PD-L1中和抗体对痛风炎症作用机理的研究方法

摘要

本发明公开了PD‑L1中和抗体对痛风炎症作用机理的研究方法，包括以下步骤，S1：选择实验动物，并将实验动物随机分成正常组、模型组、实验组和同型对照组；S2：制备单钠尿酸盐晶体悬浊液；S3：对实验组动物尾静脉注射anti‑PD‑L1中和抗体；S4：对同型对照组动物尾静脉注射IgG2b；S5：对模型组、实验组和同型对照组动物制备急性痛风性关节炎模型；S6：观察分析对比正常组、模型组、实验组和同型对照组动物的生理指标；S7：根据步骤S6中的分析结果对PD‑L1中和抗体对痛风炎症作用机理进行研究。通过本发明中的研究可以得出，PD‑L1特异性的中和抗体治疗可以显著缓解动物模型中的痛风发作，为靶向PD‑L1用于痛风的临床治疗提供研究基础。

说明书

技术领域

本发明涉及痛风炎症研究技术领域，尤其涉及PD-L1中和抗体对痛风炎症作用机理的研究方法。

背景技术

痛风是由尿酸盐晶体沉积在关节和非关节等软组织部位所引起的炎症性疾病，其临床表现为累及下肢关节的极度疼痛等。遗传和代谢等因素可以导致血液中累积较高浓度的尿酸，在一些生理变化和外界条件的刺激下，高浓度的尿酸析出尿酸盐晶体并沉积在相关组织。沉积的尿酸盐可以和其它因素一起协同激活NLRP3炎症小体，产生活性的前炎性细胞因子IL-1β等启动痛风炎症，NLRP3炎症小体的活化还会进一步导致细胞焦亡以及其它类型的细胞死亡。焦亡或死亡细胞的内容物被释放到周围环境，其中包含大量的DAMP，这些DAMP会进一步激活免疫反应导致更剧烈的炎症，造成痛风发作期的极度疼痛表现。

PD-1/PD-L1通路是目前主流的免疫检验点，临床上有多个靶向的抗体用于抗肿瘤治疗，但其对痛风的研究目前较少，尚没有针对PD-1/PD-L1在痛风中的治疗方案。最新研究表明PD-1/PD-L1通路参与尿酸盐晶体介导的NLRP3炎症小体活化，PD-L1抗体具有治疗痛风疾病的潜力。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种PD-L1中和抗体对痛风炎症作用机理的研究方法，可对PD-L1中和抗体用于痛风治疗的研究提供前期研究基础。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

PD-L1中和抗体对痛风炎症作用机理的研究方法，其特征在于，包括以下步骤，

S1：选择实验动物，并将实验动物随机分成正常组、模型组、实验组和同型对照组；

S2：制备单钠尿酸盐晶体悬浊液；

S3：对实验组动物尾静脉注射anti-PD-L1中和抗体；

S4：对同型对照组动物尾静脉注射IgG2b；

S5：对模型组、实验组和同型对照组动物制备急性痛风性关节炎模型；

S6：观察分析对比正常组、模型组、实验组和同型对照组动物的生理指标；

S7：根据步骤S6中的分析结果对PD-L1中和抗体对痛风炎症作用机理进行研究。

进一步的，步骤S1中所述的实验动物为雄性小鼠，所有小鼠都饲养在无病原体的动物设施中，任意提供无菌水和食物，并在8-12周龄时用于实验。

进一步的，步骤S2的具体操作包括以下步骤，

S201：将10mg/mL尿酸盐溶解在0.01M NaOH溶液中，得到过饱和尿酸溶液；

S202：采用0.45μm滤膜过滤过饱和尿酸溶液，并在室温下干燥48小时，得到单钠尿酸盐晶体；

S203：将单钠尿酸盐晶体用100％乙醇洗涤并超声处理，得到单钠尿酸盐晶体悬浊液。

进一步的，步骤S6的具体操作包括以下步骤，

S601：造模前及造模后12h，观察记录各组小鼠的关节肿胀及活动情况；

S602：造模前及造模后12h，眼眶后静脉丛采血检测炎症因子水平差异；

S603：将小鼠踝关节滑膜组织经过常规处理后，进行HE染色，用显微镜观察踝关节滑膜组织病理形态改变。

本发明的有益效果是：

本发明中通过对PD-L1中和抗体对痛风炎症作用机理的研究可以得出，小鼠痛风模型中对PD-L1进行抗体阻断显著的抑制了小鼠对踝关节注射尿酸盐的炎症反应，小鼠的关节红肿程度以及体内炎症水平显著降低；由此可得，PD-L1特异性的中和抗体治疗可以显著缓解动物模型中的痛风发作，为靶向PD-L1用于痛风的临床治疗提供研究基础。

附图说明

图1为本发明中各组小鼠NLRP3、pro-IL-1β表达和炎症因子IL-1分泌情况对照图；

图2为本发明中各组小鼠关节红肿情况对照图；

图3为本发明中显微镜下各组小鼠HE切片中炎性细胞对照图；

图4为小鼠分离的骨髓巨噬细胞在PD-L1抗体阻断下，NLRP3、pro-IL-1β表达和炎症因子IL-1分泌情况对照图。

具体实施方式

为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。

PD-L1中和抗体对痛风炎症作用机理的研究方法，包括以下步骤，

S1：选择实验动物，并将实验动物随机分成正常组、模型组、实验组和同型对照组；

具体的，实验动物选用C57/BL6雄性小鼠，购自杭州子源实验动物科技有限公司；所有小鼠都饲养在无病原体的动物设施中，任意提供无菌水和食物，并在8-12周龄时用于实验，中科大附属第一医院动物伦理委员会批准了所有程序。

将20只小鼠，随机分为正常组(NC组)、模型组(MSU组)、实验组(anti-PD-L1组)，同型对照组(IGg组)，每组5只小鼠。分别完成四组小鼠编号，并将小鼠固定后，用记号笔在每只小鼠右后踝关节正中部位画一圈作标记。

进一步的，步骤S2：制备单钠尿酸盐晶体悬浊液；

具体的，S201：将10mg/mL尿酸盐(Sigma-Aldrich)溶解在0.01M NaOH(pH 7.1)溶液中，得到过饱和尿酸溶液；

S202：采用0.45μm滤膜过滤过饱和尿酸溶液，并在室温下干燥48小时，得到单钠尿酸盐(MSU)晶体；

S203：将MSU晶体用100％乙醇洗涤并超声处理以减小其尺寸，得到MSU晶体悬浊液。

进一步的，步骤S3：对实验组动物尾静脉注射anti-PD-L1中和抗体；

具体的，对实验组每只小鼠尾静脉注射InVivoMAb anti-mouse PD-L1(B7-H1)中和抗体100μg(克隆号：10F.9G2，cat#BE0101，5mg，7.29mg/ml)；

进一步的，步骤S4：对同型对照组动物尾静脉注射IgG2b；

具体的，对同型对照组每只小鼠尾静脉注射InVivoMAb Rat IgG2b isotypecontrol(Bioxcell#BE0090-5MG)100μg，用以排除抗体本身对动物的干扰。

进一步的，步骤S5：对模型组、实验组和同型对照组动物制备急性痛风性关节炎模型；

具体的，将模型组(MSU组)、实验组(anti-PD-L1组)、同型对照组(IGg组)小鼠均选右后踝关节外侧后方为穿刺点，踝关节尽量屈曲90度，用碘伏局部消毒后，针口斜面朝前上方，每只小鼠均选用4号针头向沿跟腱内侧30°-40°向下刺入关节腔注射MSU溶液(100μL100mg/mL MSU)。以上过程严格按照无菌操作，以关节囊对侧鼓起为注入标准。

正常组(NC组)用相同剂量的生理盐水同法注射，注入标准以关节囊对侧鼓胀为注入标准。

进一步的，步骤S6：观察分析对比正常组、模型组、实验组和同型对照组动物的生理指标；

具体的，S601：造模前及造模后12h，观察记录各组小鼠的关节肿胀及活动情况，结果如下表1和表2所示。

表1造模前小鼠的关节肿胀及活动情况

表2造模后12h小鼠的关节肿胀及活动情况

通过实验观察可知，与正常组(NC组)相比，造模后12h明显观察到模型组(MSU组)小鼠踝关节肿胀，皮温升高，关节活动受限，证明造模成功。

与模型组(MSU组)相比，造模后12h，同型对照组(IGg组)小鼠踝关节肿胀，关节活动受限；而实验组(anti-PD-L1组)小鼠关节红肿程度较轻，由此说明，使用anti-PD-L1中和抗体能够使小鼠的关节红肿程度明显降低。

S602：造模前及造模后12h，眼眶后静脉丛采血检测炎症因子水平差异，采用ELISA法检测小鼠模型IL-1β血清水平，采用WB法检测NLRP3和pro-IL-1β的蛋白表达，结果如附图1所示，在附图1中，A为NLRP3和pro-IL-1β的蛋白表达结果，B为IL-1β血清水平对照结果。

从附图1中可以看出，与正常组(NC组)相比，造模后12h明显观察到模型组(MSU组)，NLRP3和pro-IL-1β的蛋白表达上调，对应的炎症因子IL-1β显著升高，证明NLRP3炎症小体被激活，炎症成功被诱导。

与模型组(MSU组)相比，造模后12h，同型对照组(IGg组)小鼠NLRP3和pro-IL-1β的蛋白表达上调，炎症因子IL-1β显著升高；而实验组(anti-PD-L1组)小鼠NLRP3和pro-IL-1β的蛋白无显著上调，对应的炎症因子IL-1β无显著升高，由此说明，使用anti-PD-L1中和抗体能够使小鼠的NLRP3炎症小体活化抑制，抑制小鼠炎症。

S603：将小鼠踝关节滑膜组织经过常规处理(石蜡包埋切片)后，进行HE染色，用显微镜观察踝关节滑膜组织病理形态改变，主要观察：关节的红肿，HE切片中炎性细胞，炎症因子IL-1分泌。

各组小鼠关节红肿情况如附图2所示。显微镜下各组小鼠HE切片中炎性细胞情况如附图3所示，从附图2和附图3中可以看出，使用PD-L1抗体成功缓解了小鼠痛风模型的痛风发作，MSU刺激诱导小鼠关节红肿，PD-L1抗体抑制这种MSU介导的红肿，而对照抗体则无影响，对应的MSU诱导的关节病理切片中有更多的炎性细胞，PD-L1抗体注射组则相对较少。

进一步的，步骤S7：根据步骤S6中的分析结果对PD-L1中和抗体对痛风炎症作用机理进行研究。

从步骤S6的分析结果中可以得出，PD-L1是痛风疾病的治疗靶点，靶向PD-L1分子能够显著的改善痛风发病情况。在分离的BMDMs中发现，PD-L1抗体阻断抑制了NLRP3的表达和炎症小体活化后IL-1β的分泌，在小鼠痛风模型中对PD-L1进行抗体阻断显著的抑制了NLRP3和pro-IL-1β的蛋白表达和对应的炎症因子IL-1β的分泌，抑制了小鼠对踝关节注射尿酸盐的炎症反应，小鼠的关节红肿程度以及体内炎症水平显著降低，由此可得，使用PD-L1特异性的中和抗体治疗可以显著缓解动物模型中的痛风发作，靶向PD-L1可以用于痛风的临床治疗。

为了进一步的证明PD-L1特异性的中和抗体治疗可以显著缓解动物模型中的痛风发作，本申请中还进行了动物体外实验，体外分离培养小鼠的骨髓巨噬细胞(BMDMs)，在MSU刺激的同时给与PD-L1抗体阻断，检测NLRP3炎症小体的活化情况。具体的，

(1)小鼠麻醉后脱臼处死，踢去腹部和腿部毛发，置于75％酒精中浸泡5min，分离腿骨，剥离肌肉和皮肤，将胫骨和股骨分开，剪开骨头的两端，使用1ml注射器用PBS将骨髓冲出，收集冲出的细胞，裂解红细胞。

(2)分离到的BMDMs，使用新鲜配制的含5％胎牛血清的RPIM1640培养基培养，同时加入双抗和M-CSF(20ng/ml)，间隔两天换液，在第七天收集细胞。

(3)收集的BMDMs铺24孔板，加入LPS(500ng/ml)培养3h，更换新鲜的培养基，分别加入MSU(200μg/ml)，PD-L1抗体(1μg/ml)，同型对照抗体(1μg/ml)，继续培养6h后，收集细胞检测。

结果如附图4所示，从附图4中可以看出，MSU单独诱导了BMDMs的NLRP3蛋白表达和IL-1β分泌，说明我们的MSU刺激成功的诱导了NLRP3炎症小体活化，使用PD-L1的阻断抑制了NLRP3的蛋白表达和IL-1β的分泌，而同型对照抗体则无影响，说明PD-L1通路参与调节MSU诱导的NLRP3炎症小体的活化。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。