一种固定溶藻细菌技术及其处理铜绿微囊藻的应用

摘要

本发明提出一种固定化溶藻细菌技术及其在处理含铜绿微囊藻污染水中的应用，所得到的微生物菌剂能够显著抑制铜绿微囊藻的生长并显著高于自由细菌，同时对铜绿微囊藻的抗氧化系统产生重大影响，实现微生物控藻的实际运用。原理是利用包埋技术对溶藻细菌进行固定化，采用的手段是海藻酸钠包埋溶藻细菌，并利用乙基纤维素来强化胶囊的悬浮性能。综合来看，作为本发明所述的一种固定化溶藻细菌技术的一种优选方案，其中：所述海藻酸钠溶液浓度为2％(w:v)；所述固化剂的浓度为3％(w:v)；所述乙基纤维素溶液浓度为3％(w:v)。

说明书

技术领域

本发明属于微生物菌剂技术领域，具体涉及一种固定化溶藻细菌技术及其在处理含铜绿微囊藻污染水中的应用。

背景技术

蓝藻水华广泛分布于世界各地的富营养化水域，由于人类过度排放氮和磷等营养元素加速了蓝藻水华爆发的频率。蓝藻水华的过度生长不仅会导致水体生态环境失衡，而且产生的氰毒素对包括人类在内的水生和陆地生命身心健康构成巨大威胁。铜绿微囊藻是蓝细菌关键代表之一。同时铜绿微囊藻也是蓝藻毒素—微囊藻毒素的制造者，这种藻毒素具有肝毒性、神经毒性及生殖毒性。

目前，控制铜绿微囊藻的策略主要包括物理，化学，生物三方面。尽管这些方法快速有效，但是其高成本、操作繁琐且对水生生物及人类存在潜在威胁性限制了它们的大规模应用。微生物控藻技术因其成本低、无需后续操作、不易造成二次污染等优势而受到了广泛的关注，其中溶藻菌在控制铜绿微囊藻中扮演着重要的身份。众所周知大多数的微生物抑藻剂是将具有抑藻作用的单一或多种细菌连同培养基等物质混合制成菌剂，并直接投放到自然水体中使用。然而当溶藻细菌存在于开放环境中时，面对复杂多变的环境因素时，如温度、水体流速和天敌等，他们很难建立稳定的微生物生态系统，因此，溶藻细菌特性的发挥往往受到制约。故而，还需要寻找一种切实可行的办法来保护溶藻细菌。

在诸多方法中，胶囊固定化细菌是一种潜在的解决方案，它可为溶藻细菌的生长、繁殖、工作提供一个安全稳定的环境。目前，已有许多胶囊固定化应用于溶藻细菌控制实际水环境中蓝藻水华的尝试，如在期刊《Harmful Algae》第94卷101798中所述，当溶藻细菌希瓦内拉菌IRI-160被固定在不同的多孔基质上时，包括琼脂糖、藻酸盐水凝胶、纤维素海绵和聚酯泡沫，结果表明藻酸盐固定化的溶藻细菌相比于自由细菌对有害鞭毛藻具有更高的杀藻活性；如在期刊《Journal of Applied Microbiology》第103卷第5期1983-1994页中所述，通过溶藻细菌荧光假单胞菌HYK0210-SK09被固定在几种载体中以控制有害硅藻，与自由生活细菌相比，它对目标藻种表现出更高的活性。海藻酸钠(SA)是一种从海洋褐藻类细胞壁中提取出来的天然多糖，具有良好的生物相容性、粘附性。故而海藻酸钠已被运用于医疗制药、食品制造、生物包埋等多个领域，如在期刊《环境污染物防治》第43卷06期691-696页种所述，以海藻酸钠和壳聚糖作为包埋载体对石油烃降解菌进行固定化处理，对比游离菌剂与固定化小球对模拟油污土壤的处理效果，试验结果表明油烃降解菌固定化后的降解效率比游离菌大幅升高，在石油污染的现场修复中具有更高的应用价值。

本发明通过一种海藻酸钠与二价阳离子交联形成凝胶来封装包裹溶藻细菌的方法，该方法实现了溶藻细菌固定在海藻酸钠中并有效减少外界环境因素的打扰而保持溶藻细菌的原位溶藻性能，这与自由细菌相比，其拥有着更高的生态安全性，更好的生物有效性。此外有研究表明铜绿微囊藻的高密度水域为上层水体，因此如何使胶囊悬浮于水体表面从而达到胶囊最大利用率是本发明研究的另外一个重点。本发明选择可持续性的，低成本，无毒的乙基纤维素用作胶囊外壳材料。乙基纤维素(EC)一般不溶于水并且具有良好的化学物理机械性能，可为我们的溶藻细菌提供稳定的漂浮环境并给予更好的保护，并提高了溶藻细菌对高浓度铜绿微囊藻的针对性。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，针对处理实际水环境中铜绿微囊藻时，溶藻细菌存在缺乏保护及与实验室环境相比降解效率下降的问题，本发明提出一种固定化溶藻细菌技术及其在处理含铜绿微囊藻污染水中的应用，所得到的微生物菌剂能够显著抑制铜绿微囊藻的生长并显著高于自由细菌，同时对铜绿微囊藻的抗氧化系统产生重大影响，实现微生物控藻的实际运用。其原理是利用包埋技术对溶藻细菌进行固定化，采用的手段是海藻酸钠包埋溶藻细菌，并利用乙基纤维素来强化胶囊的悬浮性能。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种固定化溶藻细菌技术，其特征在于：包括，

培养芽孢杆菌：根据芽孢杆菌的生长曲线，将菌株置于牛肉膏蛋白胨液体培养基中活化培养12h至对数生长期后期，并用牛肉膏蛋白胨液体培养基将发酵液的光密度在600nm处调节至1.50。离心菌株发酵液并弃去上清液，将细胞沉淀重悬于超纯水中，获得菌悬液待用。

制备海藻酸钠溶液：将海藻酸钠溶于蒸馏水中，加热25℃下磁力搅拌溶解，得到海藻酸钠溶液。

制备海藻酸钠与溶藻细菌混合溶液：在恒温磁力搅拌机中以1500rpm、25℃搅拌海藻酸钠溶液并加入上述菌悬液，得到海藻酸钠与溶藻细菌混合溶液。

配置固化剂：称取CaCl

固定化菌株：磁力搅拌机以750rpm下搅拌固化剂，吸取海藻酸钠与溶藻细菌混合溶液于恒压漏斗中，在距固化剂液体表面10cm处调整针头以30次min

乙基纤维素包埋：将乙基纤维素溶解于无水乙醇中制备乙基纤维素溶液。将干燥后的海藻酸钠胶囊置于乙基纤维素溶液中，磁力搅拌25min。经滤网过滤，用无水乙醇清洗1次，超纯水清洗3次后，放置于35℃烘箱中干燥，得到微生物菌剂。保存于4℃冰箱待用。

为本发明所述的一种固定化溶藻细菌技术的一种优选方案，其中：所述芽孢杆菌，为芽孢杆菌Bacilius sp.，其保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21172。

作为本发明所述的一种固定化溶藻细菌技术的一种优选方案，其中：所述牛肉膏蛋白胨液体培养基，包括，

NaCl 1g、鱼粉蛋白胨2g、牛肉膏1g，加入200mL蒸馏水，调节pH至7.0～7.2，高温灭菌后待用。

作为本发明所述的一种固定化溶藻细菌技术的一种优选方案，其中：所述海藻酸钠溶液浓度为0.5～3.5％(w:v)。

作为本发明所述的一种固定化溶藻细菌技术的一种优选方案，其中：所述制备海藻酸钠与溶藻细菌混合溶液，其中菌悬液体积即为细胞沉淀重悬的超纯水体积，为50～150ml；所述添加海藻酸钠与菌悬液的体积比为2：1～3。

作为本发明所述的一种固定化溶藻细菌技术的一种优选方案，其中：所述固化剂的浓度为1～5％(w:v)。

作为本发明所述的一种固定化溶藻细菌技术的一种优选方案，其中：所述乙基纤维素溶液浓度为1～5％(w:v)。

作为本发明所述的一种固定化溶藻细菌技术的一种优选方案，其中：所述海藻酸钠溶液浓度为2％(w:v)。

作为本发明所述的一种固定化溶藻细菌技术的一种优选方案，其中：所述固化剂的浓度为3％(w:v)；所述乙基纤维素溶液浓度为3％(w:v)。

作为本发明所述的一种固定溶藻细菌技术所制得的微生物菌剂，其特征在于：所述应用，包括，

取微生物菌剂接种于铜绿微囊藻液中，并于20～30℃下培养。

本发明有益效果：

(1)本发明将菌株发酵液与包埋剂混合后形成固定化胶囊，加之乙基纤维素覆膜形成以溶藻细菌为核心的悬浮型缓释胶囊，实现对铜绿微囊藻的微生物降解处理。

(2)本发明利用固化剂对溶藻细菌进行包埋能够解决微生物降解铜绿微囊藻过程中易受外界环境因素影响的问题，同时保护了对微生物降解活性。此外，本发明微生物固定化为实现微生物治理铜绿微囊藻提供技术支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明所述微生物菌剂实物图。

图2为本发明所述微生物菌剂电子扫描显微镜图。

图3为本发明所述微生物菌剂包埋不同浓度菌株发酵液对铜绿微囊藻细胞的影响图。

图4为本发明所述微生物菌剂包埋不同浓度菌株发酵液对铜绿微囊藻叶绿素a的影响图。

图5为本发明所述微生物菌剂不同浓度对铜绿微囊藻超氧化物歧化酶的影响图。

图6为本发明所述微生物菌剂不同浓度对铜绿微囊藻MDA的影响示意图。

图7为不同SA浓度对胶囊溶藻及悬浮性能的影响示意图。

图8为固化剂的类型和浓度对固定化溶藻细菌的稳定性与活性的关系示意图。

图9为不同浓度的EC应用于SA-胶囊的包被覆膜对7d降解效率及各胶囊的悬浮性能的影响示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明实施例中牛肉膏蛋白胨液体培养基制备过程如下：称取NaCl 1g、鱼粉蛋白胨2g、牛肉膏1g，加入200mL蒸馏水，调节pH至7.0～7.2，高温灭菌后待用。固体培养基再加4g琼脂粉。

本发明实施例中铜绿微囊藻液的培养过程如下：将铜绿微囊藻培养基以5:1(v:v)与铜绿微囊藻液进行混匀并置于恒温光照培养箱中(温度为25℃，光照强度为3200Lux，光暗比12h:12h)，待用。其中所述铜绿微囊藻培养基成分为：称取NaNO

本发明所使用芽孢杆菌的菌株保藏日期为2020年11月13日，保藏编号为CGMCCNo.21172。分类命名为芽孢杆菌(Bacilius sp.)，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

本发明中所使用试剂盒均购于中国南京建成生物工程研究所，试剂盒1编号为A001-3-2、试剂盒2编号为A003-1-1。

本发明中所述其他原料，若无特殊说明，均为市售。

实施例1

一种溶藻细菌固定化方法，具体包括以下步骤：

培养芽孢杆菌：根据芽孢杆菌的生长曲线，将菌株置于牛肉膏蛋白胨液体培养基中活化培养12h至对数生长期后期，并用牛肉膏蛋白胨液体培养基将发酵液的光密度在600nm处调节至1.50。离心菌株发酵液并弃去上清液，将细胞分别沉淀重悬于50ml、100ml、150ml的超纯水中，获得菌悬液待用。

制备海藻酸钠溶液：将2g海藻酸钠溶于100ml蒸馏水中，加热25℃下磁力搅拌溶解，制备2％(v:v)的海藻酸钠溶液。

制备海藻酸钠与溶藻细菌混合溶液：在恒温磁力搅拌机中以1500rpm、25℃搅拌100ml的海藻酸钠溶液并分别加入上述体积为50ml、100ml、150ml的菌悬液，配置成不同体积比的海藻酸钠与溶藻细菌混合溶液。

配置固化剂：定量称取3g Cacl

固定化菌株：用磁力搅拌机以750rpm搅拌固化剂，采用注滴法制备海藻酸钠胶囊。吸取海藻酸钠与溶藻细菌混合溶液于恒压漏斗中，在距固化剂液体表面10cm处(由于溶液表面张力而形成的液滴，该距离能够克服冲击形成球形珠)调整针头以30次min

乙基纤维素包埋：将乙基纤维素溶解于无水乙醇中制备3％(w:v)乙基纤维素溶液。将干燥后的海藻酸钠胶囊置于乙基纤维素溶液中，磁力搅拌25min。经滤网过滤，用无水乙醇清洗1次，超纯水清洗3次后，放置于35℃烘箱中干燥，得到微生物菌剂。最后保存于4℃冰箱待用。

实施例2

为考察固定化微生物包埋情况，取实施例1中包埋菌悬液体积为50mL的微生物菌剂于扫描电子显微镜中观察，结果如图2。

菌剂呈现圆球状，直径约为1mm，菌剂外表面呈现出粗糙且多孔，而这些的多孔缝隙能为所保护的溶藻细菌提供营养的途径，同时在菌剂内部溶藻细菌呈现团聚形态，以及所使用的海藻酸钠材料对于其有着非常良好的保护，并且在藻酸盐包裹下呈现出多丝状，这可为包裹溶藻细菌提供保护作用并不伤害其对营养成分的吸收。

实施例3

为考察微生物菌剂对铜绿微囊藻藻细胞效果，分别取实施例1中包埋菌悬液体积分别为50mL、100mL、150mL的微生物菌剂接种于500mL藻细胞为(7.5×10

由图3可知，在试验期间各浓度的胶囊均较自由细菌组更能对铜绿微囊藻产生抑制作用，在使用包埋体积为150mL的胶囊处理7d时溶藻率能高达到87.02％±0.67％，且低包埋体积(50mL)胶囊处理7d时溶藻率仍能达到77.67％±1.14％。

实施例4

为考察微生物菌剂对铜绿微囊藻叶绿素a效果，分别取实施例1中包埋菌悬液体积分别为50mL、100mL、150mL的微生物菌剂接种于500mL藻细胞为(7.5×10

由图4可知，试验期间自由细菌与微生物菌剂处理组的叶绿素a含量降低趋势基本一致，但随着暴露时间的增加，各微生物菌剂组每天的叶绿素a含量降低程度更高。

实施例5

为考察微生物菌剂对铜绿微囊藻超氧化物歧化酶(SOD)效果，分别取实施例1中包埋体积分别为50mL、100mL、150mL的微生物菌剂接种于500mL藻细胞为(7.5×10

图5所示微生物菌剂显著影响铜绿微囊藻的SOD提升，试验期间各处理组SOD含量较对照组均有显著的提升，其中在试验中期暴露于包埋体积为150mL胶囊SOD酶活性提升最为显著，较空白组提升2.94～4.35倍。

实施例6

为考察微生物菌剂对铜绿微囊藻MDA的影响，分别取实施例1中微生物菌剂包埋体积分别为50mL、100mL、150mL接种于500mL藻细胞为(7.5×10

由图6可知，所示微生物菌剂显著诱导铜绿微囊藻的MDA提升，试验期间各处理组MDA含量较对照组均有显著的提升，在试验中期，包埋体积为150mL胶囊处理组MDA为最高值24.26±1.10nmol·mg

实施例7

检验0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5％(w:v)的海藻酸钠浓度对胶囊溶藻及胶囊悬浮性能的影响。制备微生物菌剂的步骤除海藻酸钠浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5％(w:v)外，其他步骤与实施例1相同。所得结果如图7所示。

胶囊性能测定：

(A)悬浮性能的测定方法为置于藻液中用观察计数法

(B)包埋率：取1±0.001g胶囊置于0.1mol·L

结果如下：

图7表示为进行试验以评估不同SA浓度对胶囊溶藻及悬浮性能的影响。当SA浓度从0.5增加至2g 100mL

在悬浮性方面，SA浓度在0.5～2.5g 100mL

实施例8

检验1、2、3、4、5％(w:v)的CaCl

胶囊性能测定：

(A)悬浮性能的测定方法为置于藻液中用观察计数法

(B)包埋率：取1±0.001g胶囊置于0.1mol·L

结果如下：

固化剂的类型和浓度影响固定化溶藻细菌的稳定性与活性，选用CaCl

此外，在悬浮性方面，在2g 100mL

实施例9

检验1、2、3、4、5％(w:v)的乙基纤维素浓度对胶囊溶藻及胶囊悬浮性能的影响。制备微生物菌剂的步骤除乙基纤维素浓度分别为1、2、3、4、5％(w:v)外，其他步骤与实施例1相同。所得结果如图9所示。

胶囊性能测定：

(A)悬浮性能的测定方法为置于藻液中用观察计数法

(B)包埋率：取1±0.001g胶囊置于0.1mol·L

结果如下：

将浓度为1～5％(w:v)EC应用于SA-胶囊的包被覆膜，以研究其对铜绿微囊藻的7d降解效率及各胶囊的悬浮性，结果如图9所示。在铜绿微囊藻中培育7d时，观察到1g 100mL

在悬浮性能方面，悬浮性随着EC溶液浓度增加而增加，当EC为2～5g 100mL

本发明将菌株发酵液与包埋剂混合后形成固定化胶囊，加之乙基纤维素覆膜形成以溶藻细菌为核心的悬浮型缓释胶囊，实现对铜绿微囊藻的微生物降解处理。

本发明利用固化剂对溶藻细菌进行包埋能够解决微生物降解铜绿微囊藻过程中易受外界环境因素影响的问题，同时保护了对微生物降解活性。此外，本发明方法微生物固定化为实现微生物治理铜绿微囊藻提供技术支持。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。