通过气道內滴人间充质干细胞治疗肺部纤维化的装置

摘要

本发明涉及通过气道內滴人间充质干细胞治疗肺部纤维化。具体地，本发明提供了一种通过气道內滴人间充质干细胞治疗肺部纤维化的方法和装置。所述装置包括：(a)第一容器，所述容器内装有第一药物组合物，所述的第一药物组合物含有人间充质干细胞和药学上可接受的载体；(b)用于撑开气道的撑开器，所述撑开器用于撑开患者的气道；(c)滴入器，所述滴入器用于将所述第一药物组合物滴入患者气道，并且所述滴入器被配置为其远端可置入被撑开的所述气道中，并通过所述远端将第一药物组合物滴入气道；和(d)连接管，所述连接管用于连接所述的第一容器与所述滴入器，形成供所述第一药物组合物流动的流道；其中，所述的第一药物组合物是液态制剂，并且对气道和肺部无刺激性。不同于切开颈部经过支气管注射给药的方法，本发明的装置中人间充质干细胞经由气道内滴的方式给药，属于无创伤给药方法。

说明书

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体地涉及通过气道內滴人间充质干细胞治疗肺部纤维化。

背景技术

肺纤维化是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变，也就是正常的肺泡组织被损坏后经过异常修复导致结构异常(疤痕形成)。绝大部分肺纤维化病人病因不明(特发性)，最常见的以肺纤维化病变为主要表现形式的疾病类型为特发性肺纤维化(IPF)，是一种能导致肺功能进行性丧失的严重的间质性肺疾病。肺纤维化严重影响人体呼吸功能，表现为干咳、进行性呼吸困难(自觉气不够用)，且随着病情和肺部损伤的加重，患者呼吸功能不断恶化。特发性肺纤维化发病率和死亡率逐年增加，诊断后的平均生存期仅2.8年，死亡率高于大多数肿瘤，被称为一种“类肿瘤疾病”。迄今为止，被诊断出是肺纤维化时，基本是中晚期，尚无有效的治疗方法。肺纤维化的死亡率每年都在增加。所以被国家列为罕见病类。

近些年来研究人员已经研究了来自不同来源的干细胞(例如，脂肪MSCs，骨髓MSCs和来自华通氏胶的人类脐带间质干细胞)(HUMSC)在肺中抑制炎症反应或急性损伤的作用。然而，在大多数相关研究中，干细胞是在肺损伤后立即或损伤后一天即进行移植，从而只聚焦在干细胞治疗急性损伤或预防肺部炎症，因而预防肺纤维化的形成。

这些治疗的给药途径都是通过静脉输入干细胞，虽然干细胞经静脉进入体内最先到达的脏器是肺部，但这些实验的结果大多是缓解纤维化的进程。

在临床上，大部分因为呼吸问题寻求诊疗的患者并不是处于早期阶段，而是已经发展成肺纤维化的状态，而现有的临床用药效果只能减缓病人症状，没有实质性的改善，且价格昂贵，因此有必要提供新的、有效的肺纤维化病症的治疗手段以及精准的给药途径，从而达到不仅延缓纤维化的进程，更重要的是能逆转肺纤维化的状态，真正解决纤维化是不治之症的现状。目前，干细胞临床使用的途径都是通过静脉注射到达全身，并非精准的给药方式，也造成了输入干细胞利用率降低，无法充分的发挥干细胞治疗疾病的优势。

因此，本领域迫切需要开发新的有效的、无创的治疗肺纤维化的方法和设备。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的有效而无创地治疗肺纤维化的方法和设备。

在本发明的第一方面，提供一种无创式通过气道內滴人间充质干细胞治疗肺部纤维化的装置，所述装置包括：

(a)第一容器，所述容器内装有第一药物组合物，所述的第一药物组合物含有人间充质干细胞和药学上可接受的载体；

(b)用于撑开气道的撑开器，所述撑开器用于撑开患者的气道；

(c)滴入器，所述滴入器用于将所述第一药物组合物滴入患者气道，并且所述滴入器被配置为其远端可置入被撑开的所述气道中，并通过所述远端将第一药物组合物滴入气道；和

任选的(d)连接管，所述连接管用于连接所述的第一容器与所述滴入器，形成供所述第一药物组合物流动的流道；

其中，所述的第一药物组合物是液态制剂，并且对气道和肺部无刺激性。

在另一优选例中，所述的撑开器包括支气管镜。

在另一优选例中，所述的支气管镜包括可曲支气管镜，优选地为电子纤维支气管镜。

在另一优选例中，支气管镜包括给药通道。

在另一优选例中，所述的滴入器包括注射器。

在另一优选例中，所述滴入器包括注射器、滴头。

在另一优选例中，所述的连接管为软管。

在另一优选例中，所述滴入器或其远端通过患者口腔或鼻腔，到达气管根部(即主干气道与支气管的分叉处，或主支气管与次级支气管的分叉处)。

在另一优选例中，所述的连接管的一端连接于所述第一容器，另一端连接于所述滴入器的近端。

在另一优选例中，所述的装置还包括：用于蠕动泵或剂量泵，所述的蠕动泵或剂量泵设置于所述连接管上，用于泵送所述的第一药物组合物。

在另一优选例中，所述的装置还包括：阀门，所述阀门设置于所述连接管上，并用于开启和关闭所述的连接管中的流道。

在另一优选例中，所述的第一容器为试剂瓶。

在另一优选例中，所述的第一药物组合物的体积为0.1-200ml，优选地为 0.3-100ml。

在另一优选例中，所述的第一药物组合物中的人间充质干细胞的数量为1×10

在另一优选例中，所述的人间充质干细胞的剂量为1×10

在另一优选例中，所述的人间充质干细胞可以来自各种来源，包括自体的(autologous)、同种异体的(allogenic)或异种的(xenogenic)。

在另一优选例中，所述的人间充质干细胞是从脐带的华通氏胶或吸脂的脂肪中分离的。

在另一优选例中，所述的第一药物组合物的pH值为7-7.4，和/或渗透压为 310-340mOsmol/Kg。

在另一优选例中，所述的人间充质干细胞的pH值为7.1，渗透压为 330mOsmol/Kg。

在另一优选例中，所述的装置为无菌的。

本发明第二方面提供一种第一方面所述的装置的用途，用于制备治疗肺纤维化的医疗产品。

在另一优选例中，所述的医疗产品为医疗器械。

在另一优选例中，所述的医疗产品用于改善患者的肺功能。

在另一优选例中，所述的肺功能的指标(或参数)选自下组：用力肺活量(FVC，mL)、肺顺应性(Cdyn，mL/cm H

在另一优选例中，所述的肺纤维化包括选自下组的症状：肺部的胶原沉积水平升高、肺部的炎性细胞浸润水平升高、肺泡总数量减少、纤维化的肺泡数量增加、或其组合。

在另一优选例中，所述医疗产品通过对气道无创的方式通过气道内滴方式，将含人间充质干细胞的第一药物组合物施用于患者。

在另一优选例中，所述施用包括步骤：

(s1)通过所述撑开器、滴入器和任选地连接管，向需要治疗的受试者经由气道内滴人间充质干细胞；

和任选地(s2)使所述的受试者头部抬高(即高于脚部或下半身)，并且当预定给药部位为左肺时，采用左侧卧位姿势；和/或当预定给药部位为右肺时，采用右侧卧位姿势。

本发明的第三方面，提供一种通过无创的内滴方式施用人间充质干细胞治疗肺部纤维化的方法，所述方法包括：

(i)提供第一方面所述的装置；

(ii)用所述撑开器撑开患者的气道，将所述滴入器置入被撑开的所述气道中，并通过所述滴入器远端将第一药物组合物滴入气道，所述第一药物组合物含有人间充质干细胞和药学上可接受的载体；并且，所述的第一药物组合物是液态制剂，并且对气道和肺部无刺激性。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，使患者采用以下体位：头部抬高(即高于脚部或下半身)；并且当预定给药部位为左肺时，采用左侧卧位姿势；和/或当预定给药部位为右肺时，采用右侧卧位姿势。

在另一优选例中，所述的气道内滴是在不同于切开颈部的情况下进行的。

在另一优选例中，所述的气道内滴是经支气管注射给药。

优选地，所述人间充质干细胞(MSCs)经由气道内滴施用，可使MSCs直接到达病灶部位，利用不同的给药体位，药物可分别到达左肺和/或右肺。

优选地，所述的气道内滴，可最大程度的将药物(近乎100％)送达指定位置，不同于静脉注射、肌肉注射等，药物不经体内循环代谢直达病灶部位。

在另一优选例中，所述的MSCs有效降低、缓解或逆转重度纤维化为中度纤维化症状，所述的肺部的纤维化症状选自下组：肺部的胶原沉积水平升高，肺部的炎性细胞浸润水平升高，肺泡数量增多，上述症状是与正常水平相比而言。

在另一优选例中，所述的MSCs有效地提升或降低一或多种选自下组的症状：用力肺活量(FVC，mL)、肺顺应性(Cdyn，mL/cm H

在另一优选例中，所述的MSCs有效促进已经在肺中发生的纤维化组织的降解。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示经过锆元素标记的人间充质干细胞通过气道内滴的给药方法到达大鼠的右肺，其他部位没有干细胞的分布。

图2显示经过锆元素标记的人间充质干细胞通过气道内滴的给药方法到达大鼠的双肺，其他部位没有干细胞的分布。

图3显示人间充质干细胞对大鼠气道内滴注博来霉素致左肺纤维化大鼠肺脏病变的影响。

图4显示人间充质干细胞对大鼠气道内滴注博来霉素致肺纤维化大鼠肺功能的影响。

图5显示人间充质干细胞对大鼠气道内滴注博来霉素致肺纤维化大鼠病变程度的影响。

图6显示人间充质干细胞对大鼠气道内滴注博来霉素致肺纤维化大鼠存活率(％)的影响，干细胞可以肺纤维化大鼠的存活率。

图7显示人间充质干细胞对大鼠气道内滴注博来霉素致肺纤维化大鼠脏体比(％)的影响。

图8显示人间充质干细胞对大鼠气道内滴注博来霉素致肺纤维化大鼠体重(g) 的影响。

图9显示人间充质干细胞移植对大鼠左肺HE染色分析。

图10显示人间充质干细胞移植对大鼠心脏的影响。

图11显示人间充质干细胞移植对大鼠肝脏的影响。

图12显示了本发明一个实例中，用于本发明装置的撑开器的结构，所述撑开器为支气管镜。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量的研究，首次开发了一种新型的无创且有效地治疗肺纤维化的装置和方法。具体地，本发明采用人间充质干细胞，配合特定的给药方式和给药装置，可以使用体积和/或数量更少量的间充质干细胞，通过单次或多次气道内滴方式，来显著改善和缓解肺纤维化。实验表明，在没有直接在肺部的病灶或靠近病症的部位给药的情况下，出乎意料的是，通过气管根部(即主干气道)给药，经肺部传导作用或者其他复杂的机理，居然使得远端(或远处或末端)的肺纤维化也得到改善，甚至逆转。在此基础上完成了本发明。

术语

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。

如本文所使用的，冠词“一”和“一个”是指冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一个元素”是指一个元素或多于一个元素。

术语“包括”或“包含”通常以包括/包括允许存在一个或多个特征，成分或组分的意义来使用。术语“包括”或“包含”涵盖术语“由...组成”或“由...... 组成”。

无创式气道內滴装置

本发明提供了一种无创式通过气道內滴人间充质干细胞治疗肺部纤维化的装置。

所述装置包括：

(a)第一容器，所述容器内装有第一药物组合物，所述的第一药物组合物含有人间充质干细胞和药学上可接受的载体；

(b)用于撑开气道的撑开器，所述撑开器用于撑开患者的气道；

(c)滴入器，所述滴入器用于将所述第一药物组合物滴入患者气道，并且所述滴入器被配置为其远端可置入被撑开的所述气道中，并通过所述远端将第一药物组合物滴入气道；和

任选地(d)连接管，所述连接管用于连接所述的第一容器与所述滴入器，形成供所述第一药物组合物流动的流道；

其中，所述的第一药物组合物是液态制剂，并且对气道和肺部无刺激性。

在另一优选例中，本发明装置还包括说明书，记载了无创式通过气道內滴人间充质干细胞治疗肺部纤维化的方法。

优选地，所述的撑开器为可曲支气管镜，优选地为电子纤维支气管镜(如图 12)。

优选地，所述的人间充质干细胞的剂量为10

优选地，所述的人间充质干细胞的pH值为7-7.4(更优选地为7.1)；和/或渗透压为310-340mOsmol/Kg(更优选地为330mOsmol/Kg)。

本发明所述装置的使用方法，包括(s1)通过所述撑开器、滴入器连和任选地连接管，向需要治疗的受试者经由气道内滴人间充质干细胞；

和任选地(s2)使所述的受试者头部抬高，如高于脚部或下半身例如10-20°，优选地为15°。

优选地，所述受试者呈左侧和/或右侧卧位(50-70°，优选地为60°)姿势。

优选地，所述撑开器、滴入器，和任选地(d)连接管共同构成了一给药系统或给药装置，所述给药装置可包括支气管镜。

当受试者为人，优选通过支气管镜进行给药。采用支气管镜时，有助于清楚地观察到各肺叶部位，并在观察到部位的同时或之后，将本发明的人间充质干细胞的细胞制剂施用于所述病灶(或病灶上游的支气管处或气管根部处)。

本发明装置中的人间充质干细胞是通过气道内滴的给药方式给药，不同于切开颈部经过支气管注射给药，属于无创伤给药方法。

间质干细胞(MSCs)

如本文所用，“间质干细胞(MSCs)”是指人脐带中华通氏胶中或吸脂里脂肪中的间质组织(mesenchymal tissue)，包括未纯化的细胞培养物或纯化的细胞。MSCs 是多能的(multipotent)，可以分化成多种细胞类型，如成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。MSCs具有许多优点。出生后被认为是医疗废物的脐带很容易获得，吸脂后的脂肪也是一种医疗废弃物，没有伦理上的顾虑，MSCs 可以通过从源头上的简单处理即可取得，并且细胞数量很多，还能够在培养物中快速扩增。具体而言，MSCs的免疫原性很低，异体使用不会引起免疫反应，因此可用于异体治疗。

适用于本发明的MSCs可以来自脐带“华通氏胶(Wharton's jelly)”或吸脂里的脂肪。如本文所述的MSCs可以以多种方式获得。例如，它们可能来自脐带组织或吸脂时的脂肪组织。脐带组织或脂肪可以通过切碎，洗涤，酶促消化或其任何组合进行处理。细胞使用无异源蛋白的培养基培养。细胞可以基于其在本领域中已知的特征来确认或选择，例如，涡旋状贴壁生长，细胞形状为梭型；例如CD105、CD44、 CD90和/或CD73的高于90％的阳性表达，和/或HLA、CD34、CD14、CD19和/或CD45 低于2％的阴性表达。

在一些具体实施方案中，可以在合适的等渗液体，例如，磷酸盐缓冲盐水，培养基，例如，DMEM，生理盐水，葡萄糖水溶液和/或其混合物以及本领域技术人员已知的其它合适的液体中制备UMSCs溶液。应该保护最终的治疗形式免受污染，并应该能够抑制微生物如细菌或真菌的生长。可以施用单一的施用剂量。或者，可以使用缓慢的长期输注或多个短期的每日输注。如果需要，也可以使用每隔几天交替一天或一次给药。本发明的人间充质干细胞制剂辅料组分，由药用级组分配制而成，可直接随细胞回输至人体，对细胞无毒性，不影响细胞的免疫表型、细胞因子分泌、细胞增殖等特性，是临床级别的细胞保护剂。

如本文所述，肺纤维化会造成大鼠的肺功能受到影响，用力肺活量(FVC，mL)、肺顺应性(Cdyn，mL/cm H

如本文所用，如本文所述的与肺纤维化病症有关的指数或症状的降低或升高的水平是参照其对照(或正常)水平。由专业病理负责人采用光学显微镜进行组织病理学检查。采用标准术语进行诊断和分级。采用4分级系统对显微镜检查结果进行分级，分别为轻微(+)，轻度(++)，中度(+++)，重度(++++)，以便于进行组间比较。与对照(或正常)水平相比而言。

如本文所用的术语“需要治疗方法的个体”是表示需要治疗肺纤维化或肺部的纤维化病症的人类或非人类动物。具体而言，需要治疗方法的个体是患有肺部的一或多种纤维化病症的个体。

如本文所用的术语“需要治疗方法的个体”是表示需要治疗肺纤维化或肺部的纤维化病症的人类或非人类动物。具体而言，需要治疗方法的个体是患有肺部的一或多种纤维化病症的个体。

在一些具体实施方案中，MSCs有效降低、缓解甚至逆转一或多种肺部的纤维化症状，所述的肺部的纤维化症状选自以下所组成的群组：肺部的胶原蛋白沉积水平升高，肺部的炎性细胞浸润水平升高，与正常水平相比而言。

在一些具体实施方案中，MSCs有效地提升用力肺活量(FVC，mL)、肺顺应性 (Cdyn，mL/cm H

在一些具体实施方案中，MSCs精准的到达指定部位，充分有效的促进已经在肺中发生的纤维化组织的降解。

在某些具体实施方案中，需要本发明治疗方法的个体是被诊断患有特发性肺纤维化(IPF)的患者。

在此使用的术语“患者”“个体”或“主体”包括人类和非人类动物，如伴侣动物(如狗，猫等)，农场动物(如牛，绵羊，猪，马等)，或实验动物(如大鼠，小鼠，豚鼠等)。

如本文所用的术语“治疗”是指将包含一种或多种活性剂的组合物施用或施用于患有疾病，疾病病症或疾病症状或疾病进展(恶化)的对象，目的是治愈，治愈，缓解，舒解，改变，改善，改良，增进或影响该疾病，该疾病的病症或症状，疾病诱发的障碍或障碍的进展。具体而言，如本文中所使用的，治疗肺纤维化或肺部纤维化的症状包括完全地或部分地帮助从纤维化恢复或逆转为正常状态。

本文使用的术语“治疗有效量”是指活性成分在治疗对像中提供所需的治疗或生物作用的量。例如，用于治疗肺部的纤维化症状的有效量可以是UMSCs的量，其足以使疾病状态完全地或部分地从疾病状态朝向正常水平恢复(或逆转)。

治疗有效量可以根据各种原因而改变，例如给药途径和频率，接受所述药物的个体的体重和种类，以及给药目的。本领域技术人员可以根据本文的公开内容，确定的方法和他们自己的经验确定每种情况下的剂量。例如，在某些具体实施方案中， UMSCs以每次施用至少10

根据本发明，间充质干细胞可以来自各种来源，包括自体的(autologous)，同种异体的(allogenic)或异种的(xenogenic)。

特别地，为了实施本发明的方法，可以将UMSCs直接递送至气管并因此递送至肺。在本发明的较佳实施例中，通过直接注射将UMSCs递送至期望的区域，且不产生创伤。作为活性成分的UMSCs也可以与药学上可接受的载体一起配制以形成适合形式的药物组合物(例如，作为细胞悬浮液)以用于递送。取决于给药方式，本发明的药物组合物可包含约0.1重量％至约100重量％的活性成分，其中基于整个组合物的重量计算重量百分比。“医药上可接受的载体”在所采用的剂量和浓度下对个体是无毒的，并且与UMSCs和包含UMSCs的任何制剂的任何其他成分兼容。例如，用于含有UMSCs的制剂的合适的药学上可接受的载体可以包括但不限于甘露醇，水，林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。

气道内滴给药

本发明还提供了一种通过无创的内滴方式施用人间充质干细胞治疗肺部纤维化的方法，所述方法包括：

(i)提供如上所述的无创式气道內滴装置；

(ii)用所述撑开器撑开患者(人)的气道，将所述滴入器置入被撑开的所述气道中，并通过所述滴入器远端将第一药物组合物滴入气道，所述第一药物组合物含有人间充质干细胞和药学上可接受的载体；并且，所述的第一药物组合物是液态制剂，并且对气道和肺部无刺激性。

本发明主要优点包括：

(a)通过本发明的装置，可通过无创方式在气管根部给药，从而减少给药痛苦，缩短疗程，并提高肺纤维化的疗效。

(b)在本发明中，通过特定的无创的内滴给药装置和方法，可以减少人间充质干细胞的剂量和/或制剂的体积，从而缩短给药时间或提高单位时间内的给予的人间充质干细胞的数量。

(c)在本发明中，通过无创的内滴方式给予的间充质干细胞不经过静脉或其他器官，因此100％到达肺部(包括纤维化部位或非纤维化部位)，从而更有效发挥作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法

组织病理学检查

所有动物(包括发现死亡动物)均进行解剖，并保存组织。发现动物非工作时间死亡后放置2-8℃冰箱保存，并于24小时内尽快进行解剖。解剖并留取组织后，动物尸体按医疗垃圾处理。

尸检过程中，观察动物肺脏、气管、支气管、心脏及肝脏是否异常。分离肺脏、心脏、肝脏并清除脂肪等组织，滤纸吸干表面液体，称脏器重量(包括发现死亡、濒死安乐死动物)，用于计算脏体比。全肺及细支气管和每组前2只存活动物的心脏、肝脏置于10％中性缓冲福尔马林溶液中固定、石蜡包埋、切片、制片、HE染色进行肺组织病理学检查。

脏体比(％)＝脏器重/体重×100％。

数据采集和统计分析

数据采集：数据采用系统生成和人工记录的方式采集。

数据分析：本试验采用的统计学软件SPSS13.0或GraphPad Prism 5对数据进行处理。所有统计分析采用双尾分析，统计学水平设在P≤0.05。数据均以“平均数±标准差”表示。

实施例1肺纤维化动物模型的建立

1.1实验动物和饲养条件

实验所使用的实验动物是Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)，体重约245-350g，饲养方式为45×24×20cm的透明PC笼子饲养，每日照光12小时(上午七点半至下午七点半)，环境温度恒温空调(22±2℃)并且充分供应饲料(Laboratory Animal Diets MF18)与饮用水，每星期更换垫料一次。

1.2左肺纤维化的动物模型建立

动物采用腹腔注射水合氯醛(约350mg/kg，100mg/mL)麻醉，然后固定于呈 45°放置的大鼠固定器上，使用小动物麻醉咽喉镜，压住动物舌根部，暴露声门，将抽取0.3mL供试品(博来霉素(BLM)，溶剂为细胞保存液)的注射器与非雾化器针头连接，然后缓慢推动活塞(50～60μL/min)，将供试品滴注进入气道，动物保持左侧卧位约90min，使供试品尽可能的集中于左肺叶。

1.3人类间质干细胞的分离、培养

采用分娩后的脐带或吸脂后的脂肪，以无菌方式收集并保存于4℃含有1％双抗的DMEM中，48小时内进行干细胞的分离培养。实验室是B+A层流，实验器械皆是无菌器械。

在生物安全柜中将脐带或脂肪取出，并用无菌PBS+1％双抗反复冲洗数次，再把脐带或脂肪剪成小与4mm的小块，加入少量完全培养基混匀，用无菌塑料滴管移植适量带有组织碎块的混合液至10cm的无菌培养皿中，放入5％CO

每两天半量换液至细胞的融合度至60％时，全量换液至细胞融合度达到80％，用胰酶消化，传代至所需要的细胞数量。

1.4对左肺纤维化的动物模型的给药

对于1.2中制备的左肺纤维化的动物模型(雄性大白鼠(SD rats，体重约 245-350g))，在预定的天数，将动物采用腹腔注射水合氯醛(约350mg/kg，100 mg/mL)麻醉，然后固定于呈45°放置的大鼠固定器上，使用小动物麻醉咽喉镜，压住动物舌根部，暴露声门，将肺部微型液体非雾化器针头(钝性)轻柔的插入气管内约1cm，再将动物从固定器上取下，放置于操作台上，头部略高尾部略低约呈15 °，左侧卧位呈60°，将抽取0.3mL细胞保存液(含低剂量或高剂量的步骤1.3中制备的人间充质干细胞)的注射器与非雾化器针头连接，然后缓慢推动活塞(50～60 μL/min)，将细胞保存液滴注进入气道，动物保持左侧卧位约90min，使细胞保存液尽可能的集中于左肺叶。

其中，实验动物共分五组：(每组7只)

第一组为模型对照组，即在气管内接受200μl 2mg博来霉素(BLM)后的第28 天或第35天处死，用于观察纤维化的程度

第二组为单次给药低剂量组，即在造模后的第21天，气管内移植低剂量的干细胞(低剂量为1×10

第三组为单次给药高剂量组，即在造模后的第21天，气管内移植高剂量的干细胞(高剂量为1×10

第四组为两次给药低剂量组，即在造模后的第28天和35天，经气管内每次移植低剂量1×10

第五组为两次给药高剂量组，即在造模后的第28天和35天，经气管内每次移植高剂量1×10

1.5实验动物肺功能检测

D49(单次给药组动物及模型对照组前3只动物)、D63动物(安乐死前)腹腔注射水合氯醛(约350mg/kg，100mg/mL)实施麻醉，颈部正中央纵向切开，分离气管，并朝尾方向插入导管并用缝合丝线结扎固定。动物放入体描箱支撑板上，气管导管与体描箱内的气路相连，然后将体描箱关闭。

采用AniRes2005动物肺功能分析系统进行肺顺应性(Cdyn)、气道阻力(RL)、用力肺活量(FVC)等指标检测。设置呼吸机呼吸频率65次/min、呼吸比20:10，负压控制器设置30cm H

1.6动物安乐死

根据AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals:2013 Edition(theAmerican Veterinary Medical Association,2013)，D49(单次给药组动物及模型对照组前3只动物)、D63所有动物在肺功能检测完毕后(动物如果苏醒，腹腔注射水合氯醛首次麻醉剂量的1/4～1/3麻醉)，腹主动脉放血实施安乐死。

2.结果

2.1大白鼠肺脏纤维化的动物模型的建立

造模动物均观察到了重度的纤维化伴炎细胞浸润，显微镜下观察到纤维化病变。这表明成功建立了大白鼠肺脏纤维化的动物模型。

2.2病理学检测：

肺组织纤维化病变程度如图5和表1所示，人间充质干细胞对肺部、心在和肝脏的影响分别如图9、10和11所示。

表1组织病理学

+表示轻微

++表示轻度

+++表示中度

++++表示重度

大鼠左肺HE染色分析：移植人脐带间质干细胞，能修复肺纤维化病鼠左肺的肺泡结构。大鼠左肺切片，以HE染色，分别由低倍逐渐放大左肺中央区域、或左肺外围区域，HE染色分析如图9所示。其中，图9a显示了模型对照组，1号动物，细胞保存液，肺脏中度出血，HE染色，100×；图9b显示了单次给药低剂量组，8 号动物，人脐带间充质干细胞注射液，肺脏重度纤维化，HE染色，100×；图9c 显示了单次给药高剂量组，15号动物，人脐带间充质干细胞注射液，肺脏重度纤维化，HE染色，100×；图9d显示了两次给药低剂量组，22号动物，人脐带间充质干细胞注射液，肺脏中度纤维化，HE染色，100×；图9e显示了两次给药高剂量组，29号动物，人脐带间充质干细胞注射液，肺脏中度纤维化，HE染色，100 ×。

结果显示，给予BLM伤害后，左肺中央区域出现大量细胞浸润情形。移植高剂量的人类脐带间质干细胞能改善左肺中央，细胞浸润的现象，同时，中央区域也出现肺泡的构造。显示移植高剂量人间质干细胞能明显有效减少左肺发炎细胞浸润的面积，减少纤维细胞数量和肺泡数量。

人间充质干细胞移植对大鼠心脏的影响如图10所示，其中，图10a显示了模型对照组，1号动物，细胞保存液，心脏未见明显异常改变，HE染色，100×；图 10b显示了单次给药低剂量组，8号动物，人脐带间充质干细胞注射液，心脏未见明显异常改变，HE染色，100×；图10c显示了单次给药高剂量组，15号动物，人脐带间充质干细胞注射液，心脏未见明显异常改变，HE染色，100×；图10d显示了两次给药低剂量组，22号动物，人脐带间充质干细胞注射液，心脏未见明显异常改变，HE染色，100×；图10e显示了两次给药高剂量组，29号动物，人脐带间充质干细胞注射液，心脏未见明显异常改变，HE染色，100×。

因此，无论是低剂量组还是高剂量组，干细胞移植对心脏未见明显显色异常。

人间充质干细胞移植对大鼠肝脏的影响如图11所示，其中，图11a显示了模型对照组，1号动物，细胞保存液，心脏未见明显异常改变，HE染色，100×；图 11b显示了单次给药低剂量组，8号动物，人脐带间充质干细胞注射液，肝脏未见明显异常改变，HE染色，100×；图11c显示了单次给药高剂量组，15号动物，人脐带间充质干细胞注射液，肝脏未见明显异常改变，HE染色，100×；图11d显示了两次给药低剂量组，22号动物，人脐带间充质干细胞注射液，肝脏轻微泡沫细胞聚集，HE染色，100×；图11e显示了两次给药高剂量组，29号动物，人脐带间充质干细胞注射液，肝脏未见明显异常改变，HE染色，100×。

因此，无论是低剂量组还是高剂量组，干细胞移植对肝脏未见明显显色异常。

纤维化程度的结果如表1和图5所示：

在模型对照组(第1组)中，7只大鼠均为重度纤维化(总评分为7×3＝21分)；

在低剂量单次给药组(第2组)中，2只大鼠重度纤维化，5只为中度纤维化(总评分为2×3+5×2＝16分)；

在高剂量单次给药组(第3组)中，2只大鼠重度纤维化，3只为中度纤维化， 2只为轻度纤维化(总评分为2×3+3×2+2×1＝14分)；

在低剂量二次给药组(第4组)中，3只大鼠重度纤维化，4只为中度纤维化(总评分为3×3+4×2＝15分)；

在高剂量二次给药组(第5组)中，2只大鼠重度纤维化，4只为中度纤维化， 1只为轻度纤维化(总评分为2×3+4×2+1×1＝15分)。

结果表明，单次或双次给予间充质干细胞(第2～5组)，具可显著改善肺部纤维化。尤其是单次给予高剂量组就有2只大鼠转为轻度纤维化(2/7≈30％)。且存在剂量相关性。

此外，在高剂量给药组(第3组和第5组)中,改善效果更为明显，均出现了从重度转为轻度纤维化的大鼠。

此外，泡沫细胞聚集、和矿物质沉着的检测结果(表1)，也显示通过无创的内滴方式单次或双次给予间充质干细胞(第2～5组)，均可改善肺纤维化。

2.3存活率检测：

如图6所示，试验结束时，模型对照组、单次给药低剂量组、单次给药高剂量组、两次给药低剂量组、两次给药高剂量组的存活率分别为85.7％、85.7％、100％、 100％、100％。与模型对照组比较，单次给药高剂量组、两次给药低剂量组、两次给药高剂量组的存活率提高。

此外，试验结束时，模型对照组、单次给药低剂量组分别有1(D21)、1(D25) 只动物发现死亡，通过肺组织病理学观察，认为动物的死亡原因是肺脏的纤维化病变。

上述结果表明，单次或双次给予间充质干细胞(第2～5组)，可降低因肺部纤维化导致的死亡率，尤其是高剂量组(第3组和第5组)或两次给药低剂量组(第4 组)中，均无大鼠死亡。

2.4肺功能检测：

如图4所示，与模型对照组比较，单次给药低剂量组、单次给药高剂量组、两次给药低剂量组、两次给药高剂量组的用力肺活量(FVC，mL)、肺顺应性(Cdyn，mL/cm H

2.5脏体比：

如图7所示，与模型对照组同期指标比较，单次给药低剂量组、单次给药高剂量组、两次给药低剂量组、两次给药高剂量组的肺脏体比指标均值有降低，且同期中具有微弱的剂量关系；肝脏体比和心脏体比指标未见明显改变。

2.6生理指标：

如图8所示，各组动物于造模后，动物精神状态均欠佳，模型对照组动物持续时间稍长一些。随着试验周期的延长，各组动物平均体重均平稳增加，认为试验期间整体动物健康状况良好。

讨论

在本实施例中，在各组动物肺脏均观察到了纤维化伴炎细胞浸润和泡沫细胞聚集。心脏和肝脏未观察到供试品相关的病变。

肺脏纤维化在模型对照组动物的病变程度最严重，单次给药低剂量组和高剂量组动物的病变程度出现缓解，并且存在一定的剂量关系。

两次给药低剂量组和高剂量组动物的病变程度相对于模型对照组存在一定的缓解，并且也存在微弱的剂量关系。

单次给药组动物由于在病程进展早期(D21)进行药物干预，相比病程进展到中晚期(D28)进行药物干预的两次给药组动物的肺纤维化程度略轻。

无论对于肺纤维化的早期还是中晚期进行干细胞干预，单次给药组和两次给药组相对于模型对照组存在较为明显的缓解作用。

综上，通过无创的内滴方式给予间充质干细胞，可改善肺部纤维化。

实施例2无创的内滴方式中细胞药物的分布

2.1.气道内滴给药

大鼠气道内滴给药方法：将动物麻醉后固定于呈45度放置的固定器上，使用眼科镊拉出舌头，配合使用小动物麻醉咽喉镜压住动物舌根部，暴露声门，将抽取适量药物注射器雾化针头(钝性)轻柔插入气管内约1.5cm左右深度，然后推动注射器，将药液经过气道送入肺脏，快速拔出针头，取下固定器上的动物，头部朝上，左右旋转约1min，使药物尽可能的分布于各个肺叶。

在预定的时间点，对动物进行PET/CT扫描，评估细胞在肺部的分布情况。

2.2结果

人间充质干细胞对大鼠气道内滴注博来霉素致左肺纤维化大鼠肺脏病变的影响如图3所示。结果显示，低剂量组和高剂量组的左肺明显比模型组体积大，说明干细胞对博来霉素造成的左肺肺纤维化有改善，使得原本萎缩的左肺体积有所恢复。

肺纤维化SD大鼠单次气道内滴给予2.0×10

结果显示，肺纤维化SD大鼠气道内滴给予

上述结果表明，通过无创的气道内滴方式,可使细胞药物(或其成分)长时间停留或保留在肺部，甚至7天(168h)以后，仍有相当数量的药物(或其成分)停留或保留在肺部。与此相反，在心脏和肝脏等其他脏器中，药物成分极少。这提示，无创的气道内滴方式是更为有效的给予MSC的方式。

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