一种定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒及方法

摘要

本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种定量检测人脂多糖结合蛋白(LBP)的化学光试剂盒及检测方法。试剂盒包括包被人脂多糖结合蛋白抗体的孔板。检测方法包括以下步骤：(1)将待测样品加到包被有人脂多糖结合蛋白抗体的孔板中；(2)加入生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体；(3)孵育并洗涤干燥；(4)加入用链霉素和亲和素标记的辣根过氧化酶或链霉素和亲和素标记的碱性磷酸酶反应，洗涤干燥；(5)加入酶发光底物，读取发光值。本方法检测灵敏度更高，特异性更强；无需做血样处理，操作简便；对于所需设备也无很高要求，可实现大通量检测，成本低，可实现半自动化或全自动化批量操作，具有良好的效果和应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种定量检测人脂多糖结合蛋白(LBP)的化学光试剂盒。

背景技术

脂多糖结合蛋白(LBP)是一种分子量约58KDa大小的糖蛋白，其由肝细胞合成，属于脂质结合蛋白家族。其家族中还包括BPI、PLTP、CETP。LBP与革兰氏阴性菌的细胞壁成分脂多糖(LPS)的脂质A部分结合，促进LPS单体化，催化LPS单体与细胞因子CD14结合，并诱导促进LPS的免疫反应，该指标可反应机体内毒素载荷水平。

现有的检测LBP的免疫学研究解决方案，例如常规的酶联免疫分析法(ELISA法)，检测量程短，一般在0.8-50ng/mL且线性不好；灵敏度不高，一般为2ng/mL左右，而且血样需要经过预先处理，经过50-200倍稀释后进行检测；同时，标准差约15％，精密度不高。

此需要开发一种新的方法检测LBP，以克服上述缺陷，提高灵敏度和检测量程及精密度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定量检测人脂多糖结合蛋白(LBP)的试剂盒，尤其是化学发光试剂盒。本发明还提供了检测方法。本方法和试剂盒的检测灵敏度高、特异性好、操作简便，检测通量高，检测成本低，检测样本量少且不需要太多复杂的辅助设备和试剂。

为实现上述目的，本发明采取了下述技术方案：

一种定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒，包括包被人脂多糖结合蛋白抗体的孔板。

所述人脂多糖结合蛋白抗体为人脂多糖结合蛋白单克隆抗体或多克隆抗体。所述包被人脂多糖结合蛋白抗体的孔板，每个检测孔或检测点上包被的人脂多糖结合蛋白抗体量为0.1-0.5μg，优选为0.2-0.4μg。

所述包被人脂多糖结合蛋白抗体的孔板用保护蛋白封闭，所述的保护蛋白为酪蛋白、牛血清白蛋白、明胶、动物血清或人血清蛋白。

所述定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒还包括以下试剂中的至少一种：(1)生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体；(2)链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或链霉亲和素标记的碱性磷酸酶；(3)辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的发光底物。

所述生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体人脂多糖结合蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

辣根过氧化物酶HRP的发光底物包括鲁米诺、鲁米诺衍生物和对羟基苯乙酸。碱性磷酸酶AP的发光底物包括3-(2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-(3-磷酸氧基)-苯基-1,2-二氧乙烷(AMPPD)和4-甲基伞形酮磷酸盐(4-MUP，荧光底物)等。

所述定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒还包括洗涤液，所述洗涤液含有磷酸二氢钠、氢酸氢二钠、氯化钠和吐温-20；优选的，还含有防腐剂。

所述定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒还包括稀释液，用于稀释待测样品、生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体人脂多糖结合蛋白抗体、链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或链霉亲和素标记的碱性磷酸酶。

所述的稀释液为pH＝7.4、0.01-0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(PB缓冲液)、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液或Tris缓冲液，且含有0.5％-2％蛋白保护剂；优选的，所述蛋白保护剂为酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、明胶、动物血清、人血清、人血清蛋白；优选的，稀释液中还含有防腐剂。

优选的，所述定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒中还包含人脂多糖结合蛋白(LBP)标准品。

所述定量检测人脂多糖结合蛋白的试剂盒的制备方法，包括将人脂多糖结合蛋白抗体包被在孔板上并用保护蛋白封闭，得到包被人脂多糖结合蛋白抗体的孔板。

所述的保护蛋白为酪蛋白、牛血清白蛋白、明胶、动物血清、人血清、人血清蛋白。

一种定量检测人脂多糖结合蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)将待测样品加到包被有人脂多糖结合蛋白抗体的孔板中；

(2)加入生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体；

(3)孵育并洗涤干燥；

(4)加入用链霉素和亲和素标记的辣根过氧化酶或链霉素和亲和素标记的碱性磷酸酶反应，洗涤干燥；

(5)加入酶发光底物，读取发光值。

优选的，还包括步骤(6)：与标准曲线对照，得到待测样品浓度。

步骤(1)中，所述的待测样品为血液样本，包括血清样本或血浆样本。

优选的，步骤(1)中，将待测样品稀释至20-100倍，加到包被有人脂多糖结合蛋白抗体的板上。优选的，将待测样品稀释至50倍。

步骤(1)所述的孔板，每个检测孔或检测点上包被的人脂多糖结合蛋白抗体量为0.1-0.5μg，优选为0.2-0.4μg。

所述包被有人脂多糖结合蛋白抗体的孔板用保护蛋白封闭处理。

优选的，步骤(4)中，所述的生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体溶解于稀释液中，得到含有生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体的工作溶液，其中生物素标记的人脂多糖结合蛋白抗体含量为0.1-2μg/mL，优选为0.2-1μg/mL；链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或链霉亲和素标记的碱性磷酸酶溶解于稀释液中，得到含有链霉素和亲和素标记的辣根过氧化物酶标记的工作溶液或含有链霉素和亲和素标记的碱性磷酸酶的工作溶液，以辣根过氧化酶或碱性磷酸酶计，含量为10-100mIU/mL，优选为20-60mIU/mL；本发明的一个优选方式中，含量为50mIU/mL。

所述的稀释液为pH＝7.4、0.01-0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(PB缓冲液)、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液或Tris缓冲液，且含有0.5％-2％蛋白保护剂；优选的，所述蛋白保护剂为酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、明胶、动物血清、人血清、人血清蛋白；优选的，稀释液中还含有防腐剂。

优选的，步骤(5)中，所述的酶发光底物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的酶促发光底物。辣根过氧化物酶HRP的发光底物包括鲁米诺、鲁米诺衍生物和对-羟基苯乙酸。碱性磷酸酶AP的发光底物包括3-(2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-(3-磷酸氧基)-苯基-1,2-二氧乙烷(AMPPD)和4-甲基伞形酮磷酸盐(4-MUP，荧光底物)等。

本发明的试剂盒和检测方法，样本中的最低检测限为0.23-0.27ng/mL，在0-50ng/mL浓度范围内线性良好，精密度高，标准差约8％，远低于现有技术的15％。

本发明的优点在于将人脂多糖结合蛋白(LBP)单克隆抗体或人脂多糖结合蛋白(LBP)多克隆抗体包被于化学发光板中，采用酶促化学发光法，利用酶促催化发光底物，并利用生物素放大系统，提高了试剂盒的灵敏度和准确性；实验证明，化学发光法配合生物素放大系统检测系统是定量检测人脂多糖结合蛋白(LBP)的有效方法。本方法和试剂盒的检测灵敏度高、特异性好、操作简便，检测样本量少且不需要太多复杂的辅助设备和试剂。

本发明的有益效果在于，本发明的试剂盒及检测方法，相比于市场上人脂多糖结合蛋白(LBP)酶联免疫分析法(ELISA)检测试剂盒，检测灵敏度更高，特异性更强；且因本发明的试剂盒和方法无需做血样处理，操作简便；对于所需设备也无很高要求，可实现大通量检测，成本低，免疫诊断部分可实现半自动化或全自动化批量操作，具有良好的效果和应用前景。

附图说明

图1为用化学发光板检测LBP标准曲线

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行更为详细的阐述。

实施例1 试剂盒的制备

1.人脂多糖结合蛋白(LBP)单克隆抗体或多克隆抗体包被化学发光板的制备

利用磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液将人脂多糖结合蛋白(LBP)单克隆抗体或多克隆抗体稀释至2～4μg/mL，按照100μl/孔加入化学发光板中，并于4℃放置16～20小时后，取出化学发光板，甩干残液，利用如牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、动物或人血清等进行封闭处理，按照250μl/孔(浓度5-20μg/mL)加样，37℃放置2小时或4℃放置16～20小时，甩干残液，干燥保存于4℃备用。

2.生物素标记的人脂多糖结合蛋白(LBP)单克隆抗体或人脂多糖结合蛋白(LBP)多克隆抗体的制备

利用pH＝7.2、0.1M PBS配制10mM NHS-DPEG4-Biotin工作溶液。按照一定比例将人脂多糖结合蛋白(LBP)单克隆抗体或多克隆抗体加入适量的10mM NHS-DPEG4-Biotin工作溶液中，于室温反应1小时，利用葡聚糖凝胶分离纯化，去除游离生物素。加入0.1％BSA，放置4℃备用，其中抗体浓度为50 0μg/mL。

购买商用生物素标记试剂盒进行操作也可制备生物素标记的人脂多糖结合蛋白(LBP)单克隆抗体或人脂多糖结合蛋白(LBP)多克隆抗体。

3.生物素标记的人脂多糖结合蛋白(LBP)单克隆抗体或人脂多糖结合蛋白(LBP)多克隆抗体工作液的制备

1)稀释液的制备：

0.01M PB缓冲液(pH7.4)，1％酪蛋白或1％BSA，0.1％proclin300

3)工作液的制备：

用稀释液稀释生物素标记好的人脂多糖结合蛋白(LBP)单克隆抗体后得到生物素标记的人脂多糖结合蛋白(LBP)单克隆抗体工作液，本实施案例中的稀释比例为1:2000，工作液中生物素标记的人脂多糖结合蛋白(LBP)单克隆抗体含量为0.25μg/mL。

4.链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶工作液的制备

1)稀释液的制备：

0.1M TB缓冲液(pH7.4)，1％酪蛋白或1％BSA，0.1％proclin300

2)链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶

采用戊二醇法，将辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶配制成50IU/mL，取适量，加入含1.25％戊二醛的pH6.8的PBS溶液中，混匀至室温下反应过夜。收集反应液，利用PBS(pH7.2)透析4次，取适量SA溶于1mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.5)中，与透析后的反应液混匀，于4℃反应，并加入适量0.2mol/L赖氨酸溶液。混匀，室温反应2小时，利用0.05mol/L PBS(pH7.2)透析4次。离心取上清液，至4℃备用，其中链霉素和亲和素标记的辣根过氧化酶浓度为50IU/mL。

购买商用链霉亲和素标记试剂盒操作也可制备链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

2)工作液的制备：

用稀释液稀释链霉素和亲和素标记的辣根过氧化物酶后得到链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶工作液，其稀释比例在1:500～1:5000，本实验实施案例中的稀释比例为1:1000，工作液中链霉素和亲和素标记的辣根过氧化物酶的含量为50mIU/mL。用同样方法准备链霉亲和素标记的碱性磷酸酶工作液。

5.校准品的制备

人脂多糖结合蛋白(LBP)标准品抗原为基因重组的浓度≥95％的全序列的人脂多糖结合蛋白(1 to 481氨基酸序列)或纯度≥97％的重组序列蛋白(功能段：196 to 295氨基酸序列)，本发明试剂盒中涉及的人脂多糖结合蛋白(LBP)标准品的稀释液为含1％BSA的HEPES或含1％BSA的PB缓冲液，内含0.1％proclin300。稀释浓度梯度为：0.78ng/mL、1.56ng/mL、3.13ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL，用于制作检测标准曲线。

6.洗涤液的制备

所述的洗涤液为0.01M PBST溶液，配制1L的洗涤液：二水磷酸二氢钠9.75g、十二水磷酸氢二钠51g、氯化钠155g、Tween20 10mL，内含0.1％proclin300，使用时用超纯水稀释20倍，配成洗涤工作液。

实施例2 使用试剂盒检测人脂多糖结合蛋白(LBP)的方法和方法学评价

(一)用实施例1所述试剂盒定量检测人脂多糖结合蛋白的方法如下：

(1)用标准稀释液将人血样按照50倍稀释，按照50μL/孔取标准品梯度浓度和血清/血浆样本，加入对应板孔，做好标示；

(2)取生物素标记的人脂多糖结合蛋白(LBP)抗体工作液，按照50μL/孔加入对应板孔；

(3)37℃孵育1h，取出，每孔250μL洗涤工作液，洗涤4次，拍干；

(4)取链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶工作液(浓度为50mIU/mL)，按照50μL/孔加入对应反应孔，放置37℃反应30min；再取出发光板，每孔250μL洗涤液，洗涤4次，拍干；

(5)每孔加入100μL酶发光底物鲁米诺(浓度为50mIU/mL)，读取发光值；

分别取标准品梯度的浓度值作为x值和发光值作为y值，制作一元一次方程标准曲线，获得曲线方程；将待测样本的发光值带入标准曲线，计算出待测样本的浓度值。

(二)试剂盒的方法学评价

1.标准曲线

用校准品浓度(0ng/mL剔除，该值作为反应板本底考虑，不计入标准曲线范围内)作为X值，对应浓度检测的发光值RLU做Y值，以此做一元一次方程。

如图1所示，所绘制的标准曲线回归方程为y＝5781.8x-1176.6，R

2.最低检出限

在检测标准曲线的同时检测最低检出限参考品(0.78ng/mL)10次，并通过标准曲线计算最低检出限参考品的平均浓度值(x)和标准差(SD)。根据公式：检出限＝X±2SD，计算样品的最低检出限。

结果如表1，本发明试剂盒对血样检测人脂多糖结合蛋白(LBP)的最低检出限为0.25ng/mL。

表1 人脂多糖结合蛋白(LBP)化学发光检测试剂盒的最低检出限

3.精密性

同以上表1的检测结果，本发明试剂盒利用标准差(SD)/平均浓度值(x)所获得的比值即为精密性值，即：标准差0.02ng/mL除以平均浓度值0.25ng/mL，乘以100％，为8％，小于15％。

用碱性磷酸酶代替辣根过氧化酶，或者用人脂多糖结合蛋白多克隆抗体代替单克隆抗体，效果相同。

综上所述，采用本发明试剂盒检测人脂多糖结合蛋白(LBP)与目前市面上所拥有的ELISA检测试剂盒相比较，具有操作简便、操作灵敏度高、特异性好、检测成本低、样本使用量少，对于设备的要求低等的优点。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属的技术领域的不脱离本发明构思的前提下，做出的若干等同替代或明显变型，且性能或用途相同或相似的，都应当属于本发明的保护范围。