1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原和1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA检测试剂盒

摘要

本发明提供了一种1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原和1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA检测试剂盒，所述的1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述ELISA检测试剂盒包括：包被有1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原的ELISA酶标板。本发明采用6个特异性多肽表位且通过优化不同特异性表位之间的顺序和特异性表位的拷贝数，获得如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，本发明的1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原特异性良好，不与其他常见鸭病毒抗体产生交叉反应，也不与3型鸭甲肝病毒血清产生交叉反应。可用于检测鸭血清和鸭卵黄中1型鸭甲肝病毒抗体。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原和1型鸭 甲肝病毒抗体的ELISA检测试剂盒。

背景技术

鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)， 禽肝病毒属(Avihepatovirus)，能引起雏鸭急性、接触性和高致死性疾病。根据抗原性和 基因组差异，鸭甲肝病毒可以分为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。临床上DHAV-1、DHAV-2 和DHAV-3引起的症状无法区分，均表现为发病急、致死率高和特征性肝病变，鉴别诊断 可以通过分子生物学方法如PCR等。

免疫学诊断方法如ELISA等也有报道，尤其是DHAV-3与DHAV-1抗体存在免疫交叉反应。通过基因组分析，发现DHAV结构蛋白VP0、VP1和VP3氨基酸同源性均在90％左 右，可能是DHAV 3个基因型(或血清型)之间存在免疫交叉反应的原因。上述这些因素， 使得原本应用于检测DHAV-1的免疫学检测方法容易出现假阳性，即DHAV-3刺激宿主产 生的抗体，使检测DHAV-1的免疫学检测方法出现假阳性。

因此，如何开发一种特异性好的1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA检测试剂盒，具有重要 意义。

发明内容

为了解决所述技术问题，本发明提供了一种1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原和 1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA检测试剂盒，可以特异性识别1型鸭甲肝病毒，特异性良好， 不与其他常见鸭病毒抗体产生交叉反应，也不与3型鸭甲肝病毒血清产生交叉反应。

在本发明的第一方面，提供了一种1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原，所述的1 型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种编码所述1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1 抗原的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在本发明的第三方面，提供了一种1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原的表达载体， 所述表达载体的表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

所述表达载体能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。所述载体可以是常规的 载体；具体可以为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体；

在本发明的第四方面，提供了一种包含所述的表达载体的工程菌或真核宿主细胞。

在本发明的第五方面，提供了一种1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原的制备方法， 所述方法包括：

获得1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原的表达载体；

将所述1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原的表达载体转化至大肠杆菌感受态细 胞，获得表达工程菌；

将所述表达工程菌进行诱导表达及纯化，获得1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原。

在本发明的第六方面，提供了一种1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA检测试剂盒，所述ELISA检测试剂盒包括：包被有权利要求1所述的1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原 的ELISA酶标板。

进一步地，所述的1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原的包被量为0.05～2μg/孔。

进一步地，所述ELISA检测试剂盒还包括：

辣根过氧化物酶标记的酶标二抗；

标准阴性血清；

标准阳性血清；

检测试剂：包被液、包被用洗液、稀释液、洗涤液、封闭液、抗体稀释液、显色液和终止液。

上述技术方案中，所述阴性对照血清来源于SPF鸭，阳性血清为SPF鸭免疫1型鸭甲肝病毒活疫苗后采集的血清；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗鸭IgY。

在本发明的第七方面，提供了一种采用所述1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA检测试剂盒 的使用方法，所述方法包括：

将所述的1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原稀释后加到酶标板中吸附，空干后封 闭，获得包被有1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原的ELISA酶标板；

将待检血清、阴性血清、阳性血清分别作为一抗加至所述包被有1型鸭甲肝病毒特异 性融合蛋白S1抗原的ELISA酶标板的板孔中进行孵育；弃液体然后洗涤并甩干，后加入辣 根过氧化物酶标记的酶标二抗进行孵育，洗涤后甩干；

加入显色液室温避光孵育，后加入终止液终止反应，在酶标仪上450nm波长下测定OD 值。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1、本发明提供的1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原，S1蛋白氨基酸序列如SEQID NO.1所示，6个分布在1型鸭甲肝病毒结构蛋白VP0、VP1或VP3的特异性表位串联组 成，不同特异性表位之间通过多肽GPGPG连接，6个特异性多肽表位氨基酸序列如SEQ ID NO.2～7所示，使不同特异性表位之间互不干扰，且通过优化不同特异性表位之间的顺序和 特异性表位的拷贝数，获得如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，S1融合蛋白具有针对1型 鸭甲肝病毒抗体极加的特异性；

进一步编码S1蛋白的序列经过大肠杆菌密码子偏好性优化，S1蛋白编码序列如SEQ ID No:8所示；使融合蛋白S1能够通过大肠杆菌表达系统实现可溶性表达，且融合蛋白可以通 过金属亲和层析纯化得到纯度和活性较高的重组蛋白；

本发明的1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原特异性良好，不与其他常见鸭病毒抗 体产生交叉反应，也不与3型鸭甲肝病毒血清产生交叉反应。可用于检测鸭血清和鸭卵黄 中1型鸭甲肝病毒抗体。

2、本发明提供的1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA检测试剂盒，所述的1型鸭甲肝抗体的 ELISA检测试剂盒可用于鸭血清和鸭卵黄抗体中1型鸭甲肝病毒抗体的检测，特异性强，灵敏度高，能与3型鸭甲肝病毒抗体进行鉴别诊断。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的 附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领 域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附 图。

图1为本发明实施例提供的1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原表达、纯化的SDS-PAGE电泳图；M，蛋白marker；泳道1，大肠杆菌诱导表达后上清液；泳道2，大肠 杆菌诱导表达后沉淀；泳道3，经金属亲和层析后的重组S1蛋白；

图2为本发明实施例提供的1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原由6个特异性表位 串联的模式图；

图3为对比例1提供的1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原表达、纯化的SDS-PAGE 电泳图；泳道1为诱导后上清液，泳道2为沉淀，泳道3为纯化后蛋白，M为蛋白marker。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由 此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发 明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使 用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域 技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市 场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明的技术方案的总体思路如下：

根据本发明实施例的一种典型的实施方式，提供一种1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白 S1抗原，所述的1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所 示。

由6个分布在1型鸭甲肝病毒结构蛋白VP0、VP1或VP3的特异性表位串联组成(且 6个特异性多肽表位均有2个拷贝)，不同特异性表位之间通过多肽GPGPG连接，如图2 所示(6×His表示用于金属亲和层析的组氨酸标签，L1～L6表示特异性多肽1～6，6个特 异性多肽表位氨基酸序列如SEQ ID NO.2～7)，特异性多肽的选择、排列顺序，以及多肽之 间的连接肽GPGPG，均经过优化。最终得到的1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原的 氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。使用GPGPG作为多肽之间的连接肽，有利于保持相邻特 异性多肽的结构，而使用柔性肽GSGS等，不利于重组蛋白的表达(图3，泳道1为诱导后 上清液，泳道2为沉淀，泳道3为纯化后蛋白，M为蛋白marker)。

为了使得1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原可溶性高效表达，接着对密码子进行 优化，获得如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，适应于在大肠杆菌中表达。

构建表达质粒：编码S1的DNA序列T1由北京擎科生物科技有限公司合成，将合成的基因序列T1、pET28(a)+载体经过NcoI和XhoI双酶切后进行纯化，然后用T4 DNA连接酶 将双酶切后的T3和pET28(a)+载体连接，转化至BL21(DE3)感受态细胞，得到表达S1的重 组表达菌BL21(DE3)-S1。

将所述表达菌BL21(DE3)-S1进行诱导表达，然后利用金属亲和层析纯化得到。在蛋白 表达过程中，IPTG诱导浓度为0.5mmol/L，大肠杆菌工程菌培养温度为37℃，蛋白诱导表 达阶段大肠杆菌培养温度为16～25℃，在此条件下S1表达量高且主要以可溶性形式存在。

随后将纯化得到1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原制备ELISA检测试剂盒：将所 述1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原包被后，获得ELISA酶标板。

优选地，所述的1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原的包被量为0.05～2μg/孔。

所述ELISA检测试剂盒还包括：

辣根过氧化物酶标记的酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的兔抗鸭IgY；

标准阴性血清；

标准阳性血清；

检测试剂：包被液、包被用洗液、稀释液、洗涤液、封闭液、抗体稀释液、显色液和终止液。

所述的1型鸭甲肝抗体的ELISA检测试剂盒在使用过程包括以下步骤：

(1)用样品稀释液按照说明书将待检样品稀释，然后加入抗原包被孔中，然后再加入 阴性对照和阳性对照。

(2)将含有待检样品及阴性、阳性对照的抗原包被板置于恒温箱中孵育30分钟，使待检样品中抗体与抗原包被板中抗原充分结合并形成抗原-抗体复合物。

(3)弃去抗原包被板中液体，然后用洗涤液洗涤抗原包被孔4-6次。

(4)加入HRP标记的兔抗鸭IgY，置于恒温箱中孵育30分钟。

(5)弃去抗原包被板中液体，然后用洗涤液洗涤抗原包被孔4-6次。

(6)加入TMB底物，置于恒温箱中避光显色10分钟。

(7)加入终止液，然后使用酶标仪在波长450nm读取吸收值。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原 和1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA检测试剂盒进行详细说明。

实施例1重组S1蛋白的表达与纯化

(1)表达载体的构建

使用引物S1F和S1R扩增由北京擎科生物科技有限公司合成的经过大肠杆菌密码子偏 好性优化的模板，获得核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的DNA片段；

采用所述DNA片段为模板进行扩增，扩增使用的50μL体系含10μL 5×PCR buffer，dNTP mixture(2.5mM)4μL，引物S1F和S1R(10μM)各1μL，高保真DNA聚合酶PrimeStar HS0.5μL，ddH

所述扩增反应在Eppendorff PCR仪上进行，程序为：95℃分钟。95℃10秒，55℃30秒，68℃30秒，共35个循环。68℃10分钟。使用Omega cycle pure kit纯化DNA片段。

将纯化的DNA片段和pET28(a)+空载体用NcoI和XhoI双酶切后，分别纯化DNA片段和载体，然后使用T4 DNA连接酶连接DNA片段和载体，转化至BL21(DE3)感受态，获得 阳性转化子，提取质粒测序确认构建的序列与预期一致。

(2)重组蛋白的诱导表达

挑取测序验证后的阳性转化子，接种至新鲜的Luria-Bertani培养基，37℃180rpm振荡 培养至OD600约0.6，加入终浓度0.5mM IPTG在16℃诱导表达16h。然后离心收集菌液，超声波破碎后离心去除沉淀，参照试剂说明书用金属亲和层析纯化(Ni-IDA resin，genscript)。

(3)本发明实施例提供的1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原表达、纯化的SDS-PAGE电泳图如图1所示，用Image J软件对附图1的结果进行分析，获得的1型鸭甲 肝病毒特异性融合蛋白S1抗原的纯度＞90％。

对比例1

该对比例中的融合蛋白S1使用使用柔性肽GSGS替换实施例1的“GPGPG”作为多肽之间的连接肽；具体步骤为：

使用引物S2F(序列5’-cgcgccatgggttctcaccaccaccacc-3’；如SEQ ID NO.12所示)和S2R (序列5’-cgcgctcgagttatttcagagaaccgaaggtagct-3’；如SEQ ID NO.13所示)扩增由北京擎科 生物科技有限公司合成核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的DNA片段；其他步骤均同实施 例1。

该对比例中的融合蛋白S1表达纯化的SDS-PAGE电泳图如图3所示，由图3可知，条带较Marker带细，表达量较低，用Image J软件对附图1的结果进行分析，获得的1型鸭 甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原的纯度约为80％，表明采用其他柔性肽不利于重组蛋白的 表达及纯化。

实施例2血清1型鸭甲肝病毒抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法

一、血清1型鸭甲肝病毒抗体ELISA检测试剂盒

1、包被酶标板

(1)包被液：0.01M PBS(pH 7.2)；

(2)包被用洗液：0.01M PBS(pH 7.2)；

(3)包被方法：取实施例1中纯化的融合蛋白S1，用所述包被液稀释至蛋白含量为5μg/ml，96孔酶标板中每孔加100μL，置2-8℃吸附24小时。空去所述包被液，采用包被 用洗液进行洗板3次。

其中，在确定抗原蛋白包被浓度时，先用所述包被液将纯化的融合蛋白S1稀释至蛋白 含量为0.05μg/ml，0.1μg/ml,0.2μg/ml，0.3μg/ml，0.4μg/ml,0.5μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，3μg/ml， 4μg/ml，5μg/ml，6μg/ml，7μg/ml，8μg/ml，9μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，分别加至96孔酶 标板的微孔中，每孔加100μL，置2-8℃吸附24小时。从中选择一个优化的包被浓度，即 5μg/ml。

2、封闭：

(1)包被用封闭液：BSA或脱脂牛奶，浓度为2％-10％；

(2)封闭操作：空干所述包被洗液，加包被用封闭液150μL/孔，置2-8℃过夜。去除封闭液后自然干燥24小时。

3、阴阳性血清的孵育(一抗孵育)

(1)样品稀释液：含1％BSA、0.05％NaN3的0.01M PBS(pH 7.2)。

(2)标准阴性血清制备：SPF鸭血清稀释而成。

(3)标准阳性血清制备：用SPF鸭免疫灭活1型鸭甲肝病毒后采集制备而成。

(4)洗涤液：10×洗涤液为含0.5％吐温20的0.1M PBS(pH 7.2)，使用前用ddH

(5)操作：待检血清用样品稀释液稀释，加入包被板孔中，100μL/孔。直接吸取标准阳性血清或标准阴性血清加入包被板孔中，100μL/孔。置酶标板于37℃，30min。

空净血清稀释液后用洗涤液洗板5次。

4、酶标二抗的孵育

用血清稀释液将辣根过氧化物酶标记的酶标二抗(HRP标记的兔抗鸭IgY为商品化试 剂)稀释至工作浓度(使用0.01M PBS稀释12000倍)，向酶标板孔中加入100μL/孔，置 37℃，30min。

5、显色：

加入TMB底物液100μL，轻摇混合，37℃反应10min。

TMB底物为商品化试剂。

6、终止：

终止液：2M的硫酸。

显色结束后加终止液100μL/孔。

7、读板：

在450nm波长下，读取酶标板光吸收值。

需要说明的是，本发明提供的1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原应用于制备ELISA 试剂盒,也可用于制备免疫胶体金检测试纸条、免疫荧光、免疫比浊、化学发光等各种形式 的产品。

二、血清1型鸭甲肝病毒抗体ELISA检测试剂盒操作步骤

(1)取1.5μL待检样品加入148.5μL血清稀释液，振荡混匀后取100μL转移至抗原包被板，再分别加入100μL阴性对照和阳性对照至另外的抗原包被孔，每个待检样品和对照均设3个重复，然后将抗原包被板在37℃静置孵育1h。抗原包被板用洗板机洗涤4次，每 孔加入100μL HRP标记的兔抗鸭IgY，在37℃静置孵育30min。抗原包被板用洗板机洗涤4 次，每孔加入100μL TMB底物，在37℃避光显色10min，加入100μL终止液，在酶标仪 450nm波长读取吸光值。

(2)结果判断：

若OD450≥阴性对照OD450×2.5，判定为阳性；

若OD450≤阴性对照OD450×2，判定为阴性；

若阴性对照OD450×2.5>OD450>阴性对照OD450×2，判定为需要重复检测。

实施例3血清1型鸭甲肝病毒抗体ELISA检测试剂盒对样本的检测

1、血清1型和血清3型鸭甲肝病毒血清及卵黄抗体的制备：

将鸭胚减毒毒种1型和血清3型鸭甲肝病毒用无菌生理盐水稀释至10

SPF雏鸭分别免疫1型和血清3型鸭甲肝病毒灭活疫苗，共免疫3次，分别于7日龄、14日龄和21日龄免疫一次。最后一次免疫后7天收集血清。

140日龄甲型鸭肝炎病毒抗原和抗体阴性鸭，分别免疫三次1型和血清3型鸭甲肝病毒 灭活疫苗，两次免疫间隔一周，最后一次免疫后7天，连续一周收集产的蛋，用于制备卵 黄抗体。卵黄抗体提取采用氯仿法，即用5倍卵黄液体积的生理盐水搅拌并漩涡振荡混匀， 加入混合液等体积的氯仿，振荡混匀后离心收集上清水相，即为卵黄抗体。

2、使用血清1型鸭甲肝病毒抗体ELISA检测试剂盒检测上述血清1型鸭甲肝病毒血清 (DHAV-1S1～DHAV-1S3)和血清3型鸭甲肝病毒血清(DHAV-3S1～DHAV-3S3),血清1 型鸭甲肝病毒卵黄抗体(DHAV-1E1～DHAV-1E3)，血清3型鸭甲肝病毒卵黄抗体 (DHAV-3E1～DHAV-3E3)，同时检测致病性大肠杆菌血清(E.coli，琼扩效价1:128)和 鸭疫里氏杆菌阳性血清(R.anatipestifer，琼扩效价1:64)。检测结果见附表1。

表1-血清和卵黄抗体样品ELISA检测结果

由表1的数据可知：

阴性对照OD450×2.5＝0.1475；阴性对照OD450×2＝0.118；

血清1型鸭甲肝病毒血清中，DHAV-1S1～DHAV-1S3均为阳性；

血清3型鸭甲肝病毒血清中，DHAV-3S1～DHAV-3S3均为阴性；

血清1型鸭甲肝病毒卵黄抗体中，DHAV-1E1～DHAV-1E3均为阳性；

血清3型鸭甲肝病毒卵黄抗体(DHAV-3E1～DHAV-3E3均为阴性；

致病性大肠杆菌血清和鸭疫里氏杆菌阳性血清均为阴性；表明本发明施例提供的一种 检测1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA检测试剂盒，特异性良好，不与其他常见鸭病毒抗体产 生交叉反应，也不与3型鸭甲肝病毒血清产生交叉反应。

同时本发明实施例提供的一种检测1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA检测试剂盒，可用于 检测1型鸭甲肝病毒抗体水平及1型鸭甲肝病毒感染诊断，也可用于1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒感染鉴别诊断。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的 包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还 包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的 要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概 念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选 实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和 范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内， 则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 国药集团动物保健股份有限公司

<120> 1型鸭甲肝病毒特异性融合蛋白S1抗原和1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA检测试剂盒

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ser His His His His His His Lys Arg Arg Trp Lys Pro Arg Gly

1 5 10 15

Tyr Phe Arg Gly Pro Gly Pro Gly Ala Pro Thr Ser Thr Thr Leu Ser

20 25 30

Arg Gly Ser Thr Gly Val Ile Pro Thr Leu Asp Gln Ser Gly Asp Glu

35 40 45

Val Asp Gly Pro Gly Pro Gly Gln Trp Val Pro Asn Asp Asp Tyr Tyr

50 55 60

Ala Cys Leu Arg Trp Gly Pro Gly Pro Gly Ile Thr Thr Ser Asp Thr

65 70 75 80

Thr Gly Gly Gly Pro Gly Pro Gly Ile Leu Ala Ser Phe Gln Trp Gln

85 90 95

Ser Thr Leu Thr Pro Ser Ala Arg Ile Asn Arg Tyr Gln Leu Ile Phe

100 105 110

Arg Asn Ile Pro Gly Pro Gly Pro Gly Arg Pro Ile Pro Gly Thr Ser

115 120 125

Glu Ala Thr Phe Gly Gly Pro Gly Pro Gly Lys Arg Arg Trp Lys Pro

130 135 140

Arg Gly Tyr Phe Arg Gly Pro Gly Pro Gly Ala Pro Thr Ser Thr Thr

145 150 155 160

Leu Ser Arg Gly Ser Thr Gly Val Ile Pro Thr Leu Asp Gln Ser Gly

165 170 175

Asp Glu Val Asp Gly Pro Gly Pro Gly Gln Trp Val Pro Asn Asp Asp

180 185 190

Tyr Tyr Ala Cys Leu Arg Trp Gly Pro Gly Pro Gly Ile Thr Thr Ser

195 200 205

Asp Thr Thr Gly Gly Gly Pro Gly Pro Gly Ile Leu Ala Ser Phe Gln

210 215 220

Trp Gln Ser Thr Leu Thr Pro Ser Ala Arg Ile Asn Arg Tyr Gln Leu

225 230 235 240

Ile Phe Arg Asn Ile Pro Gly Pro Gly Pro Gly Arg Pro Ile Pro Gly

245 250 255

Thr Ser Glu Ala Thr Phe Gly Ser Leu Lys

260 265

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Lys Arg Arg Trp Lys Pro Arg Gly Tyr Phe Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Pro Thr Ser Thr Thr Leu Ser Arg Gly Ser Thr Gly Val Ile Pro

1 5 10 15

Thr Leu Asp Gln Ser Gly Asp Glu Val Asp

20 25

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Trp Val Pro Asn Asp Asp Tyr Tyr Ala Cys Leu Arg Trp

1 5 10

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ile Thr Thr Ser Asp Thr Thr Gly Gly

1 5

<210> 6

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ile Leu Ala Ser Phe Gln Trp Gln Ser Thr Leu Thr Pro Ser Ala Arg

1 5 10 15

Ile Asn Arg Tyr Gln Leu Ile Phe Arg Asn Ile Pro

20 25

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Arg Pro Ile Pro Gly Thr Ser Glu Ala Thr Phe Gly

1 5 10

<210> 8

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtagtcatc atcatcatca tcataaacgt cgttggaaac cgcgtggtta ttttcgtggt 60

ccgggtccgg gtgcgccgac aagtacaaca ctgagccgtg gtagcacagg tgttattccg 120

accctggatc agtcaggcga tgaagttgat ggtccgggtc ctggtcagtg ggttccgaat 180

gatgattatt atgcatgcct gcgctggggt ccgggtccag gtattacgac cagcgatacc 240

accggtggcg gtccgggtcc gggcattctg gcaagctttc agtggcagag taccctgaca 300

ccgtccgcac gtattaatcg ttatcagctg atttttcgta acattccggg tccgggtccg 360

ggtcgtccga ttcctggtac aagcgaagca acctttggtg gtccaggtcc gggtaaacgt 420

cgttggaaac ctcgtggtta ttttcgcggt ccgggtccgg gtgcaccgac cagcacaaca 480

ctgagtcgcg gtagcacagg cgtgattcct actctggatc agagtggtga tgaagttgat 540

ggcccgggtc ctggccagtg ggttcctaat gatgattatt atgcttgcct gcgttggggt 600

ccgggcccgg gtattacaac gagcgataca accggtggtg gtccgggtcc gggtattctg 660

gcaagttttc agtggcagtc aaccctgacc ccgtccgcac gcattaatcg ttatcagctg 720

atctttcgta acatcccagg tccgggccca ggtcgtccaa ttccgggtac aagcgaagcc 780

acctttggta gcctgaaa 798

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgcgccatgg gtagtcatca tcatcatca 29

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgcgctcgag ttatttcagg ctaccaaagg tggc 34

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atgggttctc accaccacca ccaccacaaa cgtcgttgga aaccgcgtgg ttacttccgt 60

ggtccgggtc cgggtgctcc gacctctacc accctgtctc gtggttctac cggtgttatc 120

ccgaccctgg accagtctgg tgacgaagtt gacggtccgg gtccgggtca gtgggttccg 180

aacgacgact actacgcttg cctgcgttgg ggtccgggtc cgggtatcac cacctctgac 240

accaccggtg gtggtccggg tccgggtatc ctggcttctt tccagtggca gtctaccctg 300

accccgtctg ctcgtatcaa ccgttaccag ctgatcttcc gtaacatccc gggtccgggt 360

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cgtcgttgga aaccgcgtgg ttacttccgt ggtccgggtc cgggtgctcc gacctctacc 480

accctgtctc gtggttctac cggtgttatc ccgaccctgg accagtctgg tgacgaagtt 540

gacggtccgg gtccgggtca gtgggttccg aacgacgact actacgcttg cctgcgttgg 600

ggtccgggtc cgggtatcac cacctctgac accaccggtg gtggtccggg tccgggtatc 660

ctggcttctt tccagtggca gtctaccctg accccgtctg ctcgtatcaa ccgttaccag 720

ctgatcttcc gtaacatccc gggtccgggt ccgggtcgtc cgatcccggg tacctctgaa 780

gctaccttcg gttctctgaa a 801

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cgcgctcgag ttatttcaga gaaccgaagg tagct 35