Pak3抑制剂在治疗瑞芬太尼诱发的切口痛觉过敏中的应用

摘要

本发明公开了Pak3抑制剂在治疗瑞芬太尼诱发的切口痛觉过敏中的应用。本发明实验证明，发现FRAX597可抑制瑞芬太尼诱发的切口痛觉过敏。因此本发明提供了一种治疗瑞芬太尼诱发的切口痛觉过敏的新途径。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及Pak3抑制剂在治疗瑞芬太尼诱发的切口痛觉过敏中的应用。

背景技术

阿片类药物是临床治疗急、慢性疼痛及癌痛的最重要的镇痛药物，临床用药量极大，但它们在镇痛的同时还能够激活体内的促伤害感受机制，表现为机体对伤害性刺激的反应性增强，镇痛药物需求量增加，即阿片类药物诱发的痛觉过敏(opioid-inducedhyperalgesia,OIH)。瑞芬太尼是一种超短效的μ-阿片受体激动剂，由于它具有起效快、清除快、无蓄积、代谢不依赖于肝肾功能等优点广泛应用于临床术中镇痛。但是，瑞芬太尼诱发术后痛觉过敏(remifentanil-induced postoperative hyperalgesia，RIH)的发生率远高于其他阿片类镇痛药物，高达85％。另有一项研究发现，手术时间超过2小时的患者，RIH的发生率为32.7％，累计输注量超过30μg/kg时，RIH的发生率甚至高达41.8％。RIH的主要特征为瑞芬太尼以0.05～0.3μg/kg/min的速度输注60～90min后出现术后切口疼痛的程度和范围增加，以及阿片类镇痛药需求增加。RIH不仅降低了药物的镇痛效果，还促进了痛觉感知，产生异常疼痛，甚至引发术后慢性疼痛的发生，患者对阿片类药物剂量需求越来越大，不仅增加住院时间、医疗费用、占用医疗资源，最关键的是增加了患者的身心创伤，加重了患者的痛苦，严重影响了患者的生活质量。目前，临床无有效的治疗措施，主要是因为其发生机制目前尚不清楚，因此，深入阐明瑞芬太尼诱发痛觉过敏的发病机制和寻找有效治疗策略是当务之急。

发明内容

根据本发明的一个方面，本发明提供了抑制Pak3的试剂在制备预防或治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏的药物中的应用。

进一步，所述阿片类药物是瑞芬太尼。

进一步，所述痛觉过敏包括机械痛觉过敏和热痛觉过敏。

进一步，抑制Pak3的试剂包括抑制Pak3表达的试剂、抑制Pak3蛋白活性的试剂。

本发明的抑制Pak3的试剂不受限制，只要所述试剂能够抑制Pak3或涉及Pak3的上游或下游途径的物质的表达或活性即可。

进一步，Pak3表达的试剂包括抑制Pak3基因mRNA表达的试剂、抑制Pak3蛋白表达的试剂。

进一步，抑制Pak3基因mRNA表达的试剂包括反义核酸、dsRNA、核酶、适体。

“反义核酸”指含有与编码HCK的mRNA互补的序列的核酸。反义核酸可以由DNA、RNA或二者组成。反义核酸不需要与靶基因的mRNA 100％互补。反义核酸可含有非互补碱基，只要它能够在严格条件下特异性杂交即可。当将反义核酸引入细胞时，它结合靶多核苷酸并抑制转录、RNA加工、翻译或稳定性。除反义多核苷酸之外，反义核酸还包括多核苷酸模拟物，它含有经过修饰的主链、和3′和5′端部分。这样的反义核酸可以根据HCK序列信息来恰当设计并使用本领域技术人员公知的方法来生成。

“dsRNA”指含有双链RNA结构，通过RNA干扰(RNAi)来抑制基因表达的RNA，包括siRNA(短干扰RNA)和shRNA(短发夹RNA)。dsRNA不需要与靶基因序列具有100％的同源性，只要它可抑制靶基因表达即可。为了稳定化或其它目的，可以将dsRNA的一部分用DNA替代。优选的是，siRNA是21-23个碱基的双链RNA。siRNA可以通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合成或作为天然存在RNA的类似物。shRNA是具有发夹转角(hairpinturn)结构的短链RNA。shRNA可以通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合成或通过将编码shRNA的DNA引入细胞并表达DNA。

“核酶”指具有催化活性的RNA，它能够切割、粘贴、插入、和转移RNA。核酶的结构可以包括锤头、发夹等。

“适体”指结合某物质诸如蛋白质的核酸。适体可以是RNA或DNA。核酸的形式可以是双链或单链。适体的长度无限制，只要它能够特异性结合靶分子即可，可以由例如10至200个核苷酸、优选10至100个核苷酸、更优选15至80个核苷酸、进一步更优选15至50个核苷酸组成。适体可以使用本领域技术人员公知的方法来选择。例如，可以采用SELEX(通过指数式富集进行的配体的系统进化)。

进一步，抑制Pak3蛋白表达的试剂包括与Pak3蛋白特异性结合的抗体。

进一步，所述Pak3蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述Pak3蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与Pak3蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

进一步，抑制Pak3蛋白活性的试剂包括Pak3活性抑制剂。

在本发明的具体实施方案中，Pak3活性抑制剂是FRAX597。

进一步，所述药物还包括药学上可接受的载体。

进一步，所述药物包括针对前面所述的标志物表达的干扰RNA，或者负调控miRNA、负调控型的转录调控因子、或抑制型靶向小分子化合物。

本发明的药物可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的药物可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的药物施用于人，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

在本发明的上下文中，“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由RNA或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cDNA，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。

附图说明

图1显示Pak3对瑞芬太尼输注后切口痛觉敏感影响的结果图，其中A：缩足频率；B：缩足潜伏期；n＝10；***P<0.001，与NS组相比；$$$P<0.001，与RI组相比；two-wayANOVA；

图2显示Pak3表达结果图，其中A：免疫印迹图；B：柱状统计图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例Pak3与瑞芬太尼诱发的切口痛相关性研究

一、实验步骤

(1)实验分组：雄性C57BL6小鼠40只，1月龄，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。采用随机数字表法分为3组(n＝10)：

DMSO+生理盐水组(NS组)，经腹腔持续输注与瑞芬太尼等容量的生理盐水60min；

DMSO+瑞芬太尼+切口痛组(RI组)：在注射瑞芬太尼之前10min腹腔注射0.1％DMSO，经腹腔持续输注瑞芬太尼1μg·kg

FRAX597+瑞芬太尼+切口痛组(F+RI组)：在注射瑞芬太尼之前10min腹腔注射FRAX597100mg/kg(MedChemExpress，HY-15542A，美国)，经腹腔持续输注瑞芬太尼1μg·kg

(2)切口痛模型制作：小鼠吸入2％七氟醚麻醉，消毒左后足，从足底近端0.2cm处向趾部做长约0.5cm的纵行切口，切开皮肤后，用眼科镊挑起足底肌肉并纵行分离至骨膜，保持肌肉起止和附着完整。按压止血后，以4-0丝线缝合皮肤。切口皮肤不能重叠、内翻、裂开。术后伤口用碘伏消毒，并涂抹少量红霉素软膏预防感染。

(3)行为学实验：于输注瑞芬太尼前24h(T0)、输注停止后2、6、24和48h(T1-4)时测定热刺激缩足潜伏期(PWL)和机械刺激缩足频率(PWF)，实验室温度18～22℃，安静。采用红外足底测痛仪(IICT Life Science 390)测定PWL，记录从左后足接触热板至出现回缩、踮脚、挣扎、嘶叫、舐足任一反应的时间为PWL，连续测定3次，间隔5min，取平均值作为PWL(sec)。为防止烫伤鼠爪，PWL上限定设置为20s。将大鼠置于20cm×20cm×20cm的金属笼内，30min后，以BSEVF3 von Frey纤维丝0.4g(HarvardApparatus公司，美国)刺激右后足2、3趾骨间，垂直施加压力，记录出现快速缩足反应、舔舐右足或嘶叫时压力，连续测定10次，间隔1min，取缩足频率为PWF(％)。

(4)Western Blot：于最后1次行为学测定结束后，处死小鼠，取L3-5背根神经节，采用Western Blot法测定蛋白的表达。L3-5背根神经节组织加入预冷的组织蛋白裂解液，研磨成组织匀浆。将匀浆液4℃离心5min，12000rpm，离心半径10cm，上清液即为脊髓组织总蛋白。用膜蛋白提取试剂盒(Thermo公司，美国)，按照说明书进行具体操作提取膜蛋白。使用PAK3 Polyclonal Antibody(ThermoFisher，PA5-112638，美国)，按照说明书的指南进行实验测定Pak3表达。

(5)统计学分析：采用SPSS 18.0统计学软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示，随机区组设计的计量资料比较采用单因素方差分析，重复测量设计的计量资料比较采用重复测量设计的方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

二、实验结果

1)瑞芬太尼输注加剧了术后机械和热痛觉过敏

与DMSO+生理盐水(NS)组输注相比，DMSO+瑞芬太尼+切口痛(RI)组以1μg·kg

(2)瑞芬太尼输注和切口增加了背根神经节Pak3的表达

在瑞芬太尼和切口疼痛模型后48h，处死小鼠去背根神经节，在Western Blot结果发现Pak3蛋白表达明显增加(P<0.001，图2)。以上结果表明，瑞芬太尼输注后的痛觉过敏与背根神经节中Pak3表达增加有关。

(3)用FRAX597抑制Pak3活性可以减低Pak3的蛋白表达水平(P<0.001，图2)。提示Pak3可以调控AMPAR参与的神经兴奋性突触的突触可塑性调控，而这是瑞芬太尼痛觉过敏的神经病理生理基础。另外FRAX597可以明显的降低瑞芬太尼切口痛诱发的机械痛觉过敏和热痛觉过敏，提示FRAX597的潜在镇痛特性。

(4)FRAX597可抑制术后机械和热痛觉过敏

结果如图1所示，FRAX597加入可导致缩足频率(PWF)显著降低和缩足潜伏期(PWL)显著升高(所有P<0.001)。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。