一种肾靶向载药外泌体及应用和治疗肾脏疾病药物

摘要

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种肾靶向载药外泌体及应用和治疗肾脏疾病药物，所述肾靶向载药外泌体由用于治疗肾脏疾病的药物导入到具有肾脏组织靶向性的外泌体中获得，所述具有肾脏组织靶向性的外泌体来源于膀胱细胞。本发明使用膀胱细胞分泌的外泌体不需要作任何修饰就可以在肾脏富集，用膀胱细胞分泌的外泌体，解决了外泌体产量的问题，具有很好的应用前景；而且用膀胱细胞分泌的外泌体可以装载不同药物或活性分子，通过靶向肾组织给药，提高肾脏疾病的治疗效果，降低药物毒副反应。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种肾靶向载药外泌体及应用和治疗肾脏疾病药物。

背景技术

肾脏病是一种严重危害人类健康常见病的统称，主要包括不同类型的肾炎、急性肾衰竭、肾结石、肾囊肿等等。肾脏肿瘤在人体泌尿男生殖系统肿瘤是常见者之一，肾细胞癌的总体治疗原则是，对于未发生转移的早期，或者只是局部进展的患者进行手术治疗，对于晚期的转移性肾癌没有手术机会，应该采用以内科为主的综合治疗。内科治疗方面，采用肾细胞癌的靶向治疗方法，使得总生存期等都获得了较大的延长。

目前FDA已批准9种靶向治疗药物用于晚期肾细胞癌，分别是：舒尼替尼、替西罗莫司、帕唑帕尼、阿西替尼、索拉非尼、卡博替尼、依维莫司、乐伐替尼和贝伐珠单抗。靶向治疗是晚期肾透明细胞癌的标准治疗方案，通过多种靶向药物轮换使用，患者的中位疾病控制时间可达到30个月左右。治疗用的靶向药物主要是通过VHL/HIF/VEGF和PI3K/AKT/mTOR两种信号通路发挥作用。肾癌的靶向药物就是两类，一种是抗血管生成的酪氨酸激酶抑制剂，还有一种是mTOR抑制剂，治疗的序贯其实就是这两类药物的轮换。大量的研究证明miR-1271的表达下降与肾癌密切相关，miR-1271可以通过抑制mTOR信号通路，抑制肾癌细胞的增殖和转移。

虽然肾癌靶向制剂近年来有了一定的发展，但由于其是针对信号通路发挥治疗作用，对正常细胞和组织也存在较强的毒副作用。对肾癌以及其它肾脏相关疾病的治疗的靶向性不佳。外泌体作为载药体系，由于其具备良好的生物相容性，生物可降解性，低毒性，稳定性以及低免疫原性，可以装载药物并递送到相邻或者远处的细胞。

因此，制备一种高效的肾靶向外泌体载药体系对肾组织相关疾病进行治疗是亟需的。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种肾靶向载药外泌体及应用和治疗肾脏疾病药物。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

提供一种肾靶向载药外泌体，所述肾靶向载药外泌体由用于治疗肾脏疾病的药物导入到具有肾脏组织靶向性的外泌体中获得，所述具有肾脏组织靶向性的外泌体来源于膀胱细胞。

当然，膀胱细胞也可以进行基因修饰或改造以使其对肾组织具有靶向性，包括但不限于基因改造，基因修饰、基因过表达或删除、分子修饰等；膀胱细胞的外泌体也可以进行表面修饰或改造以使其对肾组织具有靶向性，包括但不限于表面蛋白修饰、表面蛋白改造、表面小分子修饰等。

优选的，所述膀胱细胞包括但不限于人膀胱细胞、动物膀胱细胞、人膀胱癌细胞、动物膀胱癌细胞、诱导多能干细胞诱导的膀胱细胞。

优选的，所述动物膀胱细胞和动物膀胱癌细胞中的动物包括但不限于猴、小鼠、大鼠、仓鼠；人膀胱细胞包括但不限于正常人膀胱细胞、人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1、人膀胱上皮细胞HCV-29、人胚胎膀胱组织来源细胞CCC-HB-2；人膀胱癌细胞包括但不限于人膀胱鳞癌细胞 SCaBER、人膀胱移行细胞癌细胞 T24、人膀胱移行细胞乳头瘤细胞RT4、人膀胱移行细胞癌SW780、人膀胱癌细胞BIU-87、人膀胱癌细胞H/RB-CL2。

优选的，所述用于治疗肾脏疾病的药物包括但不限于siRNA、microRNA、蛋白、抗体、舒尼替尼、替西罗莫司、帕唑帕尼、阿西替尼、索拉非尼、卡博替尼、依维莫司、乐伐替尼和贝伐珠单抗。

用于治疗肾脏疾病的药物导入到具有肾脏组织靶向性的外泌体的步骤为：

将用于治疗肾脏疾病的药物和具有肾组织靶向性的外泌体放入电转杯中；

采用指数波或方形波，使用50-300V电压对用于治疗肾脏疾病的药物和具有肾组织靶向性的外泌体进行电转；

将电转产物水浴加热后，在离心力下离心去除游离的药物，得到纯化后肾靶向载药外泌体。

本发明的第二个目的是要提供上述的肾靶向载药外泌体在治疗肾脏疾病药物制备中的应用。

本发明的第三个目的是要提供一种治疗肾脏疾病药物，包含上述任一所述的肾靶向载药外泌体。

本发明的有益效果为：

本发明实施例提供了一种肾靶向载药外泌体及应用和治疗肾脏疾病药物，本发明中的肾靶向载药外泌体不需要作任何修饰就可以在肾脏富集，用膀胱细胞分泌的外泌体，解决了外泌体产量的问题，具有很好的应用前景；而且用膀胱细胞分泌的外泌体可以装载不同药物或活性分子，通过靶向肾组织给药，提高肾脏疾病的治疗效果，降低药物毒副反应。

附图说明

图1为人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1分泌的外泌体标志性蛋白检测图。

图2为人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1分泌的外泌体粒径分布检测图。

图3为PKH67标记人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1分泌的外泌体在不同组织中分布图。

图4为载有用于治疗肾脏疾病的药物microRNA-1271 mimic的肾靶向外泌体抗肿瘤活性体外检测图。

图5为载有用于治疗肾脏疾病的药物microRNA-1271 mimic的肾靶向外泌体抗肿瘤活性体内检测图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明实施例，并不用于限定本发明实施例。

实施例1

所述肾靶向载药外泌体由用于治疗肾脏疾病的药物导入到具有肾组织靶向性的外泌体中获得，所述具有肾组织靶向性的外泌体来源于膀胱细胞。

收集人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1，（本实施例以人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1为例）。SV-HUC-1细胞培养液为无外泌体血清和DMEM培养基进行培养；在2000g离心力下离心10min，取上清液；再在10000g离心力下离心30min，取上清液，弃去细胞碎片及沉淀物；将离心后的细胞培养液在100000g离心力下离心2 h，沉淀用无菌PBS重悬收集，在4℃温度环境中短期保存，即得肾靶向外泌体；提取分离所得的肾靶向外泌体表面标记蛋白及粒径分布如图1、图2所示；对SV-HUC-1分泌的外泌体表达量进行测定，BCA法检测膀胱细胞分泌的外泌体蛋白浓度为（3.02μg/μL）；

实施例2

取SV-HUC-1细胞分泌的外泌体，用PKH67染色，对SV-HUC-1细胞分泌的外泌体在体内的分布进行示踪，具体步骤如下：

取100μg的SV-HUC-1细胞分泌的外泌体，与1μL PKH67在4℃温度环境中避光孵育过夜，在100000g离心力下离心2 h，弃掉上清，用PBS清洗两次后，无菌PBS重悬SV-HUC-1细胞分泌的外泌体，经尾静脉注射入C57bl/6小鼠体内（本实施例中，选用的雄性C57bl/6（4-6周）小鼠购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，所有小鼠均培育于SPF级设施）；24h后，麻醉小鼠，取小鼠的心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏、胃和肠做冰冻切片，Hoechst33342染细胞核后，观察SV-HUC-1细胞分泌的外泌体在小鼠各个器官的生物分布；结果显示：本实施例的膀胱细胞分泌的外泌体在肾脏组织中出现明显富集（图3），靶向效率可高达65%-90%，说明本实施例制备的肾靶向外泌体具有肾组织靶向性；

实施例3

本实施例中，选用用于治疗肾癌疾病的药物microRNA 1271 mimic。

本实施例是将用于治疗肾脏疾病的药物导入到肾靶向外泌体制备肾脏肿瘤靶向治疗药物，具体操作如下：

步骤1：取150μg肾靶向外泌体与microRNA 1271 mimic混合，电转缓冲液可以为（PBS、DMEM、Cytomix、Tris-HCl）将其补足至150μL，转移至不同规格（0.2cm、0.4cm）电转杯中。采用不同波形（指数波、方形波），使用不同的电压（50V，100V，200V，300V）分别对肾靶向外泌体及microRNA 1271 mimic进行电转；

步骤2：将电转产物于100000g离心力下超速离心120 min，收集上清测载药量。

结果：对于microRNA 1271 mimic，150μg肾靶向外泌体与microRNA 1271 mimic在250V的电压下进行电转，效率最高，可达24.9%。结果显示：microRNA 1271 mimic成功载入了SV-HUC-1细胞分泌的外泌体中；

实施例4

本实施例进一步验证体内外实验检测载有用于治疗肾脏疾病的药物microRNA1271 mimic载入肾靶向外泌体对肾癌的治疗作用。

具体步骤如下：

体外实验：

将肾癌细胞ACHN铺于96孔板中，每孔5×10

体内实验：

在体内实验中，建立肾癌模型，将4×10

在体内实验中，如图5所示，载有肾肿瘤治疗药物microRNA 1271 mimic的肾靶向外泌体（microRNA 1271 mimic-外泌体），较等剂量的游离抗肿瘤药物组（microRNA 1271mimic）可显著降低小鼠的肿瘤大小。

对于本领域技术人员而言，显然本发明实施例不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明实施例的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明实施例。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明实施例的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明实施例内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。