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法律状态信息
法律状态
2022-06-03
公开
发明专利申请公布
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及载药的胞外囊泡在制备治疗肥胖或减轻肥胖相关代谢指标的药物中的应用。
背景技术
胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)是活细胞分泌的具有脂质双分子结构的小囊泡，可分为外泌体、核外颗粒、凋亡小体和癌小体4个亚群。作为一种天然内源性药物载体，它有其独特的优势：直径为纳米级别，可以穿透包括血脑屏障在内的多种屏障；具有复杂的蛋白质和磷脂双层结构，可以更好地保护药物不被身体清除；免疫原性低，作为载体携带药物或药用蛋白进行治疗时不会引起宿主的免疫反应。我们之前的研究已经证明人类红细胞来源的外泌体具有潜在的治疗前景，由于红细胞外泌体主要聚集于肝脏，尤其能特异靶向肝脏巨噬细胞，而肝脏是合成脂肪的主要器官，因此红细胞外泌体可作为载体携带药物或小分子调节巨噬细胞介导的肝脏免疫微环境，用于靶向治疗肝脏相关的代谢性疾病。
随着全球经济的快速发展、人民生活水平的提高，加上不合理的膳食结构、不良生活方式等的出现，肥胖症的患病率日趋增加且发病愈发低龄化。资料显示，近30年全球肥胖和超重人口的数量和比例一直在增加。全球肥胖和超重总人口已由1980年的8.57亿人增至2013年的21亿，整体成人肥胖和超重人口增加了27.5％，儿童肥胖和超重人口增加了47.1％。根据2013年发表在柳叶刀上的统计数据，在我国，虽然成年人的肥胖发病率比较低，但患有中心性肥胖或周围性肥胖的总人数位于全球第二，成为仅次于美国的世界肥胖人口大国。另外，儿童及青少年肥胖问题在我国也较为突出，青少年肥胖可引起发育迟缓、心肺功能受损、高血压甚至早逝，使得儿童及青少年自信心下降，社会适应能力降低。肥胖症及其伴随的各种代谢性疾病如Ⅱ型糖尿病、高血压、高脂血症、脂肪肝等已成为威胁人类身心健康的全球性焦点问题。
研究表明Trim21分子可介导机体慢性炎症水平，从而影响机体代谢和肥胖。利用红细胞外泌体装载特异性靶向Trim21的microRNA，可以通过调节肝脏巨噬细胞慢性炎症水平来影响脂肪的合成，从而减少肝脏脂肪沉积，缓解肝脏脂肪变性，最终达到减轻肥胖的效果。
肥胖是由于食欲和能量调节紊乱引起的疾病，与基因、环境、膳食结构等多种因素有关，发生是一个长期的过程，因此肥胖的缓解也需要一定的周期。因此，寻找一种安全有效的策略来缓解机体肥胖和代谢性疾病是当下治疗肥胖及相关代谢疾病的探究热点之一。
发明内容
本发明提供了载药的胞外囊泡在制备治疗肥胖或减轻肥胖相关代谢指标的药物中的应用，目的是寻找一种安全有效的策略来缓解机体肥胖和代谢性疾病。
本发明提供了Trim21基因或表达的蛋白作为靶点在制备治疗肥胖或减轻肥胖相关代谢指标的药物中的应用。
具体的，所述肥胖相关代谢指标为葡萄糖耐受量、胰岛素抵抗状态、甘油三酯含量、谷丙转氨酶含量或谷草转氨酶含量。
本发明还提供了一种用于治疗肥胖或减轻肥胖相关代谢指标的药物，成分包含靶向Trim21基因的microRNA、siRNA或反义寡核苷酸ASO。
优选的，靶向Trim21基因的microRNA为miR-1207-5p，靶向Trim21基因的siRNA序列为5’-GGAACAUUGACACCCAGAATT-3’，靶向Trim21基因的反义寡核苷酸ASO序列为5’-ATTCGATACTCATAGGCTC-3’。
本发明还提供了一种荷载药物的胞外囊泡，所述药物为上述用于治疗肥胖或减轻肥胖相关代谢指标的药物。
优选的，用于荷载药物的胞外囊泡为外泌体、凋亡小体、癌小体或核外颗粒。
优选的，用于荷载药物的胞外囊泡来源于人或其他哺乳动物的血液、唾液、尿液、脑脊液或乳汁。
本发明还提供了上述荷载药物的胞外囊泡在制备治疗肥胖或减轻肥胖相关代谢指标的药物中的应用。
具体的，所述肥胖相关代谢指标为葡萄糖耐受量、胰岛素抵抗状态、甘油三酯含量、谷丙转氨酶含量或谷草转氨酶含量。
本发明还提供了一种用于治疗肥胖或减轻肥胖相关代谢指标的药物，成分包含上述荷载药物的胞外囊泡。
优选的，给药方式为口服、静脉注射或静脉输液。
本发明的有益效果：
本发明体内外实验均证明，利用RBC-EVs/miR-1207-5p可以实现肝脏巨噬细胞的精准靶向，通过沉默基因Trim21的表达缓解机体炎症反应，治疗肥胖和相关代谢性疾病。
附图说明
图1为荷载microRNA的红细胞来源外泌体(RBC-EVs/miR-1207-5p)的制备和鉴定结果图；其中A为电镜检测外泌体形态图，B为NTA粒径分析外泌体颗粒大小图，
图2为荷载microRNA的红细胞来源外泌体(RBC-EVs/miR-1207-5p)的制备和鉴定结果图；A为Western Blot检测红细胞外泌体经典标志物图，B为流式细胞术检测红细胞外泌体荷载miR-1207-5p的效率图。
图3为免疫荧光检测肝脏巨噬细胞中Trim21的表达图。
图4为RBC-EVs/miR-1207-5p的体内外靶向性功能验证结果图；其中A为RT-qPCR检测巨噬细胞Trim21和Il1b的表达图，B为Western Blot检测蛋白Trim21的表达图；“**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.001。
图5为HE染色检测心、脾、肺、肾的组织形态变化图。
图6为外周血中肌酐和尿素氮的检测图；其中，A为外周血中肌酐检测结果图；B为外周血中尿素氮的检测结果图。
图7为RBC-EVs/miR-1207-5p减轻体内炎症性反应结果图；A为HE染色检测脂肪组织炎症细胞浸润图，B为免疫组化检测炎性巨噬细胞浸润图，C为RT-qPCR检测脂肪组织炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和CCL2的表达；NS表示无统计学意义，“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.001。
图8为RBC-EVs/miR-1207-5p缓解机体肥胖和相关代谢性疾病结果图；A为体重监测图(左)和多种脂肪组织重量检测图(右)，B为葡萄糖耐受实验结果图(左)和胰岛素抵抗实验结果图(右)；“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.001。
图9为RBC-EVs/miR-1207-5p缓解机体肥胖和相关代谢性疾病结果图；A为外周血中甘油三酯、谷草转氨酶和谷丙转氨酶检测图，B为HE染色检测肝脏病理变化图，C为油红O染色检测肝脏脂滴沉积图；“*”表示P＜0.05。
图10为荷载microRNA的牛奶来源外泌体(milk-EVs/miR-1207-5p)的制备和鉴定结果图；其中A为NTA粒径分析外泌体颗粒大小图，B为Western Blot检测牛奶外泌体经典标志物图，C为流式细胞术检测牛奶外泌体荷载miR-1207-5p的效率图。
图11为milk-EVs/miR-1207-5p缓解机体肥胖和相关代谢性疾病结果图；A为体重监测图(左)和多种脂肪组织重量检测图(右)，B为葡萄糖耐受实验结果图(左)和胰岛素抵抗实验结果图(右)；“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.001。
图12为milk-EVs/miR-1207-5p缓解机体肥胖和相关代谢性疾病结果图；A为外周血中甘油三酯、谷草转氨酶和谷丙转氨酶检测图，B为HE染色检测肝脏病理变化图，C为油红O染色检测肝脏脂滴沉积图；“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01。
图13为milk-EVs/Trim21-ASO或milk-EVs/Trim21-siRNA缓解机体肥胖和相关代谢性疾病结果图；A为体重监测图，B为多种脂肪组织重量检测图；“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.001。
具体实施方式
实施例1
荷载microRNA的红细胞来源外泌体(RBC-EVs/miR-1207-5p)的制备和鉴定。
(1)收集人外周血红细胞(申伦第2021-045号)，加入终浓度为2μM的钙离子载体(Sigma Aldrich，货号：21186)，37℃孵育48h。
(2)48h后按照600×g，20min；1600×g，15min；3260×g，15min；10000×g，30min 4℃梯度离心，上清过0.45μm无菌滤器。
(3)收集过滤后的液体100000×g，4℃超速离心70min，沉淀用适量体积的无菌PBS重悬，获得红细胞来源外泌体RBC-EVs。
(4)将靶向基因Trim21的microRNA miR-1207-5p和RBC-EVs在37℃共孵育3h，清洗和离心去除游离的miR-1207-5p，得到荷载microRNA的红细胞来源外泌体(RBC-EVs/miR-1207-5p)，miR-1207-5p序列为：5’-UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG-3’。
(5)利用电镜和纳米颗粒示踪分析技术(NTA)分别检测RBC-EVs和RBC-EVs/miR-1207-5p的形态及直径，Western blot手段检测胞外囊泡经典标志物，流式细胞术检测miR-1207-5p的装载效率。
结果如图1和图2所示，鉴定了RBC-EVs和RBC-EVs/miR-1207-5p的形态大小、颗粒直径、经典标志物的表达，检测了miR-1207-5p的装载效率，成功构建了RBC-EVs/miR-1207-5p。
实施例2
RBC-EVs/miR-1207-5p的体内外靶向性功能验证。
利用RBC-EVs和RBC-EVs/miR-1207-5p尾静脉回输高脂饲料喂养的小鼠14周，免疫荧光检测肝脏巨噬细胞标志物CD68和靶基因Trim21的表达。利用RBC-EVs和RBC-EVs/miR-1207-5p体外处理巨噬细胞，RT-qPCR检测巨噬细胞中靶基因Trim21含量和下游炎症因子IL-1β的水平，Western blot检测对蛋白Trim21的抑制效应。
结果如图3和图4所示，无论是体内动物实验还是体外细胞实验，RBC-EVs/miR-1207-5p均可以靶向巨噬细胞的基因Trim21，并显著抑制蛋白Trim21的表达及其下游效应。
实施例3
RBC-EVs/miR-1207-5p的体内毒副作用检测。
利用RBC-EVs和RBC-EVs/miR-1207-5p尾静脉回输高脂饲料喂养的小鼠14周，HE染色观察RBC-EVs/miR-1207-5p在体内对心、脾、肺和肾等组织器官是否产生损伤，ELISA检测血清中肌酐和尿素氮水平评价对肾功能的影响。
结果如图5和图6所示，尾静脉回输RBC-EVs/miR-1207-5p对各组织脏器没有明显的毒副作用，对肾功能没有损伤影响。
实施例4
RBC-EVs/miR-1207-5p减轻体内炎症性反应。
利用RBC-EVs和RBC-EVs/miR-1207-5p尾静脉回输高脂饲料喂养的小鼠14周，HE染色观察腹部白色脂肪组织炎性细胞浸润，免疫组化检测脂肪组织中促炎性F4/80
结果如图7所示，尾静脉回输RBC-EVs/miR-1207-5p抑制了脂肪组织炎性浸润和促炎性巨噬细胞的数量，降低了脂肪组织各种炎症因子的表达，减轻了体内炎症性反应。
实施例5
RBC-EVs/miR-1207-5p缓解机体肥胖和相关代谢性疾病。
利用RBC-EVs和RBC-EVs/miR-1207-5p尾静脉回输高脂饲料喂养的小鼠14周，每周记录体重变化，在第14周时检测肥胖小鼠各种脂肪组织重量，分析小鼠的葡萄糖耐受和胰岛素抵抗情况，检测血清中甘油三酯、谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量，HE染色观察肝脏脂肪变性，油红O染色观察肝脏脂滴沉积。
结果如图8和图9所示，尾静脉回输RBC-EVs/miR-1207-5p可以显著缓解小鼠的肥胖程度，减轻多种代谢相关的指标，对机体代谢性疾病起保护作用。
实施例6
荷载microRNA的牛奶来源外泌体(milk-EVs/miR-1207-5p)的制备和鉴定。
(1)收集新鲜牛奶，按照600×g，20min；1600×g，15min；3260×g，15min；10000×g，30min 4℃梯度离心，上清过0.45μm无菌滤器。
(2)收集过滤后的液体100000×g，4℃超速离心70min，沉淀用适量体积的无菌PBS重悬，获得牛奶来源外泌体milk-EVs。
(3)将靶向基因Trim21的microRNA miR-1207-5p和milk-EVs在37℃共孵育3h，清洗和离心去除游离的miR-1207-5p，得到荷载microRNA的牛奶来源外泌体(milk-EVs/miR-1207-5p)。
(4)利用纳米颗粒示踪分析技术(NTA)检测milk-EVs和milk-EVs/miR-1207-5p的直径，Western blot手段检测胞外囊泡经典标志物，流式细胞术检测miR-1207-5p的装载效率。
结果如图10所示，鉴定了milk-EVs和milk-EVs/miR-1207-5p的颗粒直径、经典标志物的表达，检测了miR-1207-5p的装载效率，成功构建了milk-EVs/miR-1207-5p。
实施例7
milk-EVs/miR-1207-5p缓解机体肥胖和相关代谢性疾病。
利用milk-EVs和milk-EVs/miR-1207-5p口服灌胃高脂饲料喂养的小鼠14周，每周记录体重变化，在第14周时检测肥胖小鼠各种脂肪组织重量，分析小鼠的葡萄糖耐受和胰岛素抵抗情况，检测血清中甘油三酯、谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量，HE染色观察肝脏脂肪变性，油红O染色观察肝脏脂滴沉积。
结果如图11和图12所示，口服milk-EVs/miR-1207-5p可以显著缓解小鼠的肥胖程度，减轻多种代谢相关的指标，对机体代谢性疾病起保护作用。
实施例8
milk-EVs/Trim21-ASO和milk-EVs/Trim21-siRNA缓解机体肥胖和相关代谢性疾病。
milk-EVs/Trim21-ASO和milk-EVs/Trim21-siRNA制备步骤与实施例6制备步骤相同。
利用milk-EVs/Trim21-ASO或milk-EVs/Trim21-siRNA口服灌胃高脂饲料喂养的小鼠14周，每周记录体重变化，在第14周时检测肥胖小鼠各种脂肪组织重量。Trim21-ASO序列为：5’-ATTCGATACTCATAGGCTC-3’。Trim21-siRNA序列为：5’-GGAACAUUGACACCCAGAATT-3’。
结果如图13所示，相比于口服milk-EVs对照组，口服milk-EVs/Trim21-ASO或milk-EVs/Trim21-siRNA均可以缓解小鼠的肥胖程度，对机体代谢性疾病起保护作用。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 载药的胞外囊泡在制备治疗肥胖或减轻肥胖相关代谢指标的药物中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uggcagggag gcugggaggg g 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attcgatact cataggctc 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaacauuga cacccagaat t 21
