生长分化因子9在预测胚胎发育潜力中的应用

摘要

本发明提供一种生长分化因子9在预测胚胎发育潜力中的应用。属于辅助生殖技术领域。为了提供一种安全无创的胚胎发育潜力的标志。涉及一种通过检测人胚胎体外培养液中GDF9水平预测胚胎发育潜力的方法，第三天的胚胎培养液中GDF9含量与胚胎发育潜力显著相关，步骤为获得胚胎的培养液、确定所述胚胎培养液的吸光度、确定无胚胎的培养液吸光度、GDF9标准品溶液吸光度及GDF9标准品浓度作为标准曲线；将所述胚胎培养液吸光度与所述标准曲线进行比较，获得所述胚胎培养液GDF9的浓度，并用GDF9的浓度来评估胚胎发育潜力，不需要对胚胎进行活检，不仅具有无创性的优点，且可提高单次辅助生殖治疗周期活产率，具有较高的临床意义。

说明书

技术领域

本发明属于辅助生殖技术领域，具体涉及生长分化因子9在预测胚胎发育潜力中的应用。

背景技术

随着生物科学的进步，近年来辅助生殖技术(assisted reproductivetechnologies，ART)取得了很大的进展，尤其是IVF实验室技术方面，但是临床结局还存在不尽如人意的地方。美国CDC公布最新的2017年全美ART数据显示：年龄小于35岁患者，移植胚胎的着床率只有37.1％；伴随着年龄增大，胚胎着床率也随之降低，分别为：27.5％(35-37岁)、18.3％(38-40岁)、9.7％(41-42)、4.1％(43-44)，在45岁以上女性助孕患者中，胚胎鲜有着床2.2％。

目前的研究表明，胚胎选择是影响胚胎着床的重要因素，只有选择出最具种植潜力的胚胎，才可以提高胚胎着床率。如何筛选出具着床潜力胚胎用于移植是提高ART成功率的关键，也是生殖领域的热点、难点。目前常用的胚胎选择技术是胚胎形态学评分，主要是通过评估胚胎的发育速度、卵裂球大小、碎片以及空泡等判断胚胎的质量，该方法的缺点是评估的主观因素比较大，不同技术人员以及不同实验室之间的差异比较大，且无法对胚胎质量进行量化。此外，胚胎的形态有时也不能完全反映胚胎的种植潜力。因此，在早期胚胎以移植前寻求一种安全无创的胚胎质量的标志显得至关重要。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种安全无创的胚胎发育潜力的标志。

本发明提供了一种生长分化因子9在预测或辅助预测胚胎发育潜力的中的应用。

本发明提供了一种生长分化因子9在预测或辅助预测胚胎质量中的应用。

进一步地限定，选择胚胎的时期为受精后第三天。

进一步地限定，所述生长分化因子9的检测方法是利用酶标仪检测。

进一步地限定，培养胚胎的的方法如下：受精后的胚胎放入预平衡的卵裂期胚胎培养滴中培养，培养环境为37℃，体积分数为5％的氧气以及体积分数为6％的二氧化碳。

进一步地限定，所述预平衡的卵裂期胚胎培养滴的配方为含有质量体积分数为5％HSA的胚胎培养液G1-plus。

本发明提供了一种预测预测或辅助预测胚胎发育潜力的试剂盒，所述试剂盒包括：待检测样品、标准品、质控品和生物素。

有益效果：本发明具体涉及一种通过检测人胚胎体外培养液中GDF9水平预测胚胎发育潜力的方法，第三天的胚胎培养液中GDF9含量与胚胎发育潜力显著相关。其中，发育潜力指胚胎着床或发育成胎儿的可能性。该方法不需要对胚胎进行活检，不仅具有无创性的优点，且可提高单次辅助生殖治疗周期活产率，缩短不孕患者的治疗周期，具有较高的临床意义。

附图说明

图1为胚胎质量与胚胎培养液中GDF9含量的关系；A.可移植的胚胎培养液和不可移植的胚胎培养液中GDF9含量；B.质量水平高(good)的胚胎培养液、质量水平中等(fair)的胚胎培养液和质量水平低(poor)的胚胎培养液培养液中GDF9含量；纵坐标是GDF9的含量，横坐标是组别。

图2为着床胚胎和未着床的胚胎对应的培养液中GDF9含量；纵坐标是GDF9的含量，横坐标是组别。

图3获得活产的胚胎和未获活产的胚胎对应的培养液中GDF9含量；纵坐标是GDF9的含量，横坐标是组别。

具体实施例

专用的商业化胚胎培养液G1-plus(瑞典Vitrolife公司)。

胚胎培养液的来源：经控制性超促排卵后取卵，授精后17-20小时观察受精情况，选取2PN胚胎转入过夜平衡的卵裂期胚胎培养液中(G1+5％HSA)单液滴继续培养至第三天，并按照10μL/滴的标准收集胚胎移植后剩余的培养液。

活产胚胎培养液：经控制性超促排卵后取卵，授精后17-20小时观察受精情况，选取2PN胚胎转入过夜平衡的卵裂期胚胎培养液中(G1+5％HSA，30μL/滴)单液滴继续培养至第三天，并按照10μL/滴的标准收集胚胎移植后剩余的培养液，只是在后期鉴定中得出是这个胚胎是可以成功胚胎移植后生下活产胎儿的胚胎。

着床的胚胎培养液：经控制性超促排卵后取卵，授精后17-20小时观察受精情况，选取2PN胚胎转入过夜平衡的卵裂期胚胎培养液中(G1+5％HSA)单液滴继续培养至第三天，并按照10μL/滴的标准收集胚胎移植后剩余的培养液，只是在后期鉴定中得出是这个胚胎是可以成功胚胎移植后生下活产胎儿的胚胎。

实施例1.

1.获得胚胎的培养液：受精后的胚胎放入预平衡的卵裂期胚胎培养滴(G1+5％HSA重组人血清白蛋白)中继续培养，培养环境为37℃，5％的氧气以及6％的二氧化碳，胚胎评估依据传统形态学评分，包括卵裂速度、碎片程度、卵裂球均一度以及卵裂球出现单核或多核等，第三天的可移植胚胎定义为卵裂球数目不少于6个，碎片少于30％且无明显形态学异常的胚胎获得质量好的胚胎培养液和质量不好的胚胎培养液。

2.检测质量好的胚胎培养液和质量不好的胚胎培养液中GDF9(生长因子9)含量：确定所述质量好的胚胎培养液和质量不好的胚胎培养液的吸光度；确定无胚胎的培养液吸光度、GDF9标准品溶液吸光度及GDF9标准品浓度作为标准曲线；将所述胚胎培养液吸光度与所述标准曲线进行比较，获得所述胚胎培养液GDF9的浓度，并用GDF9的浓度来评估胚胎发育潜力。

3.结果如图1所示，第三天培养液中的GDF9含量与胚胎质量显著相关，其中，胚胎质量较好的胚胎对应的培养液中GDF9含量显著较低。

3.检测着床胚胎培养液和未着床的胚胎培养液中GDF9含量：确定所述质量好的胚胎培养液和质量不好的胚胎培养液的吸光度；确定无胚胎的培养液吸光度、GDF9标准品溶液吸光度及GDF9标准品浓度作为标准曲线；将所述胚胎培养液吸光度与所述标准曲线进行比较，获得所述胚胎培养液GDF9的浓度，并用GDF9的浓度来评估胚胎发育潜力。

结果如图2所示，第三天培养液中的GDF9含量与着床率显著相关，其中，着床胚胎对应的培养液中GDF9含量显著较低。

4.检测活产的胚胎培养液和未获得活产的胚胎培养液中GDF9含量：确定所述质量好的胚胎培养液和质量不好的胚胎培养液的吸光度；确定无胚胎的培养液吸光度、GDF9标准品溶液吸光度及GDF9标准品浓度作为标准曲线；将所述胚胎培养液吸光度与所述标准曲线进行比较，获得所述胚胎培养液GDF9的浓度，并用GDF9的浓度来评估胚胎发育潜力。

结果如图3所示，第三天培养液中的GDF9含量与活产显著相关，其中，获得活产的胚胎对应的培养液中GDF9含量显著较低。

5.第三天培养液中的GDF9可作为无创评估胚胎发育潜力的标志物。在胚胎筛选时，我们可将胚胎培养液中GDF9含量测序作为一种辅助无创评估方法。

实施例2.一种预测预测或辅助预测胚胎发育潜力的试剂盒

一、试剂盒的成分：检测样品、标准品、质控品和生物素、浓缩洗液A、GDF-9实验缓冲液、生物素结合物和TMB底物液。

二、GDF9检测方法：

1、将所有试剂及样品平衡至室温；

2、分别用1mL去离子水溶解标准品B～F(分别含有重组人GDF9蛋白48pg、222pg、775pg、2550pg、5800pg)和质控品I、II(分别含有重组人GDF9蛋白240-400pg，2868-4302pg)，溶解、涡旋混匀；

3、用去离子水25倍稀释浓缩洗液A(含非离子洗涤剂的磷酸盐缓冲液)；

4、用新鲜空白培养液(卵裂期胚胎培养液)将样本稀释到合适倍数；

5、标记微孔条；

6、分别加入50μL校准品、质控品和样本到相应微孔中；

7、每孔加入50μL GDF-9实验缓冲液(含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)；

8、室温下在微孔板轨道摇床上(600-800rpm)振荡孵育3小时；

9、在孵育完成前的20～30分钟，50倍稀释生物素结合物(含有检测抗体生物素复合物的蛋白质基础缓冲液)。整板操作则精确吸取220μL浓缩液至11mL稀释液中；

10、洗板5次；

11、每孔加入100μL已稀释的生物素结合物；

12、室温下在微孔板轨道摇床上(600-800rpm)振荡孵育1小时；

13、洗板5次；

14、每孔加入100μL链霉亲和素结合物(即用型)；

15、室温下在微孔板轨道摇床上(600-800rpm)振荡孵育30分钟；

16、洗板5次；

17、每孔加入100μL TMB底物液。注意避免阳光直射；

18、室温下在微孔板轨道摇床上(600-800rpm)振荡孵育17分钟；

19、每孔加入100μL终止液。在20min内用酶标仪450nm波长读数。

实施例3.一种非治疗和诊断目的的预测胚胎发育潜力的方法

1.分别选取要数个要着床同一个人的胚胎培养液，胚胎培养液的来源和时期与实施例1相同；

2.利用实施例2的试剂盒分别检测步骤1中胚胎培养液中的生长因子9的含量，选取当中生长因子-9含量最低的作为最具有发育潜力的胚胎。