一株产乙偶姻贝莱斯芽孢杆菌及其在麸醋发酵中的应用

摘要

本发明属微生物技术领域，提供一株产乙偶姻的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）SAU‑1及其在四川麸醋发酵中的应用。从四川麸醋醋曲中筛选出1株产乙偶姻、产香能力较强的贝莱斯芽孢杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCC No.21137，保藏日期为2020年11月09日。接种贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）SAU‑1的醋醅中有35种挥发性组分，乙偶姻和游离氨基酸含量分别为20.1 g/L、1390 mg/100mL，结果表明该菌株不仅提高了醋醅中挥发性组分物质和游离氨基酸总量，而且丰富了醋醅中挥发性香气谱图。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种产乙偶姻贝莱斯芽孢杆菌及在四川麸醋发酵中的应用。

背景技术

四川麸醋作为具有地域特色的中国食醋之一，以麸皮为主要生产原料而闻名，麸醋以保宁醋为佳；四川麸醋主要采用生料固态开放式发酵，自然网罗环境、原料以及生产器具中的微生物，利用微生物种群间此消彼长、相互作用，同时辅以适当的发酵条件及后期工艺，最终得到色泽棕红、体态澄清、酸味柔和的优质食醋；食醋在发酵过程中有多种微生物参与，微生物产生的代谢物质和原料的分解产物共同构成了食醋特有的风味与质构特征；开放的制曲环境使大曲中的微生物种类多样，其中功能菌群主要包括霉菌、细菌以及酵母菌等；而细菌作为大曲中常见的一类生物群体，种类丰富，可代谢产生多种酶类以及香味及其前体物质；此外，研究表明大曲中的细菌群落可能是导致大曲微生物演替的主要驱动力；其中，芽孢杆菌属是大曲中的优势菌群，能够产生淀粉酶、蛋白酶等多种水解酶及吡嗪类风味物质，对食醋的风味形成具有显著贡献，有学者通过高通量测序技术对酱香大曲中的微生物多样性进行特征分析，结果表明芽孢杆菌目作为曲中的优势微生物，在曲心的丰度相对较高。

四甲基吡嗪（川穹嗪，TTMP）是芽孢杆菌的代谢产物之一，也是食醋中重要的特征香气成分与健康元素；乙偶姻是TTMP生物合成的重要前体物质，同时也是糖代谢的中间产物，是食醋中的呈香物质之一；因此，研究高产乙偶姻细菌对提升食醋风味品质具有重要意义；关于食醋酿造过程中芽孢菌的开发应用研究较少，专利“高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌直投式发酵剂的制备方法及在山西老陈醋生产中的应用（201910136399.9）”中公开了一株高产乙偶姻及增香的莫海威芽孢杆菌，其应用于山西老陈醋生产中，山西老陈醋选用高粱、大麦、豌豆等五谷经蒸、酵、熏、淋、晒的过程酿就而成，其加工工艺同四川麸醋差异较大，微生物生长环境不同，因此本专利中公开的贝莱斯芽孢杆菌（

发明内容

本发明涉及一种产乙偶姻的贝莱斯芽孢杆菌及其在四川麸醋发酵中的应用。

产乙偶姻芽孢杆菌的初筛：采用V-P显色（丙酮酸脱羧酶实验），同时配合分光光度计法，将分离自醋曲的芽孢杆菌接种至LB液体培养基中，于30℃过夜培养，制得芽孢杆菌种子液，1%的接种量接种于V-P培养基中，于30℃，140 r/min培养48 h，取菌悬液，8000 r/min离心20 min，吸取1 mL上清液，加入1.0 mL改良O`Meara试剂，振荡均匀，30℃反应60 min，观察颜色变化，测定520 nm处的光密度值，以此判断各菌株产生乙偶姻的能力。

Luria-Bertani液体培养基（LB液体培养基）：胰蛋白胨10.0 g、酵母浸粉5.0 g、氯化钠10.0 g，溶解于1000 mL蒸馏水，pH值7.0，121℃灭菌15 min；LB固体培养基即向LB液体培养基加入2%琼脂粉，121℃灭菌15 min；发酵培养基：葡萄糖120g，酵母浸粉5g，新鲜玉米浆10g，尿素2g，蒸馏水1000mL，115℃灭菌15min；V-P培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾5g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。

产乙偶姻芽孢杆菌的复筛：将分离得到的芽孢杆菌接种至LB液体培养基中，于37℃过夜培养，制得芽孢杆菌种子液，1%的接种量接种于发酵培养基中，于30℃，140 r/min培养48 h，取菌悬液，8000 r/min离心20 min，吸取100 μL上清液，依次加入700 μL肌酸溶液（0.5%，w/v），1.0 mL α-萘酚（5%，w/v），1 mL KOH溶液（40%，w/v），振荡均匀，60℃反应10min，于1 h内测定样品在520 nm处的光密度值。

乙偶姻标准曲线的绘制：用超纯水准确配制50 mg/L的乙偶姻标准溶液母液，依次将其稀释为2.5 mg/L、5 mg/L、7.5 mg/L、10 mg/L、12.5 mg/L、15 mg/L、17.5 mg/L、20 mg/L，分别吸取1 mL标准溶液，依次加入700 μL肌酸溶液（0.5%，w/v），1.0 mL α-萘酚（5%，w/v），1 mL KOH溶液（40%，w/v），振荡均匀，60℃反应10 min，于1 h内测定系列标准溶液的OD

菌株SAU-1的生物学鉴定

1）形态学观察

菌落形态观察：将目的菌株点种于LB固体培养基平板，于37℃培养2 d，观察芽孢杆菌菌落特征；细胞形态观察：采用芽孢染色法对目的菌株染色，并观察其芽孢形态；

2）生化鉴定

采用《常见细菌系统鉴定手册》提供的方法进行生化特征鉴定；

3）16S rDNA分子生物学鉴定

采用试剂盒法对筛选出的优良菌株进行16S rDNA分子生物学鉴定；分别提取保存的纯培养细菌总DNA，采用细菌通用引物27F：5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`和1492R：5`-GGTTACCTTGTTACGACTT-3`对细菌总DNA进行16S rDNA的聚合酶链式反应（PCR）扩增，所得PCR产物送至专业测序公司进行测序。

菌株SAU-1菌落形态为圆形，灰白和偏黄色，褶皱，单菌落不透明，凸起（图1）。

菌株SAU-1为好氧生长，其V-P反应、明胶液化、硝酸盐还原试验、淀粉水解均阳性，在7% NaCl与pH 5.7可生长，革兰氏阳性菌株（表1）。

表1菌株生化鉴定结果

基于16S rDNA对菌株SAU-1进行分子生物学鉴定，测序结果经NCBI进行BLAST比对，同时构建菌株进化树，确定菌株SAU-1为贝莱斯芽孢杆菌（

菌株SAU-1 16S rDNA序列如下：

AAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGG

GCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGC

GATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCG

AACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCC

TTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATG

ATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACC

TTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGT

TGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCA

CCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCA

GAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCA

CATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTC

TTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACT

AAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGAC

TACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGT

CAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTC

TACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCA

AGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACA

TCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGAC

AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGT

GGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTT

GTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCAC

GCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGC

TGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCA

CCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACC

AACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACC

TTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGG

TTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCA

CCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCAT

与现有技术相比，本发明的积极效果是：首次从复杂体系麸醋醋曲中筛选获得产乙偶姻的贝莱斯芽孢杆菌（

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌SAU-1的菌落形态和细胞形态。

图2为贝莱斯芽孢杆菌SAU-1的进化树。

具体实施方式

实施例1：复合麸曲在食醋生产中的应用；

（1）复合麸曲的扩大培养：

1）三角瓶麸曲制备

准确称取麸皮15g于500 mL三角瓶中，按麸皮质量90%加入水，拌合均匀，蒸料灭菌（121℃，30min）；灭菌后，取出物料打散，自然条件下冷却至常温，接种贝莱斯芽孢杆菌SAU-1并37℃培养24h，得到三角瓶种曲；

2）种子罐麸曲制备：称取麸皮80 kg，按麸皮质量的85%加入水拌合均匀，分装于种曲机的格栅中（料层约2~2.5 cm厚），蒸料灭菌（121℃，30 min），冷却至常温，按1%的接种比例接入三角瓶种曲，拌匀；30℃培养72h即得曲种。

（2）种子罐麸曲的投加：在醋醅发酵阶段，将扩培后的种子罐麸曲投入拌料机中，添加量为5%，与曲种、醅糟等原辅料一同拌和均匀，分装于3个发酵槽内（试验组）；以未接种贝莱斯芽孢杆菌SAU-1的发酵槽为对照组，拌料后入池发酵5 d翻醅，之后每间隔2 d机械翻醅一次；控制发酵温度：0~5d醅温低于35℃，5~16d为35℃~42℃，17~25d为35℃~40℃，25~30d为35℃；每次翻醅时检测醋醅酸度、醋醅温度，发酵30 d。

采集发酵结束后取样，在发酵池前、中、后段共取9个点，前、中、后段的醋醅充分混匀，测定其乙偶姻、挥发性风味组分和氨基酸含量；检测结果表明试验组中检测出35种挥发性组分总含量高于对照组中23种挥发性组分，且乙偶姻和游离氨基酸含量分别为20.1 g/L、1390 mg/100mL和6.3 g/L、627 mg/100mL；结果证明贝莱斯芽孢杆菌（

以上的实例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，而并非对本发明的范围进行限定，对于本领域的技术人员来说，可以对上述说明进行改进或变形，但所有的这些改进或变形均应落入本发明的权利要求确定的保护范围。

<110>四川农业大学

<120>一株产乙偶姻芽孢杆菌及在四川麸醋发酵中的应用

<140>

<141>

<160>1

<210>1

<211>1386

<212>DNA

<213>贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400>

aaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgg

gcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgc

gattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccg

aactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccc

tttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatg

atgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcacc

ttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgt

tgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgca

ccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggattgtca

gaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaacca

catgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtc

ttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcact

aaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggac

taccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgt

cagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctc

tacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactca

agttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcaca

tcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggac

aacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgt

ggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcactt

gttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcac

gcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgc

tgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatca

ccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcacc

aactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccacc

ttttatgtctgaaccatgcggttcaaacaaccatccggtattagccccgg

tttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactca

cccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccat