Syndecan-1作为标志物在急性缺血性中风静脉溶栓患者预后评估中的应用

摘要

本发明公开了一种用于急性缺血性中风静脉溶栓患者的早期诊断、病情进展的判断以及预后评估的标志物为外周血中的Syndecan‑1。本发明提供了用于检测外周血中的Syndecan‑1的物质在制备用于急性缺血性中风静脉溶栓患者预后早期诊断的产品中的应用；或在制备判断急性缺血性中风静脉溶栓患者病情进展的产品中的应用；或在制备评估急性缺血性中风静脉溶栓患者预后的产品中的应用。研究结果表明，血浆Syndecan‑1水平代表了一种新的、独立的预后标志物，可以改善急性缺血性中风溶栓患者目前的风险分层。通过血液检查方法检查容易被受检者接受，更可成为急性缺血性中风静脉溶栓患者的早诊、病情进展的判断以及预后评估的有效手段。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及糖萼裂解物Syndecan-1作为标志物在急性缺血性中风静脉溶栓患者预后评估中的应用。

背景技术

美国心脏协会报告指出缺血性中风是导致残疾的主要原因，也是仅次于心脏病和癌症的第三大死亡原因，全世界约有550万人死亡，其中三分之二在发展中国家。此外，每年有数百万缺血性中风幸存者不得不适应日常生活活动受到限制的生活，其中许多人依赖他人的支持才能生存。在病理学上，tPA与神经毒性(尤其是由兴奋性氨基酸受体激活引起的细胞损伤)有关。越来越多的证据表明，tPA介导了脑缺血引起的血脑屏障通透性增加。动物实验也证实用tPA治疗会诱导Evans蓝染料外渗，并且该过程与基质金属蛋白酶9的表达和活性增加有关，并且可能参与后期神经毒性的过程。

急性缺血性中风(Acute ischemic stroke，AIS)的有效治疗方法是恢复血流灌注不足的脑区。这种方法称为再灌注治疗，必须尽快开始。重组组织纤溶酶原激活剂(rt-PA)是美国食品和药物管理局(FDA)批准的唯一一种治疗缺血性中风的化学疗法。在国家神经疾病和中风研究所(National Institute of Neurological Disorders and Stroke，NINDS)进行的一项研究中，在急性缺血性中风症状出现后的3小时内用tPA治疗可以使11-13％预后良好的患者数量增加，并且降低3个月时残疾和死亡患者的数量。但是rt-PA也有不利的影响，在临床上，主要表现为溶栓治疗后的脑水肿或颅内出血。越来越多的证据表明，tPA介导了脑缺血引起的血脑屏障通透性增加。动物实验也证实用tPA治疗会诱导Evans染料外渗，并且该过程与MMP-9的表达和活性增加有关，并且可能参与后期神经毒性的过程。

最近，内皮糖萼(Endothelial glycocalyx，EG)被定义为扩展的神经血管单元的一个组成部分，它在维持适当的神经元稳态方面有重要作用。作为一种表面涂层，EG在血液和血管之间形成一道屏障。EG的损伤似乎是BBB功能障碍的第一步。EG主要由蛋白聚糖(PG)及其连接的糖胺聚糖(GAG)链共同组成。Syndecans是跨膜蛋白硫酸乙酰肝素糖蛋白家族的成员，它们主要表达于包括血管内皮细胞在内的细胞表面。此外，它们完整的胞外结构域可以脱落到细胞外环境中。Syndecan-1被认为是糖萼的重要组成部分，因此，其表达或分布的改变可能影响糖萼的完整性以及内皮屏障功能，血液中Syndecan-1水平升高可能是糖萼降解的标志。有研究发现Syndecan-1-/-的小鼠糖萼厚度明显减少。因此我们选择Syndecan-1作为糖萼损伤的主要标记物，探讨急性缺血性中风溶栓后糖萼损伤情况，以确定可能有助于早期诊断和预测AIS溶栓后预后的潜在生物标志物。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于评估急性缺血性中风静脉溶栓患者预后的早期诊断、病情进展判断的预后评估的标志物。

本发明所提供的用于急性缺血性中风静脉溶栓患者预后的早期诊断、病情进展的判断的预后评估的标志物为外周血中的糖萼裂解物Syndecan-1。

本发明还提供了用于检测外周血中的糖萼裂解物Syndecan-1的物质在制备用于急性缺血性中风静脉溶栓患者预后的早期诊断和/或辅助诊断的产品中的应用。

本发明还提供了用于检测外周血中的糖萼裂解物Syndecan-1的物质在制备判断和/或辅助判断急性缺血性中风静脉溶栓患者预后的病情进展的产品中的应用。

本发明还提供了用于检测外周血中的糖萼裂解物Syndecan-1的物质在制备评估和/或辅助评估急性缺血性中风静脉溶栓患者预后的产品中的应用。

其中，所述评估和/或辅助评估急性缺血性中风静脉溶栓患者预后进一步可为评估和/或辅助评估急性缺血性中风溶栓患者3个月的预后。

所述产品为试剂盒。

所述试剂盒还包括记载有如下判断标准的载体：急性缺血性中风静脉溶栓患者血浆中Syndecan-1≥102.82ng/ml，则判定3个月的急性缺血性中风溶栓患者预后不良。

本发明还保护一种产品，包括用于检测外周血中的糖萼裂解物Syndecan-1的物质；所述产品的功能为如下(a)、(b)或(c)：

(a)用于急性缺血性中风静脉溶栓患者预后的早期诊断和/或辅助诊断；

(b)判断和/或辅助判断急性缺血性中风静脉溶栓患者预后的病情进展；

(c)评估和/或辅助评估急性缺血性中风静脉溶栓患者预后。

所述产品为试剂盒。

本发明还保护外周血中的糖萼裂解物Syndecan-1作为标志物的应用；所述标志物为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)：

(Ⅰ)用于急性缺血性中风静脉溶栓患者预后的早期诊断和/或辅助诊断的标志物；

(Ⅱ)判断和/或辅助判断急性缺血性中风静脉溶栓患者预后的病情进展的标志物；

(Ⅲ)评估和/或辅助评估急性缺血性中风静脉溶栓患者预后的标志物。

本发明还保护一种评估和/或辅助评估急性缺血性中风静脉溶栓患者预后的方法，包括如下步骤：检测待测患者外周血中的糖萼裂解物Syndecan-1的浓度；外周血中的糖萼裂解物Syndecan-1浓度低的患者预后好于外周血中的糖萼裂解物Syndecan-1浓度高的患者。

本发明还保护一种判断和/或辅助判断急性缺血性中风静脉溶栓患者病情进展的方法，包括如下步骤：检测待测患者外周血中的糖萼裂解物Syndecan-1的浓度；外周血中的糖萼裂解物Syndecan-1浓度高的患者病情进展快于外周血中的糖萼裂解物Syndecan-1浓度低的患者。

用于检测外周血中Syndecan-1的物质为用于检测外周血中Syndecan-1的蛋白含量和/或蛋白丰度所需的物质，如可包括能特异识别Syndecan-1蛋白质的物质，如抗体。

本发明的研究发现：血浆Syndecan-1水平代表了一种新的、独立的预后标志物，可以改善急性缺血性中风溶栓患者目前的风险分层。我们通过血液检查方法检查容易被受检者接受，更可成为急性缺血性中风静脉溶栓患者的早诊、病情进展的判断以及预后评估的有效手段。我们的研究结果为临床应用和基础研究提供了重要线索。

附图说明

图1为血浆中Syndecan-1蛋白水平在不同人群亚组中的比较及Syndecan-1水平与中性粒/淋巴细胞比值的相关性分析。Control为健康人对照组，AIS为急性缺血性卒中静脉溶栓患者组。*P≤0.05*，*P≤0.001与Control组比较。

图2为以新旧模型中影响急性缺血性中风溶栓患者不良预后的危险因素形成的预测模型被以示例列线图。

图3为DCA曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

实施例1、

一、具体实验方法及数据

1.研究方法

1)研究对象：选择2018年9月～2019年5月就诊于首都医科大学宣武医院的发病24小时内的急性缺血性中风患者345例，接收rt-PA静脉溶栓治疗的急性缺血性中风患者145例，因病历资料或者随访资料不全、血样溶血等原因剔除32例，113例AIS溶栓患者入组行相关检测，4例患者血浆检测异常值被剔除，最终109例AIS溶栓患者纳入本研究分析。经过年龄和性别匹配，47例健康个体同时被纳入研究。我们的研究经过了首都医科大学宣武医院伦理委员会的批准。

2)纳入标准如下：患者符合中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010的诊断标准；2)颅脑CT无明显低密度改变；3)患者及家属知情同意并签署知情同意书；4)有明确神经功能缺损；5)发病<4.5h；6)病例资料及随访资料完整。

3)排除标准：1)既往脑梗死；2)患有出血性疾病；3)合并恶性肿瘤、血液疾病、严重感染等；4)妊娠、癫痫、精神类疾病、凝血功能障碍、肝肾功能不全等。

4)临床病历资料和血样收集：AIS患者溶栓用药使用rt-PA，即按0.9mg/kg剂量给药，1min内静脉注射药物总量的10％，其余90％在1h内微泵静脉泵入，最大剂量<90mg。收集患者的一般临床资料，包括人口统计学特征(年龄、性别、BMI)、既往史、吸烟史，入院后血压、血糖、血c-reactive protein(CRP)、血Homocysteine(HCY)，部分血常规和部分血生化指标等。卒中分型简单分为大血管型、小血管型、其它型。神经功能缺损严重程度用NIHSS评分(National Institutes of Health Stroke Scale)评估；3个月的临床预后评分使用mRS(modified Rankin Scale)。mRS为0-2分定义为预后良好，mRS为3-5分和死亡被定义为预后不良。采用EDTA管收集患者血样，离心后分离的血浆保存在-80℃冰箱。

5)血浆Syndecan-1检测：血浆Syndecan-1检测应用Human Syndecan-1的ELISA试剂盒(货号：ab46506；批号：GR3368280-5)。操作按试剂盒说明书进行。测定仪器为Bio-TekElx800酶标仪。如果样品浓度超出检测范围的上限值，将样品进行梯度稀释后再进行检测。

6)统计分析：采用SPSS 22.0软件(IBM Corp.,Armonk,NY,USA)和R软件(版本4.1.1)做统计学分析。连续变量如果符合正态分布用平均值±标准差，并使用t检验或者方差分析进行检验。非正态分布变量用中位数[四分位距(IQR)]表示，并使用Mann-Whitney U检验。相关性分析应用Spearman相关系数表示。分类资料用频数(％)表示，组间比较应用卡方检验。多因素的预后分析应用二分类的Logistic回归分析。模型变量筛选的方法通过LASSO回归筛选，主要包括lambda.min和lambda.1se，回归系数非0的变量纳入最终模型。p<0.05表示有统计学意义。

2.研究结果

1)急性缺血性中风患者和健康个体临床基线资料比较。

我们首先将AIS患者和健康个体进行一般临床资料的比较，AIS患者108例，健康对照组47例，两组在年龄、性别等人口统计学指标上无明显统计学差异。分离AIS患者和健康对照组外周血浆进行ELISA检测，结果显示与健康人相比，AIS患者血浆Syndecan-1蛋白的水平明显升高(t＝3.066，P＝0.0026，图1A)。

2)不同预后急性缺血性中风溶栓临床基线资料分析。

根据3个月时mRS评分将108例AIS溶栓患者分为预后不良和预后良好2组。108例患者中，39例(36.11％)预后不良，29例(74.36％)是男性。预后不良患者主要发生在老年人、房颤患者、高CRP水平者、机械取栓、入院血糖水平高、高中性粒细胞计数、高中性粒/淋巴细胞、高NIHSS评分、高血Syndecan-1；在卒中发病类型方面，大血管病变患者预后更差，相比来说，小血管病变患者预后相对好(p<0.10，表1)。

表1 AIS静脉溶栓患者临床一般资料分析

IQR(interquartile range),四分位数间距；HCY(homocysteine):同型半胱氨酸；CRP(C-reactive protein):C反应蛋白；HDL(high-density lipoprotein):高密度脂蛋白；LDL(low-density lipoprotein):低密度脂蛋白；TC(triglyceride):甘油三酯；sICH(symptomatic intracranial hemorrhage):症状性颅内出血.

3)血浆升高的Syndecan-1与急性缺血性中风患者预后及其它相关指标的相关性分析

将周围血浆Syndecan-1分别进行亚组分析，结果发现预后不良组的血浆Syndecan-1明显高于预后良好组(t＝3.066,p＝0.003，图1B，表1),并且健康个体组明显低于预后不良组(t＝5.007,p<0.001，图1B)，机械取栓患者组的Syndecan-1水平明显高于非机械取栓患者(t＝2.335，p＝0.0214，图1C)。此外，相关性分析表明，Syndecan-1水平与Neutrophil-to-lymphocyte ratio(中性粒细胞与淋巴细胞比值)(p＝0.011，图1D)呈正相关。

4)血浆Syndecan-1水平可以独立和联合预测AIS溶栓患者的不良预后

调整年龄、NIHSS评分、房颤病史、是否机械取栓、血CRP、卒中类型、Syndecan-1水平自变量后，行二分类的Logistics回归分析(模型2)，Syndecan-1水平仍然可以预测AIS溶栓患者的不良预后(p<0.001，表2)。多变量校正后，Syndecan-1水平的OR(95％CI)是1.022(1.009-1.035)。基于ROC曲线，血浆Syndecan-1水平的最佳cutoff值作为预后不良的结果为102.82ng/ml，产生的灵敏度为92.3％，特异性为49.3％。根据cutoff值，将Syndecan-1分为≥102.82ng/ml和<102.82ng/ml两部分。当Syndecan-1作为连续性变量时，及Syndecan-1≥102.82ng/ml(OR，34.551；95％CI，5.408-220.732)均与3个月的急性缺血性中风溶栓患者预后不良相关(表2)。

表2 Syndecan-1单独和联合预测AIS溶栓患者预后

MODEL 2：因变量，3个月mRS>2；校正因素包括年龄、NIHSS评分、房颤病史、是否机械取栓、血CRP、卒中类型、Syndecan-1(纳入模型的变量由lasso回归筛选得到)。MODEL 1：因变量，3个月mRS>2；自变量为Syndecan-1(&,continuous variable；#,categoricalvariable)。

5)AIS溶栓患者外周血浆中Syndecan-1提高传统临床模型预测风险效能

以预后不良为因变量，LASSO回归筛选出的变量(年龄、NIHSS评分、房颤病史、是否机械取栓、血CRP、卒中类型、Syndecan-1)为自变量的Model New，相比Model New无Syndecan-1这个指标变量的为Model Old，分别行二分类的Logistic回归分析，结果显示在Model Old中，NIHSS评分、房颤病史、高的CRP水平是影响预后的危险因素(p<0.05,表3)；在新模型中，年龄、NIHSS评分、房颤病史、血浆高的Syndecan-1水平是影响预后的危险因素(p<0.05,表3)。

表3 AIS溶栓患者外周血浆中Syndecan-1提高传统临床模型预测风险效能

6)急性缺血性中风静脉溶栓预后的Nomogram图

以新旧模型中影响急性缺血性中风溶栓患者不良预后的危险因素形成的预测模型被以示例列线图形式呈现(图2)。Model New列线图在评估AIS溶栓患者预后方面被证实有较好的精确性，未经校正的C指数是0.935(95％CI，0.888-0.981)，bootstrap-corrected的C指数是0.898。Model old的未经校正的C指数是0.884(95％CI,0.815-0.954)，bootstrap-corrected的C指数是0.846。说明Model New的预测效能较Model old更好。

7)临床应用

决策曲线分析(Decision Curve Analysis,DCA)，通过量化数据集中不同阈值概率下的净获益来确定预后列线图的临床实用性。决策曲线中，图中的两条曲斜线分别代表Model New和Model Old。决策曲线显示，使用增加Syndecan-1指标的Model New的列线图预测AIS溶栓患者预后比传统预测模型增加更多益处(图3)。提示Model New列线图具有较高的临床应用价值。

结论：通过以上研究结果发现，急性缺血性中风静脉溶栓及预后不良患者外周血浆中Syndecan-1分子蛋白表达水平显著升高，且急性缺血性中风静脉溶栓患者外周血浆中Syndecan-1表达水平可以单独或联合预测患者3个月不良结局风险。对比旧的临床模型，加入外周血浆Syndecan-1蛋白表达水平因素后，能够显著提升的诊断效能。综上所述，血浆Syndecan-1水平代表了一种新的、独立的预后标志物，可以改善急性缺血性中风溶栓患者目前的风险分层。我们通过血液检查方法检查容易被受检者接受，更可成为急性缺血性中风静脉溶栓患者的早诊、病情进展的判断以及预后评估的有效手段。我们的研究结果为临床应用和基础研究提供了重要线索。