说,有用的连接基团是公知且显而易见的。本发明提供了有用的连接基团的示例。在一些实施方案中,连接基团指定为W

消除基团

消除基团有助于在体内和/或体外从化合物或偶联物的其余部分分离得到本发明所述的化合物或偶联物的生物活性部分。消除基团协同释放触发基团,可促进本发明所述的化合物或偶联物的生物活性部分的分离。例如,所述消除基团和所述释放触发基团可以在释放反应中发生反应,在体内和 /或体外从化合物或偶联物中释放出本发明所述化合物或偶联物的生物活性部分。通过释放触发基团启动释放反应时,所述消除基团切割生物活性基团或生物活性基团的药物前体,形成稳定的无毒实体,其对生物活性基团的活性没有进一步影响。

在一些实施方案中,所述消除基团在本发明中称为EG。有用的消除基团包括本发明所述的那些基团。在一些实施方案中,所述消除基团是:

释放触发基团

释放触发基团在体内和/或体外促进本发明所述偶联物或化合物的生物活性部分与化合物或偶联物的其余部分之间的分离。释放触发基团协同消除基团,还可以促进本发明所述化合物或偶联物的生物活性部分的分离。例如,所述消除基团和释放触发基团可以在释放反应中发生反应,在体内和 /或体外从本发明所述的化合物或偶联物中释放出化合物或偶联物中的生物活性部分。在一些实施方案中,所述释放触发剂可通过具有高肿瘤的生物发生驱动反应:非肿瘤特异性,比如在肿瘤环境中过表达酶的蛋白水解作用。

在一些实施方案中,在本发明中所述释放触发基团称为RT。在一些实施方案中,RT是二价的且键合在式(C1)的骨架内。在其他实施方案中,RT是单价的,且如上所述与EG键合。有用的释放触发基团包括本发明所述的那些基团。在一些实施方案中,所述释放触发基团包含天然或非天然氨基酸的残基或糖环的残基。在一些实施方案中,所述释放触发基团是:

亲水基团

亲水基团有助于增加本发明所述化合物的亲水性。有人认为,增加的亲水性可在水溶液中有更大的溶解度,例如在生物系统中发现的水溶液。亲水基团也可以用作间隔基团,所述间隔基团在本发明中进一步详细描述。

在一些实施方案中,本发明将亲水基团称为HP。有用的亲水基团包括本发明所述的那些基团。在一些实施方案中,所述亲水基团是二价聚(乙二醇)。在一些实施方案中,所述亲水基团是如下式所示的二价聚(乙二醇):

在一些实施方案中,所述亲水基团是具有下式所示的二价聚(乙二醇):

在一些其他实施方案中,所述亲水基团是具有下式所示的二价聚(乙二醇):

在其他实施方案中,所述亲水基团是具有下式的二价聚(乙二醇):

在其他实施方案中,所述亲水基团是具有下式所示的二价聚(乙二醇):

间隔基团

间隔基团促进本发明所述化合物偶联基团与其他基团的间隔。此类间隔可导致本发明所述化合物与第二化合物的更有效地偶联。所述间隔基团也可以稳定所述偶联基团。

在一些实施方案中,本发明所述间隔基团称为SP。有用的间隔基团包括本发明所述的那些基团。在一些实施方案中,所述间隔基团为:

在一些实施方案中,所述SP为

在一些实施方案中,所述二价聚(乙二醇)具有下式:

在一些其他实施方案中,所述二价聚(乙二醇)具有下式:

在其他实施方案中,所述二价聚(乙二醇)具有下式:

在其他实施方案中,所述二价聚(乙二醇)具有下式:

偶联基团及其残基

偶联基团促进本发明所述化合物与第二化合物,譬如靶向部分,的偶联。在一些实施方案中,所述偶联基团在本发明中表示为R。偶联基团可以通过本领域技术人员已知的任何合适的反应机制发生反应。在一些实施方案中,偶联基团通过[3+2]炔-叠氮化物环加成反应,反电子需求Diels-Alder连接反应,硫醇-亲电子反应,或羰基-羟基胺反应进行反应,如本发明所述的。在一些实施方案中,所述偶联基团包含炔烃、应变的炔烃、四嗪、硫醇、对乙酰基-苯丙氨酸残基、羟基胺、马来酰亚胺、或叠氮化物。在一些实施方案中,所述偶联基团为:

偶联后,形成所述偶联基团的二价残基,并与第二化合物的残基进行键合。所述二价残基的结构由形成所述偶联物所用的偶联反应类型决定。

在一些实施方案中,当通过[3+2]炔-叠氮化物环加成反应形成偶联物时,所述偶联基团的二价残基包含三唑环或包含三唑环的稠合环状基团。在一些实施方案中,当通过[3+2]炔-叠氮化物环加成反应形成偶联物时,所述偶联基团的二价残基为:

在实施方案中,本发明提供了如下式所示的任意的偶联物,其中COMP表示所述抗CD74抗体的残基,以及PAY表示有效负载基团部分:

在实施方案中,本发明提供了如式101a-104b中任意的偶联物,其中COMP表示所述抗CD74 抗体的残基,以及PAY表示有效负载基团部分:

在具体实施方案中,本发明提供了如式101a-104b中任意的所述抗-CD74偶联物,其中COMP 表示如下式(30)所示的非天然氨基酸残基。在具体的实施方案中,本发明提供了如式101a-104b中任意的抗-CD74偶联物,其中COMP表示根据EU编号系统,在重链位置404上如下式(30)所示的非天然氨基酸残基。在具体的实施方案中,本发明提供了如式101a-104b中任意的抗-CD74偶联物,其中COMP表示根据EU编号系统,在重链位置241上如下式(30)所示的非天然氨基酸残基。在具体的实施方案中,本发明提供了根据式101a-104b中任意的抗-CD74偶联物,其中COMP表示根据 EU编号系统,在重链位置222上如下式(30)所示的非天然氨基酸残基。在具体的实施方案中,本发明提供了根据式101a-104b中任意的抗-CD74偶联物,其中COMP表示根据Kabat或Chothia编号系统,在轻链位置7如下式(30)所示的非天然氨基酸残基。在一些实施方案中,PAY选自由美登素 (maytansine)、哈米特林(hemiasterlin)、鹅膏蕈碱(amanitin)、单甲基奥瑞他汀F(MMAF)和单甲基奥瑞他汀E(MMAE)组成的组。在一些实施方案中,PAY为美登素(maytansine)。在一些实施方案中,PAY为哈米特林(hemiasterlin)。在一些实施方案中,PAY为鹅膏蕈碱(amanitin)。在一些实施方案中,PAY为单甲基奥瑞他汀F(MMAF)。在一些实施方案中,PAY为单甲基奥瑞他汀E(MMAE)。

在具体实施方案中,本发明提供了如式101a-104b中任意的抗-CD74偶联物,其中COMP表示如下式(56)所示的非天然氨基酸残基。在具体的实施方案中,本发明提供了如式101a-104b中任意的抗-CD74偶联物,其中COMP表示根据EU编号系统,在重链位置404上如下式(56)所示的非天然氨基酸残基。在具体的实施方案中,本发明提供了如式101a-104b中任意的抗-CD74偶联物,其中COMP表示根据EU编号系统,在重链位置241上如下式(56)所示的非天然氨基酸残基。在具体的实施方案中,本发明提供了根据式101a-104b中任意的抗-CD74偶联物,其中COMP表示根据 EU编号系统,在重链位置222上如下式(56)所示的非天然氨基酸残基。在具体的实施方案中,本发明提供了根据式101a-104b中任意的抗-CD74偶联物,其中COMP表示根据Kabat或Chothia编号系统,在轻链位置7如下式(56)所示的非天然氨基酸残基。在一些实施方案中,PAY选自由美登素 (maytansine)、哈米特林(hemiasterlin)、鹅膏蕈碱(amanitin)、MMAF和MMAE组成的组。在一些实施方案中,PAY为美登素(maytansine)。在一些实施方案中,PAY为哈米特林(hemiasterlin)。在一些实施方案中,PAY为鹅膏蕈碱(amanitin)。在一些实施方案中,PAY为MMAF。在一些实施方案中,PAY为MMAE。

在具体实施方案中,本发明提供了如式101a-104b中任意的抗-CD74偶联物,其中COMP表示非天然氨基酸残基对-叠氮基-L-苯丙氨酸。在具体的实施方案中,本发明提供了如式101a-104b中任意的抗-CD74偶联物,其中COMP表示根据EU编号系统,重链位置404上的非天然氨基酸残基对 -叠氮基-苯丙氨酸。在具体的实施方案中,本发明提供了如式101a-104b中任意的抗-CD74偶联物,其中COMP表示根据EU编号系统,重链位置241上的非天然氨基酸残基对-叠氮基-L-苯丙氨酸。在具体的实施方案中,本发明提供了根据式101a-104b中任意的抗-CD74偶联物,其中COMP表示根据 EU编号系统,重链位置222上的非天然氨基酸残基对-叠氮基-L-苯丙氨酸。在具体的实施方案中,本发明提供了根据式101a-104b中任意的抗-CD74偶联物,其中COMP表示根据Kabat或Chothia编号系统,轻链位置7上的非天然氨基酸残基对-叠氮基-L-苯丙氨酸。在一些实施方案中,PAY选自由美登素(maytansine)、哈米特林(hemiasterlin)、鹅膏蕈碱(amanitin)、MMAF和MMAE组成的组。在一些实施方案中,PAY为美登素(maytansine)。在一些实施方案中,PAY为哈米特林(hemiasterlin)。在一些实施方案中,PAY为鹅膏蕈碱(amanitin)。在一些实施方案中,PAY为MMAF。在一些实施方案中,PAY为MMAE。

3.有效负载

所述分子有效负载可以是本领域技术人员可能想要与所述多肽偶联的任何分子个体。在一些实施方案中,所述有效负载是治疗部分。在此类实施方案中,所述抗体偶联物可用于将治疗部分瞄准其分子靶标。在一些实施方案中,所述有效负载是标记部分。在此类实施方案中,所述抗体偶联物可用于检测所述多肽与其靶标的结合。在一些实施方案中,所述有效负载是细胞毒性基团部分。在此类实施方案中,所述抗体偶联物可以将其细胞毒性基团瞄准患病细胞,例如癌细胞,以引发细胞的破坏或消除。偶联物包含其他分子有效负载,所述分子有效负载对本领域技术人员是显而易见的,并且在本发明所述偶联物的范围内。

在一些实施方案中,抗体偶联物可具有选自由标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、光交联剂、细胞毒性化合物、放射性核素、药物、亲和标记、光亲和标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、DNA、RNA、反义多核苷酸、肽、水溶性树枝状大分子、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属部分、放射性部分、新的官能团、与其他分子共价或非共价相互作用的基团、光固化部分、光异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、掺入重原子的部分、化学可切割基团、光可切割基团、细长侧链、碳连接糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、同位素标记部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、嵌入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或其任何组合组成的组的有效负载。在实施方案中,所述有效负载为标记物、染料、聚合物、细胞毒性化合物、放射性核素、药物、亲和标记、树脂、蛋白质、多肽、多肽类似物、抗体、抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、DNA、RNA、肽、荧光团或碳连接的糖。在另一个实施方案中,所述有效负载为标记物、染料、聚合物、药物、抗体、抗体片段、DNA、RNA或肽。

有用的药物有效负载包括任何细胞毒性、细胞抑制剂或免疫调节剂。有用的细胞毒性或免疫调节剂类包括,例如,抗微管蛋白剂、阿里他汀(auristatin)、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂(例如铂络合物,比如顺铂、单(铂)、双(铂)和三-核铂复合物和卡铂)、蒽环霉素、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、钙调蛋白抑制剂、化疗增敏剂、多卡米新类(duocarmycins)、依托泊苷类(etoposides)、氟化嘧啶类、离子载体类、榭皮素类(lexitropsins)、美登木素类(maytansinoids)、亚硝基脲类(nitrosoureas)、铂醇类(platinols)、成孔化合物类、嘌呤抗代谢物类。嘌呤霉素类 (puromycins)、辐射敏化剂类、雷帕霉素类(rapamycins)、类固醇类、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂类、长春花生物碱类等。

单个细胞毒性或免疫调节剂包括,例如,雄激素(androgen)、安定霉素(AMC)、天冬酰胺酶(asparaginase)、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、丁硫氨酸亚砜亚胺(buthionine sulfoximine)、加利车霉素(calicheamicin)、加利车霉素衍生物(calicheamicin derivatives)、喜树碱(camptothecin)、卡铂(carboplatin,)、卡莫司汀(carmustine,BSNU)、CC-1065、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、秋水仙碱(colchicine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、胞苷阿拉伯糖苷(cytidine arabinoside)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、达卡巴嗪(dacarbazine)、放线菌素(原放线菌素)(dactinomycin,formerly actinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、去甲嗪(decarbazine)、DM1、DM4、多西紫杉醇(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、依托泊苷(etoposide)、雌激素(an estrogen)、5-氟脱氧尿苷、5-氟脲嘧啶(5–fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、短杆菌肽D(gramicidin D)、羟基脲(hydroxyurea)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、洛莫司汀(lomustine,CCNU)、美登素(maytansine)、恩比新(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤(methotrexate)、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素C(mitomycin C)、米托蒽醌(mitoxantrone)、硝基咪唑(nitroimidazole)、紫杉醇(paclitaxel)、海葵毒素(palytoxin)、光神霉素(plicamycin)、丙卡比嗪(procarbizine)、根霉菌素(rhizoxin)、链唑霉素(streptozotocin)、天葵甙(tenoposide)、6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine)、噻替派(thioTEPA)、拓扑替康(topotecan)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、VP-16和VM-26。

在一些实施方案中,合适的细胞毒性剂包括,例如,DNA小沟结合剂(例如,烯二炔类 (enediynes)和榭皮素类(lexitropsins),CBI化合物;参见美国专利号6,130,237)、多卡米新类 (duocarmycins)、紫杉烷类(例如紫杉醇(paclitaxel)和多西紫杉醇(docetaxel))、嘌呤霉素类 (puromycins)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)、CC-1065、SN-38、托泊替康(topotecan)、吗啉-诺柔比星(morpholino-doxorubicin)、根瘤菌素(rhizoxin)、氰基吗啉代-多柔比星 (cyanomorpholino-doxorubicin)、棘霉素(echinomycin)、考布他汀(combretastatin)、奈托菌素 (netropsin)、埃博霉素(epothilone)A和埃博霉素(epothilone)B、雌莫司汀(estramustine)、隐藻毒素类(cryptophycins)、西马多丁(cemadotin)、美登素类(maytansinoids)、盘孢霉素(discodermolide)、软珊瑚醇(eleutherobin)、和米托蒽醌(mitoxantrone)。

在一些实施方案中,所述有效负载是抗微管蛋白剂。抗微管蛋白剂的示例包括但不限于紫杉烷类(例如

在一些实施方案中,所述细胞毒性剂是美登木素生物碱,另一组抗微管蛋白剂。例如,在具体的实施方案中,所述美登木素生物碱可以是美登素或DM-1(ImmunoGen,Inc.;参见Chari et al., 1992,Cancer Res.52:127-131)。

在一些实施方案中,所述有效负载是阿里他汀(auristatin),例如阿里他汀E或其衍生物。例如,所述阿里他汀E衍生物可以是在阿里他汀E和酮酸之间形成的酯。例如,阿里他汀E可以与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应,分别产生AEB和AEVB。其他典型的阿里他汀衍生物包括AFP (阿里他汀苯丙氨酸苯二胺)、MMAF(单甲基奥瑞他汀F)和MMAE(单甲基奥瑞他汀E)。所述奥瑞他汀衍生物的合成和结构描述于美国专利申请公开号2003-0083263、20050238649和 2005-0009751;国际专利公开号WO 04/010957、国际专利公开号WO 02/088172和美国专利号 6,323,315、6,239,104、6,034,065、5,780,588、5,665,860、5,663,149、5,635,483、5,599,902、5,554,725、 5,530,097、5,521,284、5,504,191、5,410,024、5,138,036、5,076,973、4,986,988、4,978,744、4,879,278、 4,816,444和4,486,414中。

在一些实施方案中,所述有效负载不是放射性同位素。在一些实施方案中,所述有效负载不是放射性的。

在一些实施方案中,所述有效负载是抗代谢物。例如,所述抗代谢物可以是嘌呤拮抗剂(比如,硫唑嘌呤或麦考酚酸莫酯)、二氢叶酸还原酶抑制剂(例如甲氨蝶呤)、阿昔洛韦(acyclovir)、胍基环维尔(gangcyclovir)、齐多夫定(zidovudine)、阿糖腺苷(vidarabine)、利巴韦林(ribavarin)、叠氮胸苷(azidothymidine)、胞苷阿拉伯糖苷(cytidine arabinoside)、金刚烷胺(amantadine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、碘脱氧尿苷(iododeoxyuridine)、膦甲酸钠(poscarnet)或三氟尿苷 (trifluridine)。

在其他实施方案中,所述有效负载是他克莫司(tacrolimus)、环孢菌素(cyclosporine)、 FU506或雷帕霉素(rapamycin)。在进一步的实施方案中,所述药物为阿地白介素(aldesleukin)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利维A酸(alitretinoin)、别嘌呤醇(allopurinol)、六甲蜜胺(altretamine)、氨磷汀(amifostine)、阿那曲唑(anastrozole)、三氧化二砷(arsenic trioxide)、贝沙罗汀(bexarotene)、贝萨罗汀(bexarotene)、卡芦睾酮(calusterone)、卡培他滨(capecitabine)、塞来昔布(celecoxib)、克拉屈滨(cladribine)、阿法达贝汀(Darbepoetin alfa)、地尼白介素(Denileukin diftitox)、右旋唑烷(dexrazoxane)、丙酸去氧雄甾酮(dromostanolone propionate)、表柔比星(epirubicin)、阿法依伯汀(Epoetin alfa)、雌莫司汀(estramustine)、依西美坦(exemestane)、非格司亭(Filgrastim)、氟尿嘧啶(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟维司群(fulvestrant)、吉西他滨(gemcitabine)、单抗奥佐米星(MYLOTARG)、戈舍瑞林(goserelin)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)、干扰素α-2a(Interferon alfa-2a)、伊立替康(irinotecan)、来曲唑(letrozole)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、左旋咪唑(levamisole)、甲氧苄胺(meclorethamine) 或氮芥(nitrogen mustard)、甲地孕酮(megestrol)、美斯纳(mesna)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氧沙林(methoxsalen)、丝裂霉素C(mitomycin C)、米托烷(mitotane)、苯丙酸诺龙(nandrolone phenpropionate)、奥普列维金(oprelvekin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、帕米膦酸二钠(pamidronate)、聚乙二醇化酶(pegademase)、培加帕酶(pegaspargase)、非格司亭(pegfilgrastim)、喷司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、光辉霉素(plicamycin)、卟吩姆钠(porfimersodium)、甲苄肼(procarbazine)、奎纳克林(quinacrine)、拉布立酶(rasburicase)、利妥昔单抗(Rituximab)、沙拉斯(Sargramostim)、链脲菌素(streptozocin)、它莫西芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、睾酮内酯(testolactone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫单抗(Tositumomab)、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)、维A酸(tretinoin)、尿嘧啶(uracil mustard)、戊柔比星(valrubicin)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)或唑来膦酸盐(zoledronate)。

在一些实施方案中,所述有效负载是免疫调节剂。所述免疫调节剂可以是,例如,胍基环维尔(gangcyclovir)、依那西普(etanercept)、他克莫司(tacrolimus)、环孢菌素(cyclosporine)、雷帕霉素(rapamycin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)或甲氨蝶呤(methotrexate)。或者,所述免疫调节剂可以是,例如,糖皮质激素(例如皮质醇或醛固酮)或糖皮质激素类似物(例如泼尼松或地塞米松)。

在一些实施方案中,所述免疫调节剂是抗炎剂,例如芳基羧酸衍生物、含吡唑的衍生物、昔康衍生物和烟酸衍生物。抗炎剂的类别包括,例如,环加氧酶抑制剂、5-脂氧合酶抑制剂和白三烯受体拮抗剂。

合适的环加氧酶抑制剂包括甲氯芬那酸、甲芬那酸、卡洛芬、双氯芬酸、二氟尼柳、芬布芬、非诺洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、萘丁酮、舒林酸、替诺昔康和托美汀。

合适的脂氧合酶抑制剂包括氧化还原抑制剂(例如,儿茶酚丁烷衍生物、去甲二氢愈创木酸(NDGA)、马索罗酚(masoprocol)、菲尼酮(phenidone)、碘番灵(Ianopalen)、吲唑啉酮(indazolinones)、萘普生(naphazatrom)、苯并呋喃醇(benzofuranol)、烷基羟胺))、和非氧化还原抑制剂(例如,羟基噻唑、甲氧基烷基噻唑、苯并吡喃及其衍生物、甲氧基四氢吡喃、乳香酸和其乙酰化衍生物、被环烷基取代的喹啉甲氧基苯乙酸)、以及氧化还原抑制剂的前体。

其他合适的脂氧合酶抑制剂包括抗氧化剂(例如,酚类、没食子酸丙酯、类黄酮和/或含有类黄酮的天然存在的底物、黄酮的羟基化衍生物、黄酮醇(flavonol)、二氢槲皮素(dihydroquercetin)、木犀草素(luteolin)、高良姜素(galangin)、奥洛伯(orobol)、查尔酮的衍生物、4,2',4'-三羟基查耳酮、邻氨基苯酚、N-羟基脲、苯并呋喃醇、依布硒啉和增加还原硒酶活性的物质)、铁螯合剂(例如,异羟肟酸及其衍生物、N-羟基脲、2-苄基-1-萘酚、儿茶酚、羟胺、卡诺醇羧酸C(carnosol trolox C)、儿茶酚、萘酚、柳氮磺吡啶、齐留通(zyleuton)、5-羟基邻氨基苯甲酸和4-(ω-芳烷基)苯基链烷酸)、含咪唑的化合物(如酮康唑和伊曲康唑)、吩噻嗪和苯并吡喃衍生物。

其他合适的脂氧合酶抑制剂包括类二十烷酸的抑制剂(例如,十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳六烯酸、二十二碳六烯酸及其酯、PGE1(前列腺素E1)、PGA2(前列腺素 A2)、维前列醇、15-单羟基二十碳四烯酸、15-单羟基-廿碳三烯酸和15-单羟基二十碳五烯酸、白三烯B5、C5和D5)、干扰钙流动的化合物、吩噻嗪类、二苯基丁胺、维拉帕米、镰刀菌苷、姜黄素、绿原酸、咖啡酸、5,8,11,14-二十碳四烯酸(ETYA)、羟基苯基赖氨酰胺、依那普仑、七叶苷、二乙基咔嗪、邻二氮唑、黄芩素、普昔罗米、硫醚、二烯丙基硫醚和二-(1-丙烯基)硫化物。

白三烯受体拮抗剂包括骨化三醇,昂唑司特,Bayer Bay-x-1005,Ciba-GeigyCGS-25019C,依布硒啉,Leo DenmarkETH-615,Lilly LY-293111,Ono ONO-4057,TerumoTMK-688,Boehringer Ingleheim BI-RM-270,Lilly LY 213024,Lilly LY 264086,LillyLY 292728,Ono ONO LB457, Pfizer 105696,Perdue Frederick PF 10042,Rhone-Poulenc Rorer RP 66153,SmithKline Beecham SB-201146,SmithKline Beecham SB-201993,SmithKline Beecham SB-209247,Searle SC-53228, Sumitamo SM 15178,American Home Products WAY 121006,Bayer Bay-o-8276,Warner-Lambert CI-987,Warner-Lambert CI-987BPC-15LY 223982,Lilly LY 233569,Lilly LY-255283,MacroNexMNX-160,Merck and Co.MK-591,Merck和Co.MK-886,Ono ONO-LB-448,Purdue FrederickPF-5901,Rhone-Poulenc Rorer RG14893,Rhone-Poulenc Rorer RP 66364,Rhone-Poulenc Rorer RP 69698,Shionoogi S-2474,Searle SC-41930,Searle SC-50505,Searle SC-51146,Searle SC-52798, SmithKline Beecham SK&F-104493,Leo DenmarkSR2566,Tanabe T-757和Teijin TEI-1338。

其他有用的药物有效负载包括有助于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括厄洛替尼 (

其他有用的有效负载包括:(i)用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂,例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM),包括,例如,他莫昔芬(包括

在一些实施方案中,所述有效负载是抗体或抗体片段。在一些实施方案中,所述有效负载抗体或片段可以由本领域技术人员公认的任何免疫球蛋白基因进行编码。所述免疫球蛋白基因包括但不限于κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因,以及免疫球蛋白可变区基因。所述术语包括本领域技术人员公认的全长抗体和抗体片段及其变体。示例性片段包括但不限于Fv、Fc、 Fab和(Fab')

在一些实施方案中,所述有效负载是一种或多种水溶性聚合物。多种大分子聚合物和其他分子可以与本发明所述的多肽连接,以调节多肽的生物学特性,和/或为多肽提供新的生物学特性。所述大分子聚合物可以通过天然编码的氨基酸,非天然编码的氨基酸,或天然或修饰的氨基酸的任何功能性取代基,或添加到天然或修饰的氨基酸的任何取代基或官能团,与多肽进行连接。所述聚合物的分子量可以是宽范围的,包括但不限于约100Da到约100,000Da或以上。

所选择的聚合物可以是水溶性的,使得与其连接的蛋白质不会在水性环境(例如生理环境) 中沉淀。所述聚合物可以是支链或非支链的。优选地,对于最终产品制剂的治疗用途,所述聚合物是药学上可接受的。

在一些实施方案中,所述聚乙二醇分子与多肽分子的比例将发生变化,它们在所述反应混合物中的浓度也会发生变化。通常,所述最佳比例(就反应效率而言,其中存在最少过量的未反应蛋白质或聚合物)可以通过所选聚乙二醇的分子量和可得到的可用活性基团的数量来确定。关于分子量,通常聚合物的分子量越高,可与蛋白质连接的聚合物分子数量越少。类似地,在优化这些参数时应考虑聚合物的支化。通常,分子量越高(或分支越多),聚合物:蛋白质的比率越高。

所述水溶性聚合物可以是任何结构形式,包括但不限于直链、叉形或支链。通常,所述水溶性聚合物是聚(亚烷基二醇),例如聚(乙二醇)(PEG),但也可以使用其他水溶性聚合物。举例来说, PEG用于描述一些实施方案。

PEG是众所周知的水溶性聚合物,其可商业采购获得,或使用本领域熟知的方法(Sandler and Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,NewYork,Vol.3,pages 138-161),通过乙二醇的开环聚合制得。术语“PEG”广泛用于包括任何聚乙二醇分子,不考虑PEG的末端的大小或修饰,并且可以表示为由下式与多肽连接:XO–(CH

在一些实施方案中,所述有效负载是含叠氮基或乙炔的聚合物,所述聚合物包含平均分子量为约800Da至约100,000Da的水溶性聚合物骨架。所述水溶性聚合物的聚合物骨架可以是聚(乙二醇)。然而,应该理解的是,各种水溶性聚合物,包括但不限于聚(乙烯)乙二醇,以及其它相关聚合物,包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇),也适合使用,术语PEG或聚(乙二醇)的使用是旨在包含和包括所有这些分子。术语PEG包括但不限于任何形式的聚(乙二醇),包括双功能PEG、多臂PEG、衍生化PEG、分叉PEG、支化PEG、侧链PEG(即PEG或具有一个或多个悬挂于聚合物主链的上的官能团)、或其中具有可降解键的PEG。

所述聚合物骨架可以是直链状或支链状。支链聚合物骨架通常是本领域公知的。通常,支链聚合物具有中心分支核心部分和连接至中心分支核心的多个线性聚合物链。PEG通常以支链形式使用,其所述支链形式可通过向各种如甘油、甘油低聚物、季戊四醇和山梨糖醇的各种多元醇加入环氧乙烷而制得。所述中心分支部分也可以由几种氨基酸如赖氨酸进行衍生而得。所述支链聚(乙二醇)可表示为通式R(-PEG-OH)

许多其他聚合物也适合使用。在一些实施方案中,水溶性聚合物主链,特别地含有从2至约 300个末端。合适的聚合物的实例包括但不限于其他聚(亚烷基二醇),比如聚(丙二醇)(“PPG”)及其共聚物(包括但不限于乙二醇和丙二醇的共聚物)、三元共聚物及其混合物等。尽管每条聚合物骨架的分子量可以变化,但通常在约800Da到约100,000Da的范围内,通常为约6,000Da到约80,000Da。

本领域普通技术人员将认识到,前述列表的主要水溶性骨架决非全部,而仅是说明性举例,且所有具备本发明特性的聚合物材料都被认为适合使用。

在一些实施方案中,所述聚合物衍生物是“多官能的”,所述“多功能的”是指聚合物骨架具有至少两个末端,可能多达约300个末端,官能团功能化或官能团活化。多官能聚合物衍生物包括但不限于具有两个末端的线性聚合物,每个末端可与相同或不同的官能团键合。

4.连接体

在一些实施方案中,所述抗体通过含有一个或多个能够与抗体氨基酸和有效负载基团发生反应的连接体连接到有效负载。所述一个或多个连接体可以是本领域技术人员显而易见的任何连接体。

本发明使用的术语“连接体”是指通常由化学反应形成的基团或键,通常是共价键。

有用的连接体包括本发明所述的那些连接体。在一些实施方案中,所述连接体是本领域技术人员公知的任何二价或多价连接体。有用的二价连接体,包括亚烷基、取代亚烷基、亚杂烷基、取代亚杂烷基、亚芳基、取代亚芳基、杂亚芳基和取代亚杂芳基。在一些实施方案中,所述连接体是C

在一些实施方案中,所述连接体水解稳定。水解稳定的链接是指所述链接在水中基本上稳定,并且在适合的pH值下不与水反应,包括但不限于在生理条件下一段时间内,甚至可能无限期。在一些实施方案中,所述连接体是水解不稳定的。水解不稳定或可降解的链接是指所述链接可在水或水溶液包括例如血液中发生降解。酶促不稳定或可降解的链接是指所述链接可被一种或多种酶降解。

如本领域所理解的,PEG和相关聚合物可包括在聚合物骨架和一个或多个聚合物分子中末端官能团之间连接体基团或聚合物骨架中的可降解链接。例如,通过PEG羧酸或活化PEG羧酸与生物活性剂上的醇基发生反应而形成酯键,所述酯键通常在生理条件下水解释放试剂。

其他水解链接包括但不限于碳酸酯链接,通过胺和醛的反应产生的亚胺链接;通过醇与磷酸基团反应形成的磷酸酯链接;通过酰肼和醛反应产生的腙链接;通过醛和醇反应生成的缩醛链接;通过甲酸酯和醇反应产生的原酸酯链接;由胺基形成的肽链接,包括但不限于,聚合物如PEG的末端,肽的羧基;由亚磷酰胺基团形成的寡核苷酸链接,包括但不限于,聚合物末端和寡核苷酸的5'羟基。

许多不同切割连接体是本领域技术人员公知的。参见美国专利号4,618,492、4,542,225和 4,625,014。这些连接体基团释放试剂的机制包括,例如,对光不稳定键进行照射和酸催化水解。例如,美国专利号4,671,958包括对包含连接体的免疫偶联物的描述,所述连接体通过患者补体系统蛋白水解酶,在体内靶位点进行切割。所述连接体的长度可依据多肽和与其相连分子之间适合空间关系,进行预先设定或选择。鉴于多种放射性诊断化合物、放射性治疗化合物、药物、毒素和其他试剂与多肽链接的大量方法公开,本领域技术人员将能确定给定药剂与多肽进行连接的合适方法。

所述连接体可具有宽范围的分子量或分子长度。较大或较小分子量的连接体可在多肽和连接实体之间提供合理的空间关系或构象。具有更长或更短分子长度的连接体也可用于在多肽和连接的实体之间提供合理的空间或弹性。类似地,在多肽到达其靶标之前或之后,具有特定形状或构象的连接体可赋予多肽或连接个体特定的形状或构象。在所需条件下,选用连接体每端存在的官能团,对多肽或有效负载释放进行调节。所述多肽和连接个体间的空间关系优化可以为分子提供新的、调节的或所需的性质。

在一些实施方案中,本发明提供具有哑铃结构的水溶性双功能连接体,所述哑铃结构包括: a)在聚合物骨架至少第一末端上的叠氮化物、炔烃、肼、酰肼、羟胺或含羰基的部分;b)在聚合物骨架的第二末端上的至少第二官能团。所述第二官能团可以与第一官能团相同或不同。在一些实施方案中,所述第二官能团不与第一官能团反应。在一些实施方案中,提供了包含一个支链分子结构至少一个臂的水溶性化合物。例如,所述支链分子结构可以是树枝状结构。

在一些实施方案中,所述连接体是由选自以下成员组成的组的连接体前体衍生而得:N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、 N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺酸丁酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯 (SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、 N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(硫代-SMCC)或2,5-二氧代吡咯烷酮-1-基 17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧-4,7,10,13-四氮杂十八烷-1-酸(CX1-1)。在具体实施方案中,所述连接体是由连接体前体N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯 (SMCC)衍生得到。

在一些实施方案中,所述连接体是选自由二肽、三肽、四肽和五肽组成的组的连接体前体衍生得到。在这个实施方案中,所述连接体可被蛋白酶切割。示例性的二肽包括但不限于,缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)、苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)、苯丙氨酸 -同源赖氨酸(phe-homolys)、和N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。示例性的三肽包括但不限于,甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。

在一些实施方案中,连接体包含间隔体。在一些实施方案中,所述间隔体包含对氨基苄基。在一些实施方案中,对氨基苄醇通过酰胺键与氨基酸单元进行连接,在苯甲醇和有效负载之间制得氨基甲酸酯、甲基氨基甲酸酯或碳酸酯(Hamann et al.(2005)ExpertOpin.Ther.Patents(2005) 15:1087-1103)。在一些实施方案中,所述连接体包含对氨基苄氧基羰基(PAB)。其他间隔体示例包括但不限于,与PAB基团电子方式相似的芳族化合物,例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(美国专利号7,375,078;Hay et al.(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)和邻氨基苯甲酸乙酯或对氨基苯甲酸乙酯。在一些实施方案中,间隔体在酰胺键水解时可发生环合反应,例如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues et al.(1995)Chemistry Biology 2:223)、适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系统 (Stormet al.(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry,et al.(1990)J.Org. Chem.55:5867)。药物与甘氨酸残基α-碳的链接是适用于偶联的间隔体的另一个示例(Kingsbury et al. (1984)J.Med.Chem.27:1447)。

在一些实施方案中,连接体前体可进行组合形成更大的连接体。例如,在一些实施方案中,连接体包含二肽缬氨酸-瓜氨酸和对氨基苄氧基羰基。这些也被称为val-cit-PAB连接体。

在一些实施方案中,所述有效负载可以与所述连接体连接,本发明中称之为连接体-有效负载,具有一个或多个能够与抗体氨基酸基团反应的连接体基团。所述一个或多个连接体可以是本领域技术人员显而易见的任何连接体或本发明所述的任何连接体。

5.抗体特异性

所述偶联物包含选择性结合人CD74的抗体。在一些方面,所述抗体选择性地结合人CD74 亚型1。在一些方面,所述抗体选择性地结合人CD74亚型2。在一些方面,所述抗体可选择性结合一种以上CD74亚型,例如,人CD741的亚型1和亚型2。在一些方面,所述抗体可以分别选择性地结合一种或多种含有与亚型1和亚型2相同细胞外结构域的CD74亚型,例如p41和p33。

在一些实施方案中,所述抗体结合人CD74的同源物。在一些方面,所述抗体与选自猴类、狗类、猫类、小鼠类、大鼠类、牛类、马类、山羊类或绵羊类物种的人CD74同源物结合。在一些方面,所述同源物是食蟹猴同科动物。

在一些实施方案中,所述抗体具有比其他抗CD74抗体更高的解链温度。在一些方面,所述抗体的Tm2高于其他抗CD74抗体。所述Tm2代表IgG的Fab结构域的解链温度。因此,更高的Tm2 促进所述抗体结合位点的稳定性。这种改进的稳定性可以在储存期间得到更好的抗体稳定性,甚至在生产期间得到更高的产率。

在一些实施方案中,所述抗体包含至少一个CDR序列,所述CDR序列由本发明提供的共有序列所定义。在一些实施方案中,所述抗体包含本发明提供的示例CDR、V

在一些实施方案中,就氨基酸残基的数量而言,所述抗体具有一个或多个具有特定长度的 CDR。在一些方面,所述抗体的Chothia CDR-H1长度为7个残基。在一些实施方案中,所述抗体的 Kabat CDR-H1长度为5个残基。在一些方面,所述抗体的Chothia CDR-H2长度为6个残基。在一些实施方案中,所述抗体的Kabat CDR-H2长度为17个残基。在一些方面,所述抗体的Chothia/Kabat CDR-H3长度为11个残基。在一些方面,所述抗体的Chothia/Kabat CDR-H3长度为12个残基。在一些方面,所述抗体的Chothia/Kabat CDR-H3长度为13个残基。在一些方面,所述抗体的Chothia/Kabat CDR-H3的长度为14个残基。在一些方面,所述抗体的Chothia/Kabat CDR-H3长度为15个残基。在一些方面,所述抗体的Chothia/Kabat CDR-H3的长度超过十五个残基。在一些方面,所述抗体的 Chothia/Kabat CDR-H3的长度长达二十五个残基。

在一些方面,所述抗体的Kabat/Chothia CDR-L1的长度为11个残基。在一些方面,所述抗体的Kabat/Chothia CDR-L1长度为12个残基。在一些方面,所述抗体的Kabat/Chothia CDR-L2长度为7个残基。在一些方面,所述抗体的Kabat/Chothia CDR-L3长度为9个残基。

在一些实施方案中,所述抗体包含轻链。在一些方面,所述轻链选自κ轻链和λ轻链。

在一些实施方案中,所述抗体包含重链。在一些方面,所述重链选自IgA、IgD、IgE、IgG 和IgM。在一些方面,所述重链选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。

在一些实施方案中,所述抗体为抗体片段。在一些方面,所述抗体片段选自Fv片段、Fab 片段、F(ab')

在一些实施方案中,所述抗体为单克隆抗体。

在一些实施方案中,所述抗体为嵌合抗体、人源化的抗体或人源的抗体。

在一些实施方案中,所述抗体为亲和力成熟的抗体。在一些方面,所述抗体是由本发明中提供的示例序列衍生而得到的亲和力成熟抗体。

在一些实施方案中,所述抗体在结合后被细胞内化。

在一些实施方案中,所述抗体抑制CD74与其配体结合。在一些方面,所述抗体抑制CD74 与巨噬细胞移动抑制因子(MIF)结合。

在一些实施方案中,所述抗体为WO2016/014434A2中所述的抗体,其通过引用整体并入本发明。

5.1.CDR-H3序列

在一些实施方案中,所述抗体包含CDR-H3序列,其包含、由或基本上由选自SEQ IDNO: 129-160的序列组成。

在一些方面,所述CDR-H3序列不包含、或由或基本上由选自SEQ ID NO:157-160的序列组成。在一些方面,所述CDR-H3序列不包含、或由或基本上由SEQ ID NO:157组成。在一些方面,所述CDR-H3序列不包含、或由或基本上由SEQ ID NO:158组成。在一些方面,所述CDR-H3 序列不包含、或由或基本上由SEQ ID NO:159组成。在一些方面,所述CDR-H3序列不包含、或由或基本上由SEQ ID NO:160组成。

5.2.包含示例性CDR的V

在一些实施方案中,所述抗体包含V

5.2.1包含示例性Kabat CDR的V

在一些实施方案中,所述抗体包含含有一个或多个Kabat CDR-H序列的V

5.2.1.1 Kabat CDR-H3

在一些实施方案中,所述抗体包含含有Kabat CDR-H3序列的V

5.2.1.2 Kabat CDR-H2

在一些实施方案中,所述抗体包含含有Kabat CDR-H2序列的V

5.2.1.3 Kabat CDR-H1

在一些实施方案中,所述抗体包含含有Kabat CDR-H1序列的V

5.2.1.4 Kabat CDR-H3+Kabat CDR-H2

在一些实施方案中,所述抗体包含含有Kabat CDR-H3序列和Kabat CDR-H2序列的V

5.2.1.5 Kabat CDR-H3+Kabat CDR-H1

在一些实施方案中,所述抗体包含含有Kabat CDR-H3序列和Kabat CDR-H1序列的V

5.2.1.6 Kabat CDR-H1+Kabat CDR-H2

在一些实施方案中,所述抗体包含含有Kabat CDR-H1序列和Kabat CDR-H2序列的V

5.2.1.7 Kabat CDR-H1+Kabat CDR-H2+Kabat CDR-H3

在一些实施方案中,所述抗体包含含Kabat CDR-H1序列、Kabat CDR-H2序列和Kabat CDR-H3序列的V

5.2.1.8排除包含Kabat CDR的V

在一些实施方案中,本发明提供的V

在一些方面,所述Kabat CDR-H3序列不包含、不由或基本上不由选自SEQ ID NO:157-160 的序列组成。在一些方面,所述Kabat CDR-H3序列不包含、不由或基本上不由选自SEQ ID NO:157 的序列组成。在一些方面,所述Kabat CDR-H3序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:158的序列组成。在一些方面,所述Kabat CDR-H3序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:159的序列组成。在一些方面,所述Kabat CDR-H3序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:160的序列组成。

在一些方面,所述Kabat CDR-H2序列不包含、不由或基本上不由选自SEQ ID NO:125-128 的序列组成。在一些方面,所述Kabat CDR-H2序列不包含、不由或基本上不由SEQID NO:125组成。在一些方面,所述Kabat CDR-H2序列不包含、不由或基本上不由SEQ IDNO:126组成。在一些方面,Kabat CDR-H2序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:127组成。在一些方面,所述Kabat CDR-H2序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:128组成。

在一些方面,所述Kabat CDR-H1序列不包含、不由或基本上不由选自SEQ ID NO:61-64 的序列组成。在一些方面,所述Kabat CDR-H1序列不包含、不由或基本上不由SEQ IDNO:61组成。在一些方面,所述Kabat CDR-H1序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:62组成。在一些方面,所述Kabat CDR-H1序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:63组成。在一些方面,所述 Kabat CDR-H1序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:64组成。

5.2.2包含示例性Chothia CDR的V

在一些实施方案中,所述抗体包含含有一个或多个Chothia CDR-H序列的V

5.2.2.1 Chothia CDR-H3

在一些实施方案中,所述抗体包含含有Chothia CDR-H3序列的V

5.2.2.2 Chothia CDR-H2

在一些实施方案中,所述抗体包含含有Chothia CDR-H2序列的V

5.2.2.3 Chothia CDR-H1

在一些实施方案中,所述抗体包含含有Chothia CDR-H1序列的V

5.2.2.4 Chothia CDR-H3+Chothia CDR-H2

在一些实施方案中,所述抗体包含Chothia CDR-H3序列和Chothia CDR-H2的V

5.2.2.5 Chothia CDR-H3+Chothia CDR-H1

在一些实施方案中,所述抗体包含含有Chothia CDR-H3序列和Chothia CDR-H1的V

5.2.2.6 Chothia CDR-H1+Chothia CDR-H2

在一些实施方案中,所述抗体包含含有Chothia CDR-H1序列和Chothia CDR-H2的序列的 V

5.2.2.7 Chothia CDR-H1+Chothia CDR-H2+Chothia CDR-H3

在一些实施方案中,所述抗体包含含有Chothia CDR-H1序列、Chothia CDR-H2序列和 Chothia CDR-H1序列的V

5.2.2.8排除包含Chothia CDR的V

在一些实施方案中,本发明提供的所述V

在一些方面,所述Chothia CDR-H3序列不包含、由或基本上由选自SEQ ID NO:157-160的序列组成。在一些方面,所述Chothia CDR-H3序列不包含、不由或基本上不由SEQID NO:157组成。在一些方面,所述Chothia CDR-H3序列不包含、不由或基本上不由SEQ IDNO:158组成。在一些方面,所述Chothia CDR-H3序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:159组成。在一些方面,所述Chothia CDR-H3序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:160组成。

在一些方面,所述Chothia CDR-H2序列不包含、不由或基本上不由选自SEQ IDNO:93-96 的序列组成。在一些方面,所述Chothia CDR-H2序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:93组成。在一些方面,所述Chothia CDR-H2序列不包含、不由或基本上不由SEQID NO:94组成。在一些方面,所述Chothia CDR-H2序列不包含、不由或基本上不由SEQ IDNO:95组成。在一些方面,所述Chothia CDR-H2序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:96组成。

在一些方面,所述Chothia CDR-H1序列不包含、不由或基本上不由选自SEQ IDNO:29-32 的序列组成。在一些方面,所述Chothia CDR-H1序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:29组成。在一些方面,所述Chothia CDR-H1序列不包含、不由或基本上不由SEQID NO:30组成。在一些方面,所述Chothia CDR-H1序列不包含、不由或基本上不由SEQ IDNO:31组成。在一些方面,所述Chothia CDR-H1序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:32组成。

5.3 V

在一些实施方案中,所述抗体包含V

5.3.1排除V

在一些实施方案中,本发明提供的所述V

在一些方面,所述V

5.4 CDR-L3序列

在一些实施方案中,所述抗体包含CDR-L3序列,所述CDR-L3序列包含、由或基本上由选自SEQ ID NO:201-219的序列组成。

在一些方面,所述CDR-L3序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:220组成。

5.5包含示例性CDR的V

在一些实施方案中,所述抗体包含V

5.5.1 CDR-L3

在一些实施方案中,所述抗体包含V

5.5.2 CDR-L2

在一些实施方案中,所述抗体包含V

5.5.3 CDR-L1

在一些实施方案中,所述抗体包含V

5.5.4 CDR-L3+CDR-L2

在一些实施方案中,所述抗体包含含有CDR-L3序列和CDR-L2序列的V

5.5.5 CDR-L3+CDR-L1

在一些实施方案中,所述抗体包含含有CDR-L3序列和CDR-L1序列的V

5.5.6 CDR-L1+CDR-L2

在一些实施方案中,所述抗体包含含有CDR-L1序列和CDR-L2序列的V

5.5.7 CDR-L1+CDR-L2+CDR-L3

在一些实施方案中,所述抗体包含含有CDR-L1序列、CDR-L2序列和CDR-L3序列的V

5.5.8排除包含CDR-L的V

在一些实施方案中,本发明提供的所述V

在一些方面,所述CDR-L3序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:220组成。

在一些方面,所述CDR-L2序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:200组成。

在一些方面,所述CDR-L1序列不包含、不由或基本上不由SEQ ID NO:180组成。

5.6 V

在一些实施方案中,所述抗体包含V

5.6.1排除V

在一些实施方案中,本发明提供的所述V

在一些方面,所述V

5.7配对

5.7.1 CDR-H3–CDR-L3对

在一些实施方案中,所述抗体包含CDR-H3序列和CDR-L3序列。在一些方面,所述CDR-H3序列是V

在一些方面,所述CDR-H3序列包含、由或基本上由SEQ ID NO:129-156组成,以及所述 CDR-L3序列包含、由或基本上由SEQ ID NO:201-219组成。

5.7.1.1排除CDR-H3–CDR-L3对

在一些实施方案中,本发明提供的所述CDR-H3-CDR-L3对不包含一些CDR-H3-CDR-L3 对。

在一些方面,所述CDR-H3序列不是SEQ ID NO:157,以及所述CDRL3序列不是SEQID NO:220。在一些方面,所述CDR-H3序列不是SEQ ID NO:158,以及CDR-L3序列不是SEQ IDNO:220。在一些方面,所述CDR-H3序列不是SEQ ID NO:159,以及CDR-L3序列不是SEQ IDNO:220。在一些方面,所述CDR-H3序列不是SEQ ID NO:160,以及CDR-L3序列不是SEQ IDNO:220。

5.7.2 V

在一些实施方案中,所述抗体包含V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

5.7.2.1排除V

在一些实施方案中,本发明提供的所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

在一些方面,所述V

6.热稳定性

在一些实施方案中,所述抗体的特征在于其特定的热稳定性参数。所述抗体的热稳定性可以通过测量其解链温度来表征。所述解链温度包括Tm1和Tm2。Tm1代表IgG的Fc结构域的熔解,而 Tm2代表IgG的Fab结构域的熔解。

在一些实施方案中,所述抗体的Tm2为至少75℃、75.5℃、76℃、76.5℃、77℃、77.5℃、 78℃、78.5℃或79℃。在一些实施方案中,所述抗体的Tm2介于约75℃和约80℃。在一些实施方案中,所述抗体的Tm2介于约76℃和约79℃。在一些实施方案中,所述抗体的Tm2介于约77℃和约 78℃。在一些方面,上述Tm2用于抗体的非糖基化形式。

在一些实施方案中,所述抗体的Tm1介于约59℃和约62.2℃。在一些实施方案中,所述抗体的Tm1小于62.2℃。在一些实施方案中,所述抗体的Tm1小于61℃。在一些实施方案中,所述抗体的Tm1小于60℃。在一些方面,上述Tm1用于抗体的非糖基化形式。

7.亲和力

在一些实施方案中,如K

在一些实施方案中,所述抗体具有至少约10

在一些实施方案中,所述抗体具有约10

8.糖基化变化

在一些实施方案中,所述抗体可以改变,以增加、降低或消除其糖基化程度。多肽的糖基化通常是“N-连接的”或“O-连接的”。

“N-连接的”糖基化是指碳水化合物基团与天冬酰胺残基的侧链连接。所述三肽序列天冬酰胺 -X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸,是碳水化合物基团与天冬酰胺侧链进行酶促连接的识别序列,其中 X是除脯氨酸外的任何氨基酸。因此,所述多肽中这些三肽序列任一个的存在产生了潜在的糖基化位点。

“O-连接的”糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸进行连接,最常见的是丝氨酸或苏氨酸,但5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸也可以使用。

通过改变氨基酸序列,实现向抗体添加或删除N-连接的糖基化位点,以产生或去除一种或多种上述三肽序列。通过对抗体偶联物中序列或向抗体偶联物中序列的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基进行添加,删除或取代,实现对O-连接的糖基化位点的添加或删除(视情况而定)。

9.Fc变体

在一些实施方案中,可以将氨基酸修饰引入本发明提供所述抗体的Fc区,以产生Fc区变体。在一些实施方案中,所述Fc区变体具有一些但不是全部的效应功能。例如,此类抗体在应用中是有用的,在应用中体内所述抗体的半衰期很重要,但某些效应功能是不必要的或有害的。效应功能的示例包括补体依赖性的细胞毒性(CDC)和抗体偶联物导向补体介导的细胞毒性(ADCC)。许多具有改变效应功能的取代或替代或缺失在本领域是公知的。

通过使用体外和/或体内检测,可对CDC和/或ADCC活性改变进行确认。例如,实施Fc受体(FcR)分析,以测量FcγR结合。对ADCC、NK细胞进行调节的所述原代细胞,仅表达FcγRIII,而单核细胞可对FcγRI、FcγRII和FcγRIII进行表达。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch and Kinet, Ann.Rev.Immunol.,1991,9:457-492。

关于目标分子的ADCC活性评估的体外测定非限制性实例在美国专利号5,500,362和 5,821,337;Hellstrom et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1986,83:7059-7063;Hellstrom et al.,Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.,1985,82:1499-1502和Bruggemann etal.,J.Exp.Med.,1987,166:1351-1361中均有描述。此类测定的适用效应细胞,包括外周血液单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。此外,目标分子的ADCC活性可利用动物模型进行评估,例如Clynes et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1998, 95:652-656中的描述。

C1q结合分析也可用于确认抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。C1q结合分析的实施例包括WO 2006/029879和WO 2005/100402中所述。

补体激活测定包括如下,例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods,1996,202:163-171; Cragg et al.,Blood,2003,101:1045-1052和Cragg and Glennie,Blood,2004,103:2738-2743中的描述。

FcRn结合和体内清除(半衰期测定)也可使用如下所述方法进行测量,例如,Petkova et al., Intl.Immunol.,2006,18:1759-1769。

10.修饰氨基酸

当所述抗体偶联物包含修饰氨基酸时,所述修饰氨基酸可以是实际工作人员视为合适的任何修饰氨基酸。在特定的实施方案中,所述修饰的氨基酸包含可用于与连接体前体或有效负载前体形成共价键的活性基团。在一些实施方案中,所述修饰氨基酸是非天然氨基酸。在一些实施方案中,所述活性基团选自氨基,羧基,乙酰基,肼基(hydrazino),酰肼基(hydrazido),氨基脲基,硫烷基,叠氮基和炔基组成的组。例如,修饰氨基酸也公开于WO2013/185115和WO2015/006555中,其各自通过引用整体并入本发明。

在某些实施方案中,所述氨基酸残基如下式中的任一个结构式:

本领域技术人员将认识到抗体通常由L-氨基酸构成。然而,对于非天然氨基酸,本发明所述方法和组合物为实际工作者提供在位点特异性位置上使用L-、D-或外消旋非天然氨基酸的能力。在某些实施方案中,本发明所述的非天然氨基酸包括天然氨基酸的D-异构体和天然氨基酸的外消旋异构体。

在上式中,波浪线表示与抗体的多肽链的其余部分相连接的键。这些非天然氨基酸可以掺入多肽链中,正如天然氨基酸被掺入相同的多肽链中一样。在一些实施方案中,如式中所示,非天然氨基酸通过酰胺键并入多肽链中。

在上式中,只要所述氨基酸残基与天然氨基酸残基不相同,R指任何官能团没有限制。在一些实施方案中,R可以是疏水基团、亲水基团、极性基团、酸性基团、碱性基团、螯合基团、活性基团、治疗部分或标记部分。在一些实施方案中,R选自由R

在一些实施方案中,所述非天然编码的氨基酸包括侧链官能团,所述侧链官能团与20种常见氨基酸中未发现的官能团(包括但不限于叠氮基,酮,醛和氨氧基团)发生有效而选择性地反应,形成稳定的偶联物。例如,抗原结合的多肽包含含有叠氮基官能团的非天然编码氨基酸,所述抗原结合的多肽可以与聚合物(包括但不限于聚(乙二醇))或者含有炔基部分的第二多肽发生反应,形成稳定的偶联物,所述偶联物引发叠氮化物和炔烃官能团的选择性反应,形成Huisgen[3+2]环加成产物。

适用于本发明并可与水溶性聚合物发生反应的示例性非天然编码氨基酸,包括但不限于带有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮化物和炔烃活性基团。在一些实施方案中,非天然编码氨基酸包含糖类部分。这种氨基酸的实例,包括N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-丝氨酸,N-乙酰基-L-半乳糖胺基 -L-丝氨酸,N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨酸,N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L- 丝氨酸。此类氨基酸的实例,还包括其中氨基酸和糖类化合物之间天然存在的N-或O-链接被在自然界中不常见的共价键所取代,所述自然界中不常见的共价键包括但不限于烯烃,肟,硫醚,酰胺等。此类氨基酸的实例还包括在天然存在的蛋白质中不常见的糖类,例如2-脱氧-葡萄糖,2-脱氧半乳糖等。

本发明提供的许多非天然编码氨基酸可商业购买获得,例如,购自Sigma-Aldrich(St.Louis, Mo.,USA)、Novabiochem(a division of EMD Biosciences,Darmstadt,Germany)、或Peptech(Burlington, Mass.,USA)。那些商业购买不能得到的非天然编码氨基酸,可视情况按照本发明所述进行合成或使用本领域技术人员公知的标准方法进行合成。对于有机合成技术,参见例如Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon,(1982,Second Edition,Willard Grant Press,Boston Mass.);Advanced OrganicChemistry by March(Third Edition,1985,Wiley and Sons,New York);和AdvancedOrganic Chemistry by Carey and Sundberg(Third Edition,Parts A and B,1990,Plenum Press,New York)。也可参考美国专利申请2003/0082575和2003/0108885,其通过引用并入本发明。

许多非天然氨基酸以天然氨基酸为基础,适用于本发明,例如,所述天然氨基酸可以为酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等。酪氨酸类似物包括但不限于对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸和间位取代的酪氨酸,其中所述取代的酪氨酸包含,包括但不限于酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C

适合本发明所用许多非天然氨基酸可商业购买获得,例如购自Sigma(USA)或Aldrich (Milwaukee,Wis.,USA)。那些商业购买不能得到的非天然编码氨基酸,可视情况按照本发明所述进行合成或使用本领域技术人员公知的标准方法进行合成。对于有机合成技术,参见例如Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon,(1982,SecondEdition,Willard Grant Press,Boston Mass.);Advanced Organic Chemistry by March(Third Edition,1985,Wiley and Sons,New York);和Advanced Organic Chemistry byCarey and Sundberg(Third Edition,Parts A and B,1990,Plenum Press,New York)。有关非天然氨基酸合成的其他出版物包括,例如题为“In vivo incorporation ofUnnatural Amino Acids”的专利WO 2002/085923;Matsoukas et al.,(1995)J.Med.Chem.,38,4660-4669;King,F.E.&Kidd,D.A.A.(1949) A New Synthesis ofGlutamine and ofγ-Dipeptides of Glutamic Acid from PhthylatedIntermediates.J. Chem.Soc.,3315-3319;Friedman,O.M.&Chatterrji,R.(1959)Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-TumorAgents.J.Am.Chem.Soc.81,3750-3752;Craig,J.C.et al.(1988) AbsoluteConfiguration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine).J.Org.Chem.53,1167-1170;Azoulay,M.,Vilmont,M.&Frappier,F.(1991)Glutamine analogues as Potential Antimalarials,Eur.J.Med.Chem.26,201-5;Koskinen,A.M.P.&Rapoport,H. (1989)Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino AcidAnalogues.J.Org. Chem.54,1859-1866;Christie,B.D.&Rapoport,H.(1985)Synthesisof Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine.Application to the TotalSynthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and IminiumIon Cyclization.J.Org.Chem.1989:1859-1866;Barton et al.,(1987) Synthesis ofNovel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry:Synthesis of L-and D-a-Amino-Adipic Acids,L-a-aminopimelic Acid and Appropriate UnsaturatedDerivatives.Tetrahedron Lett.43:4297-4308;和Subasinghe et al.,(1992)Quisqualic acid analogues:synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoicacid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitizedsite.J.Med.Chem. 35:4602-7。也可参见2003年12月22日提交的主题为“Protein Arrays”的专利申请号10/744,899和2002 年12月22日提交的专利申请号60/435,821。

适用的非天然氨基酸的特定实施例,包括但不限于,p-乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-N- 乙酰氨基葡萄糖β-丝氨酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、p-叠氮基-L-苯丙氨酸、p-酰基-L-苯丙氨酸、p-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酸丝氨酸、膦酸酪氨酸、p- 碘苯丙氨酸、p-溴苯丙氨酸、p-氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、和p-丙炔基氧基-苯丙氨酸。进一步适用的实施例包括N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。

在特定实施方案中,所述非天然氨基酸选自p-乙酰基-苯丙氨酸、p-乙炔基-苯丙氨酸、p-丙炔氧基苯丙氨酸和p-叠氮基-苯丙氨酸。一种特别有用的非天然氨基酸是p-叠氮基苯丙氨酸。如本领域技术人员所公知的,所述氨基酸残基可促进Huisgen[3+2]环加成反应(所谓的“点击”化学反应),例如带炔基的化合物。所述反应使得本领域技术人员,能够在非天然氨基酸的位点特异性位置快捷地与所述抗体进行偶联。

在某些实施方案中,所述第一活性基团是炔基基团部分(包括但不限于,非天然氨基酸中p- 丙炔基氧基苯丙氨酸,其中丙炔基有时也称为乙炔基团),以及所述第二活性基团是叠氮基基团部分,且可使用[3+2]环加成化学环。在一些实施方案中,所述第一活性基团是叠氮基部分(包括但不限于非天然氨基酸p-叠氮基-L-苯丙氨酸),所述第二活性基团是炔基基团部分。

在上式中,每个L代表一个二价连接体。所述二价连接体可以是本领域技术人员公知的任何二价连接体。通常,所述二价连接体能够与功能基团部分R以及非天然氨基酸的α碳形成共价键。适用的二价连接体包括键、亚烷基、取代的亚烷基、亚杂烷基、取代的亚杂烷基、亚芳基、取代的亚芳基、亚杂芳基和取代的亚杂芳基。在一些实施方案中,L是C

本发明所述方法和组合物中所用的非天然氨基酸,具有如下四种性质中的至少一种:(1) 所述非天然氨基酸侧链上的至少一个官能团,具有至少一个正交于20种常见的遗传编码氨基酸(即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)的特征,和/或活性,和或反应特性,或至少正交于包含非天然氨基酸多肽中天然存在氨基酸的化学反应性;(2) 所述引入的非天然氨基酸对20种常见的遗传编码氨基酸基本上是化学惰性的;(3)所述非天然氨基酸可以稳定地掺入多肽中,优选地,所述多肽具有与天然存在的氨基酸相等的稳定性,或在典型的生理条件下具有相等的稳定性,进一步优选地,这种掺入可以在体内系统进行;(4)所述非天然氨基酸包括肟官能团或通过与试剂反应转化成肟基的官能团,优选地在不破坏包含非天然氨基酸多肽生物学特性的条件下(当然,除非破坏这种生物学特性的目的是改性/转化),或者转化可在pH值介于约 4和约8间的水性条件下发生,或者其中非天然氨基酸的反应位点是亲电子位点。许多非天然氨基酸均可引入多肽。非天然氨基酸还包括保护的或掩蔽的肟,或保护的或掩蔽的基团,其可在保护基团脱保护或掩蔽基团的脱掩蔽后转化为肟基团。非天然氨基酸还可包括保护的或掩蔽的羰基或二羰基,其可在保护基团脱保护或掩蔽基团的脱掩蔽后转化为羰基或二羰基,从而可与羟胺或肟反应形成肟基团。

在进一步的实施方案中,用于本发明所述方法和组合物中的非天然氨基酸包括但不限于,包含光激活交联剂的氨基酸、自旋标记氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属氨基酸、放射性氨基酸、具有新官能团的氨基酸、与其他分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光固化和/或光致异构化氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸例如糖取代的丝氨酸、其他碳水化合物修饰的氨基酸、含酮基氨基酸、含醛基氨基酸、包含聚乙二醇或其他聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学切割和/或光切割氨基酸、与天然氨基酸相比具有细长侧链的氨基酸,包括但不限于聚醚类或长链烃类,包括但不限于,约5个碳以上或约10个碳以上碳连接的含糖氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基酸的氨基硫酸、和包含一个或多个毒性基团的氨基酸。

在一些实施方案中,非天然氨基酸包含糖类基团部分。这种氨基酸的示例包括N-乙酰基-L- 葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基 -L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。此类氨基酸的示例还包括其中氨基酸和糖类化合物之间的天然存在的N-或O-键,被在自然界中不常见的共价键取代,包括但不限于烯烃、肟、硫醚、酰胺等。此类氨基酸的示例还包括在天然存在的蛋白质中不常见的糖类化合物,例如2-脱氧-葡萄糖、 2-脱氧半乳糖等。

在特定实施方案中,所述非天然氨基酸选自以下结构式组成的组:

或其盐。这种非天然氨基酸可以是盐的形式,或者可以掺入非天然氨基酸多肽,聚合物,多糖或多核苷酸中,并任选地翻译修饰。

在一些实施方案中,所述修饰氨基酸为式51-60中的任一个:

或其盐。

在一些实施方案中,所述非天然氨基酸选自由如上所述化合物30、53、56、59和60组成的组。在一些实施方案中,所述非天然氨基酸为化合物30。在一些实施方案中,所述非天然氨基酸为化合物56。

11.抗体偶联物的制备

11.1抗原的制备

用于生产抗体的所述CD74抗原可以是完整的CD74或CD74的片段。用于生产抗体的CD74 的其他形式对于本领域技术人员而言是显而易见的。

11.2单克隆抗体

例如,单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制得,所述方法首次披露于Kohleret al.,Nature,1975, 256:495-497,和/或通过重组DNA方法制得(参见例如美国专利4,816,567)。例如,单克隆抗体也可以利用噬菌体或酵母基库获得。参见如美国专利号8,258,082和8,691,730。

在杂交瘤方法中,对小鼠或其它合适的宿主动物免疫后抽取其淋巴细胞,所述淋巴细胞生产或能生产用于免疫蛋白质进行特异性结合的抗体。或者,淋巴细胞可以在体外免疫。然后,通过使用合适的融合剂(例如聚乙二醇),将淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合,生成杂交瘤细胞。参见Goding J.W.,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice3

将杂交瘤细胞接种在合适的培养基上并进行培育,所述培养基含有一种或多种抑制未融合亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如,如果所述亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT),则杂交瘤培养基通常包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基),其中所述物质可防止HGPRT缺乏性细胞的生长。

适用的骨髓瘤细胞是那些通过选择性产生抗体细胞而进行有效融合,并支持抗体稳定高水平制备的细胞,所述细胞对媒介条件敏感,例如存在或不存在HAT培养基。其中,优选的骨髓瘤细胞系为鼠科动物骨髓瘤细胞系,例如那些从MOP-21和MC-11小鼠肿瘤的细胞系(可从Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,CA获得),以及SP-2或X63-Ag8-653细胞(可从American Type Culture Collection,Rockville,MD获得)中衍生得到的细胞。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于制备人单克隆抗体也有相关报道,参见如Kozbor,J.Immunol.,1984,133:3001。

在鉴定产生具有所需特异性、亲和力、和/或生物活性抗体的杂交瘤细胞后,可通过有限稀释程序进行亚克隆,以及通过标准方法进行培养,得到选择性克隆。参见Goding,supra。用于此目的的合适培养基包括,例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外,所述杂交瘤细胞可以在动物体内以腹水肿瘤的形式进行培育。

编码所述单克隆抗体的DNA,可使用常规方法容易地进行分离和测序(例如,通过使用能与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因进行特异性结合的寡核苷酸探针)。因此,所述杂交瘤细胞可以作为具有所需特性DNA编码抗体的的有用来源。一旦分离,可将所述DNA置于表达载体中,然后将其转染到宿主细胞中,比如细菌(例如大肠杆菌)、酵母(例如酵母属或毕赤酵母属)、COS细胞,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其他不产生抗体的骨髓瘤细胞,以生成所述单克隆抗体。

11.3人源化抗体

人源化抗体可通过利用相应的人抗体序列,替换单克隆抗体的大部分或全部结构而制得。从而制得杂合分子,其中仅抗原特异性变异体,或CDR,是由非人序列组成。获得人源化抗体的方法包括如下所述,例如Winter and Milstein,Nature,1991,349:293-299;Rader et al.,Proc.Nat.Acad.Sci. U.S.A.,1998,95:8910-8915;Steinberger et al.,J.Biol.Chem.,2000,275:36073-36078;Queen et al.,Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1989,86:10029-10033;和U.S.专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762、以及 6,180,370。

11.4人源抗体

人源抗体可通过本领域公知的多种技术制得,例如使用转基因动物(例如人源化小鼠)。参见如Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1993,90:2551;Jakobovits et al.,Nature,1993, 362:255-258;Bruggermann et al.,Year inImmuno.,1993,7:33;和美国专利号5,591,669、5,589,369和 5,545,807。人源抗体也可由噬菌体展示库衍生得到(参见如Hoogenboom et al.,J.Mol.Biol.,1991, 227:381-388;Marks et al.,J.Mol.Biol.,1991,222:581-597;以及美国专利号5,565,332和5,573,905)。人源抗体也可以通过体外活化的B细胞产生(参见例如美国专利号5,567,610和5,229,275)。人抗体也可由酵母库衍生而得(参见如美国专利号8,691,730)。

11.5偶联

所述抗体偶联物可用标准技术制得。在一些实施方案中,在适当条件下,抗体与有效负载接触,形成从抗体到有效负载的键,以制得抗体-有效负载偶联物。在一些实施方案中,在适当条件下,抗体与连接体前体接触,形成从抗体到连接体的键。所得到的抗体-连接体在适当条件下,与有效负载前体接触,形成抗体-连接体与有效负载间的键,制得抗体-连接体-有效负载偶联物。在一些实施方案中,在适当条件下,有效负载前体与连接体前体接触,形成有效负载与连接体间的键。在适当条件下,所得有效负载-连接体与抗体接触,生成有效负载-连接体与抗体间的键,制得抗体-连接体-有效负载偶联物。示例性条件描述于如下实施例中。

12.载体,宿主细胞和重组方法

本发明还提供了编码抗CD74抗体偶联物、载体的分离核酸和包含所述核酸的宿主细胞,以及用于生产所述抗体的重组技术。

为了所述抗体的重组生产,可将编码抗体的所述核酸进行分离,并将其插入可复制的载体中,以进一步克隆(即DNA扩增)或表达。在一些方面,所述核酸可以通过同源重组产生,例如美国专利号5,204,244中所述。

许多不同载体是本领域中公知的。所述载体组分通常包括但不限于,以下一种或多种:信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列,如美国专利号5,534,615 中所述。

合适的宿主细胞的示例性实施例如下所述,但不意味着对这些宿主细胞进行限制。

合适的宿主细胞包括任何原核细胞(例如细菌),低等真核细胞(例如酵母)或高等真核(例如哺乳动物)细胞。合适的原核生物包括真细菌,比如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物,例如肠杆菌科,例如埃希氏菌属(大肠杆菌),肠杆菌属,欧文氏菌属,克雷伯氏菌属,变形杆菌属,沙门氏菌属(鼠伤寒沙门氏菌),沙雷氏菌属(粘虫),志贺氏菌属,芽孢杆菌纲(枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌),假单胞菌属(铜绿假单胞菌)和链霉菌属。一种有用的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294,但其他菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776和大肠杆菌W3110也适用。

除原核生物外,真核微生物如丝状真菌或酵母,也是抗CD74抗体编码载体克隆或表达的合适宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母,是常用的低等真核宿主微生物。然而,许多其他属、种和菌株是可获得和有用的,例如,裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe),克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(乳酸克鲁维酵母(K.1actis)、脆弱克鲁维酵母(K.fragilis)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)、瓦提克鲁维酵母(K.waltii)、果蝇克鲁维酵母菌(K.drosophilarum)、耐热克鲁维酵母(K.thermotoIerans)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)),耶氏酵母属(yarrowia),毕赤酵母(Pichiapastoris),假丝酵母属(Candida),里氏木霉(Trichodermareesia),粗糖脉抱菌(Neurospora crassa),许旺酵母属(Schwanniomyces),西方许旺酵母(S.occidentalis)和丝状真菌,例如青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium 和曲霉属(沟巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger))。

适用的哺乳动物类宿主细胞包括COS-7细胞、HEK293细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)、小鼠支持细胞、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)等。

用于生产本发明所述抗CD74抗体的所述宿主细胞可以在多种培养基中培养。可商业购买的培养基,例如Ham's F10、最小单元培养基(MEM)、RPMI-1640和达尔伯克改良伊格尔培养基 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium,DMEM)适合于培养宿主细胞。此外,任何适用的培养基如 Ham et al.,Meth.Enz.,1979,58:44;Barnes et al.,Anal.Biochem.,1980,102:255;和U.S.专利号 4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655和5,122,469、或WO 90/03430和WO 87/00195所述。

任何此类培养基可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)、以及葡萄糖或等效能源。任何其他必需的补充剂也可以以本领域技术人员公知的适当浓度进行补充。

所述培养条件,譬如温度、pH等,是那些先前用于选择表达的宿主细胞参数,这对于普通技术人员是显而易见的。

当使用重组技术时,所述抗体可以在细胞内、周质空间中产生,或直接分泌到培养基中。如果所述抗体在细胞内产生,首先要去除微粒碎片、宿主细胞或裂解片段,例如通过离心或超滤方法去除。例如,Carteret al.(Bio/Technology,1992,10:163-167)公开了分泌到大肠杆菌周质空间抗体的分离方法。简而言之,细胞糊在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯基甲基磺酰氟(PMSF)中解冻约30分钟,通过离心除去细胞碎片。

在一些实施方案中,所述抗体在无细胞系统中制得。在一些方面,所述无细胞系统是一个体外转录和翻译系统,如Yin et al.,mAbs,2012,4:217-225所述,其全部内容通过引用并入本发明。在一些方面,所述无细胞系统利用来自真核细胞或来自原核细胞的无细胞提取物。在一些方面,所述原核细胞是大肠杆菌。所述抗体的无细胞表达可能是有用的,例如,其中抗体作为不溶性聚集体在细胞中累积,或者来自周质表达的产率低。

在所述抗体分泌到培养基的地方,通常首先使用市售蛋白质浓缩滤器,例如

由细胞制备的所述抗体组合物,可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析进行纯化,亲和层析是特别有用的纯化技术。所述蛋白A作为亲和配体的适用性,取决于抗体中任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化以人γ1、γ2、或γ4重链为基础的抗体(Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.,1983,62:1-13)。蛋白G适用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.,EMBOJ., 1986,5:1567-1575)。

亲和配体连接的所述基质通常为琼脂糖,但也适用于其他基质。机械稳定的基质,例如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯,可以实现比之于琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。所述抗体包含C

用于蛋白质纯化的其他技术,例如离子交换柱分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱法、肝素琼脂糖凝胶色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE,以及硫酸铵沉淀法也可使用,且可能为本领域技术人员所使用。

在任何初步纯化步骤之后,可用pH介于2.5-4.5的洗脱缓冲液,对包含目标抗体和污染物的所述混合物,进行低pH疏水层析,通常在低盐浓度下进行(例如,从约0-0.25M盐)。

13.药物组合物和给药方法

本发明所述抗体偶联物,可以使用本领域可获得的方法和本发明所述方法,配制成药物组合物。任何本发明提供的所述抗体偶联物,都可用于合适的药物组合物中,并通过合适的给药途径进行施用。

本发明所提供的方法,包括药物组合物的施用,所述药物组合物包含至少一种本发明提供的抗体,以及一种或多种相容的和药学上可接受的载体。在本发明中,术语“药学上可接受的”是指由联邦管理机构或州政府批准,或美国药典或其他公认的药典中列明可用于动物,更特别是人类。术语“载体”包括稀释剂、佐剂(例如,弗氏佐剂(完全和不完全))、辅料或与治疗剂一起施用的媒介物。此类药物载体可以是无菌液体,例如水和油,包括石油、动物、植物或合成来源的那些载体,例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用所述药物组合物时,水可用作载体。盐水溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体,特别是用于注射溶液。适用的药物载体的示例可见Martin, E.W.,Remington’sPharmaceutical Sciences。

在临床实践中,本发明提供的所述药物组合物或抗体偶联物可以通过本领域公知的任何途径进行施用。在一些实施方案中,本发明提供的药物组合物或抗体可进行肠胃外给药。

用于肠胃外给药的所述组合物可以是乳液或无菌溶液。肠胃外组合物可包括,例如丙二醇、聚乙二醇、植物油和注射用有机酯(例如油酸乙酯)。此类组合物也包含有润湿剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。灭菌可以以几种方式进行,例如使用细菌过滤器过滤,通过辐射或通过加热灭菌。肠胃外组合物也可以使用无菌固体组合物的形式进行制备,使用时所述无菌固体组合物可以溶解于无菌水或任何其它可注射的无菌介质中。

在一些实施方案中,本发明提供的组合物是药物组合物或单一组分剂型。本发明提供的药物组合物和单一组分剂型,包含预防或治疗有效量的一种或多种预防性或治疗性抗体偶联物。

典型的药物组合物和剂型包含一种或多种辅料。适用的辅料是药学领域技术人员所公知的,合适辅料的非限制性实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。特定辅料是否适合掺入药物组合物或剂型,取决于本领域熟知的多种因素,包括但不限于受试者施用剂型的方式和特定抗体剂型。如果需要,组合物或单一组分剂型还可含有少量润湿剂、乳化剂或pH缓冲剂。

本发明所提供的不含乳糖组合物可包含本领域熟知的辅料,所述辅料列明于如U.S. Pharmocopia(USP)SP(XXI)/NF(XVI)中。通常,不含乳糖组合物包含活性成分、粘合剂/填充剂和药学上相容的和药学上可接受量的润滑剂。示例性的无乳糖剂型包含活性成分、微晶纤维素、预胶化淀粉和硬脂酸镁。

进一步地,因为水会促进一些抗体偶联物的降解,本发明所述的是无水药物组合物和包含抗体的剂型。

本发明提供的无水药物组合物和剂型可以使用无水或低水分的成分,并在低水分或低湿度条件下制备。在制造、包装和/或储存期间,如果与水分和/或湿气充分接触是按照预期进行的,包含乳糖和至少一种包含伯胺或仲胺的活性成分的药物组合物和剂型可以是无水的。

无水药物组合物的制备和储存,其无水特性应得到维持。相应地,无水组合物可使用公知的材料进行包装,防止暴露于水中,以便其放置于合适的配方试剂盒中。适用的包装实例包括但不限于气密密封箔,塑料,单位剂量容器(例如小瓶),泡罩包装和条带包装。

进一步地,本发明提供了药物组合物和剂型,其包含一种或多种降低抗体分解速率的辅料。此类抗体偶联物,在本发明中称为“稳定剂”,包括但不限于抗氧化剂例如抗坏血酸,pH缓冲剂或盐缓冲剂。

13.1肠胃外剂型

在一些实施方案中,本发明所提供的是肠胃外剂型。肠胃外剂型可通过各种途径施用于受试者,包括但不限于皮下、静脉内(包括推注)、肌肉内和动脉内。因为剂型施用通常绕过受试者对污染物的天然防御,所以肠胃外剂型通常是无菌的或能够在施用于受试者之前进行灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于,用于注射的溶液,待溶解或悬浮在药学上可接受的注射用载体中的干品,用于注射的悬浮液和乳液。

用于提供肠胃外剂型的合适载体是本领域技术人员所公知的。示例包括但不限于:注射用水 USP;含水载体例如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、以及乳酸林格氏注射液;水混溶性载体例如,但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇;非水性载体,例如,但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。

辅料可增加本发明公开的一种或多种抗体偶联物的溶解度,所述辅料也可以掺入肠胃外剂型。

13.2剂量和单位剂量形式

在人诊治中,根据预防性或治愈性治疗以及根据年龄、体重、感染阶段和待治疗受试者的其他特异因素,医生将决定他认为最合适的剂量。

有效预防或治疗病症或其一种或多种症状的所述抗体或组合物的量,将随疾病或病症的性质和严重程度,以及施用抗体的途径而变化。所述频率和剂量也将根据每个受试者的具体因素而变化,所述受试者具体因素取决于所施用的具体疗法(例如,治疗或预防剂),病症的严重程度,疾病或病症,给药途径以及年龄、体质、体重、反应以及受试者的既往病史。有效剂量可根据体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线进行推导而得。

在一些实施方案中,组合物的示例性剂量包括每千克受试者的毫克或微克量的抗体或样品重量(例如,约10μg/kg到约50mg/kg,约100μg/kg到约25mg/kg,或约100μg/kg到约10mg/kg)。在一些实施方案中,本发明提供的所述抗体剂量,基于所述抗体施用以预防、治疗、控制或改善疾病,或一种或多种症状的受试者重量,为0.1mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、 10mg/kg、或15mg/kg或受试者体重以上。在另一个实施方案中,施用以预防,治疗,控制或改善受试者的病症,或其一种或多种症状的本发明提供的组合物或组合物的剂量为0.1mg至200mg,0.1mg 至100mg,0.1mg至50mg,0.1mg至25mg,0.1mg至20mg,0.1mg至15mg,0.1mg至10mg, 0.1mg至7.5mg,0.1mg至5mg,0.1至2.5mg,0.25mg至20mg,0.25mg至15mg,0.25mg至12 mg,0.25mg至10mg,0.25mg至7.5mg,0.25mg至5mg,0.25mg至2.5mg,0.5mg至20mg,0.5 mg至15mg,0.5mg至12mg,0.5mg至10mg,0.5mg至7.5mg,0.5mg至5mg,0.5mg至2.5mg, 1mg至20mg,1mg至15mg,1mg至12mg,1mg至10mg,1mg至7.5mg,1mg至5mg,或1mg 至2.5mg。

所述剂量可以根据合适的时间表进行施用,例如,每周一次、两次、三次或多次。在一些情况下,可能需要在本发明公开的范围外使用抗体的剂量,这对于本领域普通技术人员是显而易见的。此外,应注意,临床医生或治疗医师将结合受试者反应,了解如何以及何时中断,调整或终止治疗。

如本领域普通技术人员所熟知的,不同的治疗有效量可适用于不同的疾病和病症。类似地,本发明提供的抗体偶联物用于预防、控制、治疗或改善此类病症,但不足以引起或减少抗体带来的副作用的量,也包括在本发明所述的剂量和剂量频率方案中。此外,当受试者施用本发明提供的组合物的多种剂量时,所有剂量都不需要相同。例如,增加受试者施用的剂量,以提高组合物的预防或治疗效果,或者降低其的剂量,以减少特定受试者所经历的一种或多种副作用。

在一些实施方案中,可用本发明所提供抗体或组合物的一种或多种负荷剂量,启动治疗或预防,再用一种或多种剂量进行维持。

在一些实施方案中,施用一定剂量本发明提供的抗体或组合物,在受试者的血液或血清中维持稳态浓度的抗体。根据本领域技术人员可获得的技术,通过测量来确定稳态浓度,或者根据受试者的身体特征,例如身高,体重和年龄,来确定稳态浓度。

在一些实施方案中,重复施用相同的组合物,施用可以分开至少1天、2天、3天、5天、10 天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。在其他实施方案中,重复施用相同的预防或治疗剂,施用可以分开至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、 3个月或6个月。

14.治疗应用

关于治疗应用,本发明所述的抗体偶联物,使用如本领域公知的或本发明上述的药学上可接受的剂型,施用于哺乳动物,通常是人。例如,本发明所述的抗体偶联物可以在人静脉内大剂量施用,或在肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘膜内或肿瘤途径内进行一定时期的连续输液。所述抗体偶联物也适合通过瘤周,病灶内或病灶周围途径进行给药,以发挥局部和全身治疗效果。所述腹膜内途径可能特别有用,例如,用于治疗卵巢肿瘤。

本发明提供的所述抗体偶联物可用于治疗有关CD74上调节的任何疾病或病症。在癌症和自身免疫性疾病,已观察到CD74表达的上调节(Borghese et al.,Exp.Op.Ther.Targets,2011,15:237-251,其内容通过引用整体并入本发明)以及感染(Hofman et al.,ModernPathology,2007,20:974-989,其全部内容通过引用并入本发明)和炎性病症(Vera et al.,Exp.Biol.&Med.,2008,233:620-626,其全部内容通过引用并入本发明)。CD74在多发性骨髓瘤中以中等至高水平表达是公知的。参见Burton et al.,Clin.CancerRes.,2004,10:6606-6611,其全文内容通过引用整体并入本发明。CD74表达是有关胰腺癌恶化的关键因素,也是公知的。Zhang et al.,HepatobiliaryPancreat.Dis.Int.,2014,13:81-86,通过引用整体并入本发明。

在一些方面,本发明提供的所述抗体偶联物,可用于治疗一种或多种B细胞恶性肿瘤。对本领域技术人员而言,所述B细胞恶性肿瘤可以是任何公知的B细胞恶性肿瘤。此类B细胞恶性肿瘤描述于the Revised European-American Lymphoma classificationsystem(REAL)和Harris et al.,1994, Blood 84:1361-1392and Armitage&Weisenburger,1998,J.Clin.Oncol.16:2780-2795中,各自通过引用整体并入本发明。在一些实施方案中,所述B细胞恶性肿瘤选自由含弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞、淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)组成的组。在一些实施方案中,所述DLBCL选自由含原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、原发性皮肤弥漫性大B细胞淋巴瘤、腿型(原发性皮肤DLBCL,腿型)、老年人EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤、伴有炎症的弥漫性大 B细胞淋巴瘤组成的组。在一些实施方案中,所述B细胞恶性肿瘤选自由含伯基特氏淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、原发性中枢神经系统淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆细胞性淋巴瘤、HHV8相关多中心性巨大淋巴结增生症病引起的大B细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(无法分类,弥漫性大B细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤的中间特征)和B细胞淋巴瘤(无法分类,具有介于弥漫性大B细胞淋巴瘤和经典霍奇金淋巴瘤之间的特征) 组成的组。在一些实施方案中,所述恶性肿瘤选自霍奇金淋巴瘤、经典霍奇金淋巴瘤和结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤组成的组。在一些实施方案中,所述恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤。

在一些方面,本发明提供的所述抗体偶联物可用于治疗一种或多种白血病。在一些实施方案中,所述白血病是急性白血病。在一些实施方案中,所述白血病是慢性白血病。在一些实施方案中,所述白血病选自由急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)和毛细胞白血病(HCL)组成的组。

15.诊断应用

在一些实施方案中,本发明提供的所述抗体偶联物用于诊断应用。例如,抗-CD74抗体可用于CD74蛋白质的测定。在一些方面,所述抗体可用于检测各种细胞和组织中CD74的表达。这些测定可能是有用的,例如,诊断癌症,感染和自身免疫性疾病。

在一些诊断应用中,所述抗体可以用检测部分标记。合适的检测部分包括但不限于,放射性同位素,荧光标记和酶-底物标记。在本发明的另一个实施方案中,所述抗CD74抗体不需要进行标记,且其存在可以使用特异性结合所述抗CD74抗体的标记抗体进行检测。

16.亲和纯化试剂

本发明的所述抗体偶联物可用作亲和纯化剂。在此方法中,所述抗体偶联物可使用本领域公知的方法固定在固相如树脂或滤纸上。所述固定化抗体与含有待纯化CD74蛋白(或其片段)的样品进行接触,然后用合适的溶剂洗涤载体,基本去除样品中除CD74蛋白外的所有物质,其中CD74蛋白与固定化抗体结合。最后,用另一种合适的溶剂洗涤载体,例如甘氨酸缓冲液,pH 5.0,以使CD74 蛋白从抗体中释放出来。

17.试剂盒

在一些实施方案中,本发明所述的抗体可以在试剂盒中进行提供,即,预定量试剂的包装组合与用于实施程序的说明书。在一些实施方案中,所述程序是诊断测定。在其他实施方案中,所述程序是治疗程序。

实施例

实施例1:抗CD74抗体的生产和纯化

如前所述,通过以下修饰,在Xpress CF

通过在10,000rpm下对抗CD74无细胞反应物进行离心澄清,离心时间为30分钟。使用标准洗涤和低pH洗脱液,将澄清的上清液施加到蛋白质A MabSelect SuRe(GEHealthcare)上。通过配置在50mM磷酸钠和200mM精氨酸中的制备型SEC(Sepax SRT-10C),pH为6.5,除去诸如聚合物的杂质。在杜贝科磷酸缓冲生理盐水(Dulbecco's PhosphateBuffered Saline)(1x DPBS)中配制样品的最终配方。

实施例2:具有非天然氨基酸的抗CD74抗体的制备

根据EU编号方案,在重链残基404、241和222的位置,以及根据Kabat或Chothia编号方案,在轻链残基7处,制备具有非天然氨基酸的抗体。一种抗体在404位上方包含残基(56),四种抗体在位置404、241、222(重链)和7(轻链)的每一个上面包含残基(30)。起始重链取决于SEQ ID NO:236,以及起始轻链取决于SEQ ID NO:256。

如图2A所示,每种抗体以至少400mg/L的总产量进行表达,并通过SDS-PAGE检测,测得完整的IgG,如图2B所示。

实施例3:抗体-PEG4-美登素偶联物的制备

根据实施例2,制得重链的EU位置404处修饰的氨基酸残基30(即p-叠氮基-甲基-L-苯丙氨酸或pAMF)的纯化抗CD74 IgG。使用环辛炔应变试剂,将抗CD74 IgG与细胞毒性剂美登素进行偶联,得到偶联物A。

简而言之,根据下式:

通过MALDI-TOF(Bruker AutoFlex Speed)进行DAR分析。在37℃,用10mM TCEP的水溶液将蛋白质偶联物还原10分钟,使用含30%乙腈,0.1%三氟乙酸的溶液稀释至终浓度为50μg/mL。将样品与S-DHB MALDI基质(50mg/mL的含50%乙腈、0.1%三氟乙酸的溶液)1:1合并,取1μL 应用于MALDI靶标物中,在真空下干燥。每个MALDI光谱以线性模式,全激光功率下累积5000次轰击,并且通过比较重链和轻链的偶联物和非偶联物的相对峰高,计算得到最终DAR分析。

通过峰强度,MALDI-TOF显示药物与抗体的比率(DAR)为3.92。偶联物A,具有两种位置异构体:

实施例4:抗体偶联物的制备

根据实施例2,含有修饰氨基酸残基30的纯化抗CD74 IgG,与美登素、半胱氨酸、鹅膏蕈碱、MMAF和MMAE连接体-有效负载前体进行偶联,以产生几种指定偶联物B-F的抗CD74-连接体 -有效负载偶联物。

按照与实施例3一致的方案,用以下PEG4-美登素前体制备偶联物B:

用下列val-cit-PAB-哈米特林(hemiasterlin)前体制备偶联物C,如2015年1月30日提交的美国专利申请号62/110,390,题为Hemiasterlin Derivatives for Conjugationand Therapy所述,在此进行整体引入以作参考:

偶联物C具有以下结构,显示为两种位置异构体:

用以下连接体-鹅膏蕈碱前体制备偶联物D:

用以下PEG4-MMAF前体制备偶联物E:

用以下PEG

通过Doronina,S.等2003 Nat Biotechnol 21,778-84中所述方法的变型,制备偶联物F。偶联物F具有如下结构,显示为两种位置异构体:

在280nm,通过测量每种偶联物吸光度,对之进行表达,并通过MALDI-TOF测量偶联程度。将实施例3中的未偶联抗体作为对照。数据汇总于下表中:

实施例5:细胞结合和细胞杀死

通过如下方法,评估偶联物A结合和表达CD74细胞杀死的能力。测试的细胞株包括B-淋巴瘤,多发性骨髓瘤和白血病细胞。对照包括未偶联的抗CD74抗体和游离连接体-药物(DIBCO-PEG4- 美登素)。

细胞结合分析

将细胞株保持在补充有20%热灭活的胎牛血清(Hyclone;Thermo Scientific;Waltham,MA)、 2mM谷氨酰胺(Invitrogen;Carlsbad,CA)、1x青霉素/链霉素(Cellgro-Mediatech;Manassas,VA) 的高葡萄糖(Cellgro-Mediatech;Manassas,VA)的RPMI中。收取细胞并重悬于FACS缓冲液(补充有1%牛血清白蛋白的DPBS缓冲液)中。将每孔共有200,000个细胞培育在含未偶联抗CD74抗体逐级稀释液的冰上,培育时间为60分钟。用冰冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次,并在冰上用5ug/ml Alexa 647标记的驴抗人IgG抗体(JacksonImmune-Research)进行培育,时间为60分钟。未染色的细胞和单独用二次抗体染色的细胞用作对照。然后使用FACS缓冲液洗涤样品两次,并使用BD FACS Canto 系统进行分析。使用GraphPad Prism上的一个位点特异性结合方程和非线性回归分析对平均荧光强度进行拟合。数据表示为荧光强度的几何平均值vs抗体浓度(nM)。

细胞杀死实验

使用细胞增殖试验,测量游离药物连接体和偶联物的细胞毒性作用。在测定当天,将体积为 25μl、数量总共为12500个的细胞接种在384-孔平底白色聚苯乙烯板中。在RPMI培养基中,以2x 起始浓度(游离药物连接体1000nM和ADC 100nM)配制游离药物连接体和偶联物,并使用 MultiScreen HTS 96孔滤板(Millipore)进行过滤。将过滤灭菌的样品在无菌条件下进行逐级稀释(1: 3),并加入处理孔中。在37℃下,将板在CO

偶联物A的结果汇总于下表2中:

表2.偶联物A的结果

NK=未杀死

NB=未结合

实施例6:细胞结合和细胞杀死

评估每个偶联物A-F结合和杀死表达CD74的细胞的能力。测试的细胞株包括B-淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病细胞。对照包括未偶联的抗CD74抗体。结果汇

总于下表3中:

实施例7:小鼠多发性骨髓瘤模型中体内抗肿瘤活性的评估

对抗CD74抗体-药物偶联物在人多发性骨髓瘤模型(扩散性)中的体内抗肿瘤功效进行调查,以开展研究。在接种ARP-1多发性骨髓瘤细胞的动物中评估偶联物A(实施例3)。使用患有多发性骨髓瘤患者的骨髓抽吸物建立ARP-1(和同基因细胞株ARD-1和CAG)(Kwong,K.Characterization of an Isogenic Model System for KDM6A/UTX Loss inMultiple Myeloma.(2013),其通过引用其全文并入本文)。

试验方案通过尾静脉注射,将雌性CB17 SCID(严重联合免疫缺陷)接种于ARP-1细胞中。在肿瘤细胞接种前,用0.4mg/小鼠的氟达拉滨和2mg/小鼠的环磷酰胺(腹膜内注射)对动物进行预处理。在肿瘤接种后14天,开始进行随机化和治疗。处理组概述于表4中。将所有测试制品配制在 10mM、pH 6.0的柠檬酸盐,10%蔗糖中,并用PBS稀释。通过静脉内注射,每7天(q7dx4)给动物施用四次指定的测试物品。未经处理的动物未接受化学预处理,未接种ARP-1细胞。每周两次监测体重。当载体对照动物达到研究终点(由于大的,可触知的内部肿瘤而实施安乐死)时,对来自第2 组和第3组的三只动物实施安乐死,以进行尸检和用于流式细胞术的骨髓收获(来自胫骨和股骨)。在治疗开始后,对治疗组中余下的动物进行长达3个月的监测。

表4.治疗组

根据制造商的方案,抽取小鼠股骨和胫骨的骨髓细胞,使用AlexaFluor 647小鼠抗人CD138 克隆MI15(BD Biosciences#562097)评估CD138表达。使用LSRII流式细胞仪和FACS Diva软件,进行直接免疫荧光流式细胞术分析。使用Flowjo(Tree Star,Inc.,Ashland,OR)分析数据。

使用单因素方差分析(ANOVA)和Dunnett多重比较检验,分析研究终点的体重,组织体积或组织重量。对小于5%的概率(p<0.05)认为是显著的。

结果。将多发性骨髓瘤细胞ARP-1静脉内接种到CB17 SCID小鼠中,并用3mg/kg偶联物A (q7dx4)进行处理。研究终点的特征在于体重发生了显著的变化,形成了大到可触及的内部肿瘤,以及濒死状态。图3A显示了载体对照动物开始于肿瘤接种后大约第25天的稳定体重增加(BWC增加),到第35天随之发展为腹胀。在第49天,因其临床终点和可触及的腹部肿瘤,对载体对照动物施行安乐死。在用偶联物A治疗的组中未观察到体重的显著改变(FIG.3A),腹部肿胀或疼痛表象。载体对照组(第46天)最后记录日的BWC趋向于显著(偶联物A,p=0.0551),与载体对照相比, (图3B)。

载体对照动物的整体病理学分析揭示了卵巢和/或肾脏中及其周围的大肿瘤块(图4A,图 4B)。内部肿瘤的形成可能是载体对照动物中观察到的腹部膨胀和体重增加的原因。收获一部分用偶联物A治疗组的动物(每组n=3),用于解剖学检查和流式细胞术。图4A和图4B显示,接受CD74 ADC治疗的两组,其肾脏和卵巢外观表型正常,且其组织重量与未治疗的年龄相当的对照动物(其未接受细胞或治疗)差别不大。还通过测量存在于骨髓(股骨和胫骨)中的人CD138阳性ARP-1骨髓瘤细胞的百分比,对肿瘤负荷进行评估。CD138是骨髓中多发性骨髓瘤和浆细胞的特异性表面抗原 (Chilosi,M.et al.“CD138/syndecan-1:Auseful immunohistochemical marker of normal and neoplastic plasma cells onroutine trephine bone marrowbiopsies.”Mod.Pathol.Off.J.U.S.Can.Acad.Pathol.Inc 12, 1101–1106(1999),通过引用其全文并入文本)。载体对照组显示高肿瘤负荷,而用偶联物A治疗的动物基本上抑制骨髓中的ARP-1生长(图5A,图5B)。未治疗的年龄相当对照组中分离而得的骨髓,外观类似于偶联物A治疗的组。累积地,这些结果表明偶联物A消除了肿瘤负荷。

在第一轮治疗后,继续监测偶联物A治疗组(每组n=6-7)中的剩余动物,以掌握其疾病发展状况。类似地,偶联物A治疗延迟了体重增加约20天,在最后一次剂量后约70天或35天,其体重随之开始稳定增加。到第82天(最后一次治疗后45天),一些动物出现扩张性的腹胀,在卵巢和/或肾脏周围出现大肿瘤块。一部分治疗组的动物(n=3),在第82天开始接受第二轮偶联物A治疗。可观察到体重增加的表观稳定,这表明疾病恶化得以遏制。

所述研究的结果显示,偶联物A可减轻接种有ARP-1多发性骨髓瘤细胞动物的体重增加和肿瘤负荷(在骨髓和内部肿瘤中),并具有相似的效力和反应持续时间。

实施例8:小鼠多发性骨髓瘤模型中体内抗肿瘤活性的进一步研究

实施本研究,旨在调查抗CD74抗体-药物偶联物在人多发性骨髓瘤模型(扩散性)中的体内抗肿瘤功效。对接种有MM.1S多发性骨髓瘤细胞动物进行偶联物A(实施例3)治疗评估。

试验方案将多发性骨髓瘤MM.1S细胞,接种到8周龄雌性NOD SCIDγ(NSG)小鼠尾静脉中。在肿瘤接种后11天,启动体重随机化和治疗。处理组概述于表5中。将测试试剂配制在10mM pH 6.0柠檬酸盐,10%蔗糖中,并经PBS稀释后用于给药。通过静脉内(IV)注射,每7天给动物施用偶联物A,持续3周(q7dx3)。对于每组,将一部分动物用于骨髓收获和分析(n=3),并监测剩余的动物(n=5)的存活情况。存活终点的特征是体重减轻>20%和出现嗜睡,后肢麻痹或濒死等临床症状。在第32天(治疗开始后3周),随机选择每组3只动物进行安乐死,以进行用于流式细胞术的骨髓收获(从胫骨和股骨抽取)。在第129天(治疗开始后约4个月),对所有存活的动物实施安乐死,并收获骨髓(从胫骨和股骨抽取),用于流式细胞术。

表5.治疗组列表

每周至少两次监测体重,持续长达129天。所有图表均表示为平均值±平均值标准误差(SEM) vs治疗开始后的天数。

体重变化百分比(BWC)是根据治疗当天的体重计算而得。实质毒性是指动物体重减少> 20%,此时受影响的动物实施安乐死。

根据制造商的方案,抽取小鼠股骨和胫骨的骨髓细胞,使用Alexa Fluor 647小鼠抗人CD138 克隆MI15(BD Biosciences#562097)评估人CD138表达。CD138是骨髓中MM和浆细胞的特异性表面抗原(Chilosi,M.et al.(1999),supra)。使用LSRII流式细胞仪和FACSDiva软件进行直接免疫荧光流式细胞术分析。使用Flowjo(Tree Star,Inc.,Ashland,OR)分析数据。

使用单因素方差分析(ANOVA)和Dunnett调整分析,在0.05显著性水平下,对第32天的骨髓中的人CD138+细胞进行分析。来自MM.1s阳性对照的数据被排除于分析外。概率小于5%(p <0.05),被认为是显著的。

结果。将多发性骨髓瘤MM.1S细胞静脉内接种到NSG小鼠中,并在肿瘤接种后第11天开始用载体,偶联物A剂量为3mg/kg或10mg/kg(q7dx3)进行处理。存活研究的终点标准包括体重变化大于20%和濒死的临床症状。图6A显示,载体对照动物的体重减轻,始于肿瘤接种后大约第28 天。体重减轻伴有驼背姿势,后肢麻痹和严重嗜睡。载体组的平均存活期为35天,而用3或10mg/kg 的偶联物A进行治疗,存活率为100%,所有动物在接种后第129天未出现疾病迹象(图6B)。

在第32天,通过测量骨髓中hCD138+骨髓瘤细胞的百分比,对肿瘤负荷进行评估。图6C 显示,与载体对照组中的高肿瘤负荷(~50%)相比,两种剂量的偶联物A显著降低了肿瘤负荷。约4 个月后(第129天),在用3和10mg/kg偶联物A处理的动物骨髓中,未检测到hCD138+细胞(图 6D)。第32天和第129天的两组数据,包括来自未接种的阴性对照动物(无细胞或处理)骨髓和作为阳性对照的MM.1S细胞。按照预期,未接种组和MM.1S细胞分别含有低hCD138+和高hCD138+。

所述研究的结果显示,在扩散性MM.1S模型中治疗开始后约4个月,因其100%存活率和骨髓中不存在hCD138+,3或10mg/kg偶联物A(q7dx3)可根除疾病。

实施例9:评估小鼠非霍奇金淋巴瘤(NHL)模型中的体内抗肿瘤活性

实施研究,以调查抗CD74抗体-药物偶联物在人非霍奇金淋巴瘤(“NHL”)模型中的体内抗肿瘤功效。对体内携带已建立的皮下SU-DHL-6NHL肿瘤(弥漫性大B-细胞淋巴瘤)动物,进行偶联物A(实施例3)评估。偶联物A治疗显著延迟了NHL肿瘤SU-DHL-6的生长。

试验方案将9周龄的雌性CB17 SCID小鼠用异氟烷麻醉,并将比例为1:1的SU-DHL-6 细胞和基质胶的混合物,皮下植入其右侧。植入后约14天开始随机化,登记为治疗组,开始治疗。处理组概述于表6中。将所有测试试剂配制在10mM pH 6.0柠檬酸盐,9%蔗糖中,并用PBS进行稀释。每周两次监测体重和肿瘤大小,直至对照治疗的肿瘤平均值>1000mm

表6.治疗组

使用单因素方差分析(ANOVA)和Dunnett多重比较检验,分析肿瘤植入后第18天(对照动物研究的最后一天)的肿瘤大小。小于5%的概率(p<0.05),即认为是显着的。

结果。在该研究中,将NHL细胞SU-DHL-6皮下植入CB17 SCID小鼠,并用10mg/kg偶联物A进行处理。图7A和图7B显示了重复给药剂量(q7dx3)的功效结果。偶联物A(q7dx3)治疗显著地抑制了SU-DHL-6肿瘤的生长,与第18天的对照相比,产生的肿瘤生长抑制约为80%(**** p<0.0001,表8)。值得注意的是,在用偶联物A治疗的情况下,SU-DHL-6肿瘤有一些持续性的生长。此外,偶联物A治疗具有良好的耐受性,且因其对动物体重没有显着影响,可知未表现任何毒性 (图8)。

表8.第18天的肿瘤大小与载体对照的统计学比较

研究的结果显示,偶联物A减缓SU-DHL-6肿瘤生长效果显著。

实施例10:序列

表7提供了本发明所述序列。

表7.序列

等同

以上所述公开内容,可以涵盖具有独立效用的多个不同发明。尽管每个所述发明以其优选形式进行了公开,但是本发明所公开和所示出的具体实施例,不应被视为具有限制意义,因为许多变形是可能做到的。本发明的主题包括本发明公开的各种组件、特征、功能和/或性质的所有新颖和非显而易见的组合和子组合。所述以下权利要求特别指出被视为新颖和非显而易见的一些组合和子组合。在本申请中,在要求本申请优先权的申请中或在相关申请中,可以要求在特征、功能、元件和/或特性的其他组合和子组合中体现的发明。所述权利要求,无论是针对不同的发明还是针对相同的发明,以及与原始权利要求相比是否更宽、更窄、相同或不同,也被认为包括在本发明的发明的主题内。

序列表

<110> 苏特罗生物制药公司(SUTRO BIOPHARMA, INC.)

<120> 抗CD74抗体偶联物,包含抗CD74抗体偶联物的组合物以及抗CD74抗体偶联物的使用方法

<130> 108843.00089

<140> PCT/US2017/015501

<141> 2017-01-27

<150> US 62/287,824

<151> 2016-01-27

<160> 311

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 合成的: 1251-A03, CDR-H1, Chothia

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<220>

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH5-[7], CDR-H1, Chothia

<400> 30

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH6-[11], CDR-H1, Chothia

<400> 31

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 32

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH8-[15], CDR-H1, Chothia

<400> 32

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 33

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-B08, CDR-H1, Kabat

<400> 33

Asp Tyr Gly Met His

1 5

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-C08, CDR-H1, Kabat

<400> 34

Asn Asn Trp Met Ser

1 5

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-E06b, CDR-H1, Kabat

<400> 35

Asn Thr Asp Met Ser

1 5

<210> 36

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-H04b, CDR-H1, Kabat

<400> 36

Ser Ser Trp Met Ser

1 5

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1198-A01, CDR-H1, Kabat

<400> 37

Asp Tyr Asp Met Ser

1 5

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1198-B10, CDR-H1, Kabat

<400> 38

Gly Ser Trp Ile His

1 5

<210> 39

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1198-D03, CDR-H1, Kabat

<400> 39

Asn Tyr Asp Ile His

1 5

<210> 40

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1198-D04, CDR-H1, Kabat

<400> 40

Asn Tyr Asp Ile His

1 5

<210> 41

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-A02, CDR-H1, Kabat

<400> 41

Asp His Gly Met His

1 5

<210> 42

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-A03, CDR-H1, Kabat

<400> 42

Asp His Gly Met His

1 5

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-A06, CDR-H1, Kabat

<400> 43

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 44

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-B06, CDR-H1, Kabat

<400> 44

Gly Asn Trp Met Ser

1 5

<210> 45

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-B09, CDR-H1, Kabat

<400> 45

Asp Tyr Gly Met His

1 5

<210> 46

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-B10, CDR-H1, Kabat

<400> 46

Ser His Gly Met His

1 5

<210> 47

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-C03, CDR-H1, Kabat

<400> 47

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 48

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-D02, CDR-H1, Kabat

<400> 48

Ser His Gly Met His

1 5

<210> 49

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-D06, CDR-H1, Kabat

<400> 49

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 50

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-D09, CDR-H1, Kabat

<400> 50

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 51

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-E06, CDR-H1, Kabat

<400> 51

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 52

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-F06, CDR-H1, Kabat

<400> 52

Ser Phe Gly Met His

1 5

<210> 53

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-F07, CDR-H1, Kabat

<400> 53

Ser His Gly Met His

1 5

<210> 54

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-G02, CDR-H1, Kabat

<400> 54

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 55

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1445-A03, CDR-H1, Kabat

<400> 55

Gly Tyr Tyr Ile His

1 5

<210> 56

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1445-B09, CDR-H1, Kabat

<400> 56

Gly Thr Gly Ile His

1 5

<210> 57

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-D11, CDR-H1, Kabat

<400> 57

Asn Thr Asp Met Ser

1 5

<210> 58

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-E08, CDR-H1, Kabat

<400> 58

Asp Thr Asp Met Ser

1 5

<210> 59

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-F11, CDR-H1, Kabat

<400> 59

Asn Thr Asp Met Ser

1 5

<210> 60

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-G01, CDR-H1, Kabat

<400> 60

Thr Ser Asp Met Ser

1 5

<210> 61

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH11-[19], CDR-H1, Kabat

<400> 61

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 62

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH5-[7], CDR-H1, Kabat

<400> 62

Ser Tyr Ala Met His

1 5

<210> 63

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH6-[11], CDR-H1, Kabat

<400> 63

Ser Tyr Ala Met His

1 5

<210> 64

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH8-[15], CDR-H1, Kabat

<400> 64

Ser Tyr Ala Met His

1 5

<210> 65

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-B08, CDR-H2, Chothia

<400> 65

Trp Tyr Asp Gly Ser Ile

1 5

<210> 66

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-C08, CDR-H2, Chothia

<400> 66

Asn Gly Asp Asp Gly Tyr

1 5

<210> 67

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-E06b, CDR-H2, Chothia

<400> 67

Asn Gly Ser Gly Gly Ala

1 5

<210> 68

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-H04b, CDR-H2, Chothia

<400> 68

Asn Gly Tyr Asn Gly Ile

1 5

<210> 69

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1198-A01, CDR-H2, Chothia

<400> 69

Ala Gln Asp Gly Ser Tyr

1 5

<210> 70

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1198-B10, CDR-H2, Chothia

<400> 70

Tyr Pro Asp Asp Gly Asp

1 5

<210> 71

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1198-D03, CDR-H2, Chothia

<400> 71

Asp Pro Tyr Asn Gly Ala

1 5

<210> 72

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1198-D04, CDR-H2, Chothia

<400> 72

Asp Pro Tyr Asn Gly Thr

1 5

<210> 73

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-A02, CDR-H2, Chothia

<400> 73

Trp Tyr Asp Gly Ser His

1 5

<210> 74

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-A03, CDR-H2, Chothia

<400> 74

Trp Tyr Asp Gly Ser His

1 5

<210> 75

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-A06, CDR-H2, Chothia

<400> 75

Trp Asp Asp Gly Ser Asp

1 5

<210> 76

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-B06, CDR-H2, Chothia

<400> 76

Tyr Gly Thr Ser Gly Ala

1 5

<210> 77

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-B09, CDR-H2, Chothia

<400> 77

Trp Tyr Asp Gly Ser Arg

1 5

<210> 78

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-B10, CDR-H2, Chothia

<400> 78

Trp His Asp Gly Ser Asp

1 5

<210> 79

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-C03, CDR-H2, Chothia

<400> 79

Trp Tyr Asp Gly Ser Ile

1 5

<210> 80

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-D02, CDR-H2, Chothia

<400> 80

Trp Asp Asp Gly Ser Asp

1 5

<210> 81

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-D06, CDR-H2, Chothia

<400> 81

Trp Tyr Asp Gly Ser Lys

1 5

<210> 82

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-D09, CDR-H2, Chothia

<400> 82

Trp Tyr Asp Ala Ser Ile

1 5

<210> 83

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-E06, CDR-H2, Chothia

<400> 83

Trp Tyr Asp Gly Ser Asn

1 5

<210> 84

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-F06, CDR-H2, Chothia

<400> 84

Trp Tyr Asp Gly Ser Asn

1 5

<210> 85

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-F07, CDR-H2, Chothia

<400> 85

Trp Asp Asp Gly Ser Asn

1 5

<210> 86

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-G02, CDR-H2, Chothia

<400> 86

Trp His Asp Gly Ser Lys

1 5

<210> 87

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1445-A03, CDR-H2, Chothia

<400> 87

Ser Pro Thr Gly Gly Tyr

1 5

<210> 88

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1445-B09, CDR-H2, Chothia

<400> 88

Thr Pro Tyr Asn Gly Thr

1 5

<210> 89

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-D11, CDR-H2, Chothia

<400> 89

Asn Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 90

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-E08, CDR-H2, Chothia

<400> 90

Asn Gly Ala Gly Gly Ala

1 5

<210> 91

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-F11, CDR-H2, Chothia

<400> 91

Asn Gly Ser Gly Gly Val

1 5

<210> 92

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-G01, CDR-H2, Chothia

<400> 92

Asn Gly Ser Gly Gly Ala

1 5

<210> 93

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH11-[19], CDR-H2, Chothia

<400> 93

Trp Tyr Asp Gly Ser Asn

1 5

<210> 94

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH5-[7], CDR-H2, Chothia

<400> 94

Ser Tyr Asp Gly Ser Asn

1 5

<210> 95

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH6-[11], CDR-H2, Chothia

<400> 95

Ser Tyr Asp Gly Ser Ile

1 5

<210> 96

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH8-[15], CDR-H2, Chothia

<400> 96

Ser Tyr Asp Gly Ser Asn

1 5

<210> 97

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-B08, CDR-H2, Kabat

<400> 97

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ile Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 98

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-C08, CDR-H2, Kabat

<400> 98

Ile Ile Asn Gly Asp Asp Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Arg Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 99

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-E06b, CDR-H2, Kabat

<400> 99

Ile Ile Asn Gly Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 100

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-H04b, CDR-H2, Kabat

<400> 100

Ile Ile Asn Gly Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 101

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1198-A01, CDR-H2, Kabat

<400> 101

Phe Ile Ala Gln Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 102

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1198-B10, CDR-H2, Kabat

<400> 102

Tyr Ile Tyr Pro Asp Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 103

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1198-D03, CDR-H2, Kabat

<400> 103

Asn Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 104

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1198-D04, CDR-H2, Kabat

<400> 104

Asn Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 105

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-A02, CDR-H2, Kabat

<400> 105

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His Lys Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 106

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-A03, CDR-H2, Kabat

<400> 106

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His Lys Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 107

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-A06, CDR-H2, Kabat

<400> 107

Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asp Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 108

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-B06, CDR-H2, Kabat

<400> 108

Ile Ile Tyr Gly Thr Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 109

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-B09, CDR-H2, Kabat

<400> 109

Val Thr Trp Tyr Asp Gly Ser Arg Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 110

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-B10, CDR-H2, Kabat

<400> 110

Val Ile Trp His Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 111

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-C03, CDR-H2, Kabat

<400> 111

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 112

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-D02, CDR-H2, Kabat

<400> 112

Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asp Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 113

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-D06, CDR-H2, Kabat

<400> 113

Val Val Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 114

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-D09, CDR-H2, Kabat

<400> 114

Val Ile Trp Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Lys Tyr Ala Gly Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 115

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-E06, CDR-H2, Kabat

<400> 115

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 116

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-F06, CDR-H2, Kabat

<400> 116

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 117

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-F07, CDR-H2, Kabat

<400> 117

Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Glu Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 118

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-G02, CDR-H2, Kabat

<400> 118

Val Ile Trp His Asp Gly Ser Lys Asp Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 119

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1445-A03, CDR-H2, Kabat

<400> 119

Glu Ile Ser Pro Thr Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 120

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1445-B09, CDR-H2, Kabat

<400> 120

Ile Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 121

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-D11, CDR-H2, Kabat

<400> 121

Val Ile Asn Gly Ser Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 122

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-E08, CDR-H2, Kabat

<400> 122

Met Ile Asn Gly Ala Gly Gly Ala Ser Phe Tyr Ala Asp Ser Val Arg

1 5 10 15

Gly

<210> 123

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-F11, CDR-H2, Kabat

<400> 123

Ile Ile Asn Gly Ser Gly Gly Val Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Arg

1 5 10 15

Gly

<210> 124

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-G01, CDR-H2, Kabat

<400> 124

Ile Ile Asn Gly Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 125

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH11-[19], CDR-H2, Kabat

<400> 125

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 126

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH5-[7], CDR-H2, Kabat

<400> 126

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 127

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH6-[11], CDR-H2, Kabat

<400> 127

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 128

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH8-[15], CDR-H2, Kabat

<400> 128

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 129

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-B08, CDR-H3, K/C

<400> 129

Gly Gly Thr Val Glu His Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Val

1 5 10

<210> 130

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-C08, CDR-H3, K/C

<400> 130

Val Ala Leu Gly Arg Pro Arg Arg Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 131

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-E06b, CDR-H3, K/C

<400> 131

Phe Glu Asn Glu Trp Glu Val Ser Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 132

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-H04b, CDR-H3, K/C

<400> 132

Pro Ser Ala Pro Gly Ala Arg Arg Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 133

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1198-A01, CDR-H3, K/C

<400> 133

Ser Lys Leu Phe Arg Ala Gly Gln Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 134

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1198-B10, CDR-H3, K/C

<400> 134

Glu Gly Ser His Asn Leu Asp Lys Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 135

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1198-D03, CDR-H3, K/C

<400> 135

Val Leu Trp Gly Phe Trp Ala Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 136

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1198-D04, CDR-H3, K/C

<400> 136

Val Pro Trp Gly Phe Trp Ala Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 137

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-A02, CDR-H3, K/C

<400> 137

Gly Gly Ser Leu Ala Gly Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Val

1 5 10

<210> 138

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-A03, CDR-H3, K/C

<400> 138

Gly Gly Ser Leu Ala Gly Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Val

1 5 10

<210> 139

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-A06, CDR-H3, K/C

<400> 139

Gly Gly Thr Arg Val Leu Gly Ala Ile His Gly Thr Asp Val

1 5 10

<210> 140

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-B06, CDR-H3, K/C

<400> 140

Pro Ser Met Ser Gly Ser Arg Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 141

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-B09, CDR-H3, K/C

<400> 141

Gly Gly Thr Leu Val His Gly Ala Leu Tyr Gly Asn Asp Val

1 5 10

<210> 142

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-B10, CDR-H3, K/C

<400> 142

Gly Gly Thr Arg Val Leu Gly Ala Val Tyr Gly Leu Asp Val

1 5 10

<210> 143

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-C03, CDR-H3, K/C

<400> 143

Gly Gly Ala Leu Met Arg Gly Glu Phe Ser Gly His Asp Val

1 5 10

<210> 144

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-D02, CDR-H3, K/C

<400> 144

Gly Gly Thr Arg Val Leu Gly Ala Ile His Gly Thr Asp Val

1 5 10

<210> 145

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-D06, CDR-H3, K/C

<400> 145

Gly Gly Thr Leu Val Arg Gly Ala Val Tyr Gly Leu Asp Val

1 5 10

<210> 146

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-D09, CDR-H3, K/C

<400> 146

Gly Gly Thr Val Glu Arg Gly Ala Ile Tyr Gly Thr Asp Val

1 5 10

<210> 147

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-E06, CDR-H3, K/C

<400> 147

Gly Gly Met Val Gly Gln Gly Ala Met Phe Gly Leu Asp Val

1 5 10

<210> 148

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-F06, CDR-H3, K/C

<400> 148

Gly Gly Ser Leu Val Thr Arg Gly Val Tyr Gly Leu Asp Val

1 5 10

<210> 149

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-F07, CDR-H3, K/C

<400> 149

Gly Gly Thr Arg Ile Arg Gly Leu Arg Tyr Gly Thr Asp Val

1 5 10

<210> 150

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-G02, CDR-H3, K/C

<400> 150

Gly Gly Gln Leu Asp His Gly Ala Ile Tyr Gly Leu Asp Val

1 5 10

<210> 151

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1445-A03, CDR-H3, K/C

<400> 151

Glu His Gly Leu Val Tyr Gly Gln Pro Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 152

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1445-B09, CDR-H3, K/C

<400> 152

Gly Gly Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Pro Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 153

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-D11, CDR-H3, K/C

<400> 153

Tyr Glu Thr Glu Trp Glu Val Ser Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 154

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-E08, CDR-H3, K/C

<400> 154

Phe Glu Asn Gln Trp Glu Val Thr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 155

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-F11, CDR-H3, K/C

<400> 155

Tyr Glu Ser Glu Trp Glu Val Ser Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 156

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-G01, CDR-H3, K/C

<400> 156

Tyr Glu Asn Glu Met Glu Val Ser Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 157

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH11-[19], CDR-H3, K/C

<400> 157

Gly Gly Thr Leu Val Arg Gly Ala Met Tyr Gly Thr Asp Val

1 5 10

<210> 158

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH5-[7], CDR-H3, K/C

<400> 158

Gly Arg Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 159

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH6-[11], CDR-H3, K/C

<400> 159

Gly Arg Glu Ile Thr Ser Gln Asn Ile Val Ile Leu Leu Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 160

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VH8-[15], CDR-H3, K/C

<400> 160

Gly Arg Glu Ile Thr Ser Gln Asn Ile Val Ile Leu Leu Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 161

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A09, CDR-L1, K/C

<400> 161

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 162

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-C08, CDR-L1, K/C

<400> 162

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 163

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-E06b, CDR-L1, K/C

<400> 163

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 164

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-H04b, CDR-L1, K/C

<400> 164

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 165

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1275-C10, CDR-L1, K/C

<400> 165

Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 166

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1275-D01, CDR-L1, K/C

<400> 166

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Arg Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 167

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1275-D10, CDR-L1, K/C

<400> 167

Arg Ala Ser Gln Gly Val Phe Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 168

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1275-G02, CDR-L1, K/C

<400> 168

Arg Ala Ser Gln Gly Leu Gly Ser Phe Leu Ala

1 5 10

<210> 169

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A04, CDR-L1, K/C

<400> 169

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Arg Trp Val Ala

1 5 10

<210> 170

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A05, CDR-L1, K/C

<400> 170

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Arg Trp Val Ala

1 5 10

<210> 171

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A06, CDR-L1, K/C

<400> 171

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Trp Val Ala

1 5 10

<210> 172

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A07, CDR-L1, K/C

<400> 172

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Val Ala

1 5 10

<210> 173

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A08, CDR-L1, K/C

<400> 173

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Trp Val Ala

1 5 10

<210> 174

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-B06, CDR-L1, K/C

<400> 174

Arg Ala Gly Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 175

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A10, CDR-L1, K/C

<400> 175

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Val Ala

1 5 10

<210> 176

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-D11, CDR-L1, K/C

<400> 176

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 177

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-E08, CDR-L1, K/C

<400> 177

Arg Ala Ser Gln Arg Val Ala Gly Ile Asp Leu Ser

1 5 10

<210> 178

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-F11, CDR-L1, K/C

<400> 178

Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Arg Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 179

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-G01, CDR-L1, K/C

<400> 179

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Arg Glu Leu Gly

1 5 10

<210> 180

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VL-5[23] & VL6-[26], CDR-L1, K/C

<400> 180

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 181

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A09, CDR-L2, K/C

<400> 181

Ala Ala Asp Arg Leu Gln Ser

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 182

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-E06b, CDR-L2, K/C

<400> 183

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 184

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 185

Ser Ala Arg Tyr Leu Gln Ser

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1275-D01, CDR-L2, K/C

<400> 186

Gly Arg Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1275-D10, CDR-L2, K/C

<400> 187

Asn Ala Thr Gln Leu Gln Ser

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 188

Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ile

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A05, CDR-L2, K/C

<400> 190

Gly Ala Asp Arg Leu Gln Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Gly Ala Asp Arg Leu Gln Ser

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A07, CDR-L2, K/C

<400> 192

Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A08, CDR-L2, K/C

<400> 193

Ala Ser Asp Ser Leu Gln Ser

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-B06, CDR-L2, K/C

<400> 194

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A10, CDR-L2, K/C

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Gly Ser Ser Arg Leu Gln Ser

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-F11, CDR-L2, K/C

<400> 198

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-G01, CDR-L2, K/C

<400> 199

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 201

Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-C08, CDR-L3, K/C

<400> 202

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-E06b, CDR-L3, K/C

<400> 203

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-H04b, CDR-L3, K/C

<400> 204

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Gln Gln Tyr Asn Leu Tyr Pro Leu Thr

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1275-D01, CDR-L3, K/C

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Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1275-D10, CDR-L3, K/C

<400> 207

Gln Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Leu Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1275-G02, CDR-L3, K/C

<400> 208

Gln Gln Tyr Asn Ala Tyr Pro Leu Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A04, CDR-L3, K/C

<400> 209

Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 210

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A05, CDR-L3, K/C

<400> 210

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A06, CDR-L3, K/C

<400> 211

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Gln Gln Tyr His Thr Tyr Pro Leu Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A08, CDR-L3, K/C

<400> 213

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1193-B06, CDR-L3, K/C

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Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A10, CDR-L3, K/C

<400> 215

Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Leu Thr

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 216

Gln His Asn Gln Pro Thr Pro Pro Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-E08, CDR-L3, K/C

<400> 217

Gln Gln His Asn Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1447-F11, CDR-L3, K/C

<400> 218

Gln Gln His Gln Thr Ala Pro Pro Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 219

Gln Gln Gln Cys Ser Trp Pro Pro Thr

1 5

<210> 220

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: VL-5[23] & VL6-[26], CDR-L3, K/C

<400> 220

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 221

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Gly Asn

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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Gly Ile Ile Tyr Gly Thr Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Lys Pro Ser Met Ser Gly Ser Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly

130 135 140

Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala

145 150 155 160

Gly Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

180 185 190

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

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Glu Ile Lys

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<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Asn

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Gly Asp Asp Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Arg Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ile Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ala Leu Gly Arg Pro Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly

130 135 140

Thr Leu Ser Leu Thr Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

180 185 190

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

225 230 235 240

Glu Ile Lys

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Thr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Gly Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Lys Phe Glu Asn Glu Trp Glu Val Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly

130 135 140

Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

180 185 190

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

225 230 235 240

Glu Ile Lys

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<211> 242

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Gly Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Lys Pro Ser Ala Pro Gly Ala Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly

130 135 140

Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser

145 150 155 160

Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly

165 170 175

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly

180 185 190

Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220

Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

225 230 235 240

Ile Lys

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Thr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ile Asn Gly Ser Gly Gly Ser Ser Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Glu Thr Glu Trp Glu Val Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly

130 135 140

Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

180 185 190

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln His Asn Gln Pro Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

225 230 235 240

Glu Ile Lys

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<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Thr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Met Ile Asn Gly Ala Gly Gly Ala Ser Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Phe Glu Asn Gln Trp Glu Val Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly

130 135 140

Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Gln Arg Val Ala Gly Ile Asp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

180 185 190

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln His Asn Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

225 230 235 240

Glu Ile Lys

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<211> 243

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Thr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Gly Ser Gly Gly Val Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Glu Ser Glu Trp Glu Val Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly

130 135 140

Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Gln Ser Val Tyr Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

180 185 190

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln His Gln Thr Ala Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

225 230 235 240

Glu Ile Lys

<210> 228

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<400> 228

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Ser

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<220>

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Gly Ile Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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65 70 75 80

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Ser Trp

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

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65 70 75 80

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1337-A10, VL

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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 272

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20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 273

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1 5 10 15

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65 70 75 80

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<210> 274

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 274

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Asn

20 25 30

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Gly Ile Ile Asn Gly Asp Asp Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Arg Val

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115 120

<210> 275

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 275

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Thr

20 25 30

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Gly Ile Ile Asn Gly Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

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<211> 120

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 277

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

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20 25 30

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 278

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

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180 185 190

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195 200 205

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Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

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Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

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Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

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Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

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Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

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Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 308

<211> 454

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 1251-B10, HC

<400> 308

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1 5 10 15

Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Ser Ser

20 25 30

His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Ala Val Ile Trp His Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Gly Thr Arg Val Leu Gly Ala Val Tyr Gly Leu Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 309

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: Fc 恒定, Fc 恒定

<400> 309

Ala Ala Gly Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

1 5 10 15

Cys Pro Pro Cys Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe

20 25 30

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

35 40 45

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

50 55 60

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

65 70 75 80

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

85 90 95

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

100 105 110

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

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